实验名称:蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质-燃料结合的原理。考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm,且其光吸收值与蛋白质含量(10~100μg/ml蛋白质浓度)成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。
【实验准备】
一、材料
(1)血清
二、试剂
(1)考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000ml。
(2)标准蛋白质溶液:结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。
(3)0.9% NaCl溶液。
三、器材
(1)试管和试管架
(2)722型分光光度计
(3)吸量管
(4)移液枪
【实验步骤】
一、制作标准曲线
取6支干燥洁净的试管,编号按下表加入试剂
各管混匀后,静置3min,以0号管为空白管调零,在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值(A595值)。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘出标准曲线。
二、血清蛋白质浓度测定
测定方法同上。1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂,血清用0.9%NaCl稀释200倍,使其测定值在标准曲线的直线范围内。用上述0号管调零,测出血清的A595值。
【实验结果】
(1) 测定数据如下表
以吸光度A595值为纵坐标,牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标绘制标准曲线。
(2)根据所测血清的值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,乘以稀释倍数,从而计算出血清的蛋白质浓度(mg/ml)
0.26 mg/ml
【实验讨论】
① 必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
② 测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。
③ 不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混,以免造成实验结果的改变。
④ 考马斯亮蓝(CBB)显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差.通过研究显色液组分对线性关系的影响,发现显色液H+浓度是影响线性关系的主要因素【1】。
⑤ 考马斯亮法可排除添加非蛋白含氮物对奶粉真蛋白含量测定的影响,可以快速、准确的测定奶粉真蛋白含量【2】。
【参考文献】
1. 郭敏亮;姜涌明,生物化学与生物物理进展,1996(06)
2. 董娜; 贾艳菊; 张晓; 齐志广,食品科技,2011(11)
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法
[实验目的]
学习、掌握考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量的方法
[实验原理]
[器材与试剂]
器材
722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支
试剂
1.标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白(BSA),配制成1.00mg/ml。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂:称100mg考马斯亮蓝,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85% 的磷酸,用水稀释至1升。
[实验方法]
标准方法
1.取10支试管,分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白(或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min后,使用722分光光度计,塑料比色皿,在595nm处测量吸光度A595。
3.用标准蛋白浓度(mg/ml)为横坐标,用A595为纵坐标,进行直线拟合,得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595,代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:
样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =
以蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。计算出回归方程。如Y=aX+b
让后把待测样品的吸光值代入回归方程,算出待测样品浓度
SDS干扰实验
1.取5支试管,分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min后,使用753分光光度计,塑料比色皿,在595nm处测量吸光度A595。
[实验数据与结果分析]
(一)标准方法的数据和图
表1 考马斯亮蓝标准法实验表格
根据表1,以A595为纵坐标,标准蛋白质量/(μg)为横坐标,作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法
根据线性拟合公式y=ax+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
(二)SDS干扰数据和图
表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格
根据表2,以A595为纵坐标,SDS浓度为横坐标,作图2。
图2 考马斯亮蓝SDS干扰实验
理论上,十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰,随着SDS浓度的增加,其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低,而后有一小段回升,最后趋于渐近线。
[结论]:
1. 考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。
2. 干扰考马斯亮蓝方法的物质中,SDS的干扰分析情况。
[干扰实验结果分析]:
当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加,吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机理来看,SDS可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS 的存在,阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合,使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合,使得显色减弱,吸光度值降低,因此在曲线前段呈下降趋势;但由于SDS破坏氢键,使得蛋白质的空间结构更加伸展,一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来,所以会有少量的吸光度回升;但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时,过量的SDS就不起作用了,曲线是最后为平缓段。
要去除SDS的干扰,可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。
[思考与讨论]
1.用考马斯亮蓝法G-250测定蛋白质含量有何特点,操作过程中应注意什么?
答:Bradford 法的优点是(1)灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。(2)测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右,颜色在5min至20min之间稳定性也很好。(3)干扰物质相对其它方法少。缺点是(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。(2)仍有些物质干扰此法测定:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1mol/L的NaOH。(3)标准曲线也有轻微的非线性。 操作注意事项:不可使用石英比色皿,可用塑料或者玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。
2.考马斯亮蓝G-250和R-250各有何特点,在电泳染色方面有何异同?
答:考马斯亮蓝G-250和R-250的结构式不同,配方不同,染色方法也适合于不同性质的蛋白。考马斯亮蓝R-250即三苯基甲烷。每个分子含有两个-SO3H,偏酸性,与蛋白质的碱性集团结合。在一定pH时,染料—蛋白复合物可以被完全解聚。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15-20μg),扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。通常用先固定,再进行染色和脱色的方法。考马斯亮蓝G-250即二甲花青亮蓝,其染色方法经常是对蛋白质同时进行固定和染色。这种方法的特点是快而简便,有时甚至不需脱色。但灵敏度略逊于R-250。同时考马斯亮蓝G-250对小肽染色效果很好。
3.试述几种主要干扰物质对考马斯亮蓝G-250蛋白测定法测定结果的影响及其作用机理。
答:SDS的存在会使相同条件下的吸光度值减小,其作用机理为:断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS与染料分子与蛋白质的竞争结合,会使显色减弱,所以吸光度值减小。
Tris,乙酸,2-巯基乙醇,蔗糖,甘油,EDTA及微量的去污剂如TritonX-100,玻璃去污剂有少量颜色干扰,用适当的缓冲液对照很容易除掉。
4.说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量,哪几种只能测定其相对含量,为什么?
答:严格地讲,只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量,因为每6.25蛋白质含1g氮,所以,通过氮含量的测定,可以得到蛋白质的绝对含量。其他的几种方法,由于都使用了标准蛋白制作标准曲线,所以,所测得的未知蛋白的含量,都是相对于标准蛋白含量而言的。
参考资料:
[1] 王德利等.食品中蛋白质的快速消化简便测定法.黑龙江八一农垦大学学报. 15(4):80~82
[2]余冰宾.生物化学实验指导.清华大学出版社.2004
[3] 南亚,李宏高.考马斯亮蓝G-250法快速测定牛乳中的蛋白质.检测与分析.2007.10(12):42~42
[4]黄婉玉等.考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量.食品与发酵工业.2009.35(5) :160~163
[5] 郭敏亮,姜涌明.考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的影响. 生物化学与生物物理进展.1996.23(6) :558~561
[6]中国知网 http://www.cnki.net/
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