实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验 实验名称：蛋白质的定量测定（五）——考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

【实验目的】

掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】

考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。

【试剂与器材】

试剂：

考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，用蒸馏水稀释到1000ml。

标准蛋白质溶液：结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量，然后根据该蛋白的纯度用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。

器材：

试管和试管架

722型分光光度计

吸量管

移液枪

【实验步骤】

一、 制作标准曲线

各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A595）. 以A595值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

二、 待测蛋白质浓度测定

测定方法同上，1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂，。用上述0号管调零，测出血清的A595值。

【实验结果】

由仪器测量可得A595=0.179，可得标准蛋白质溶液为0.0790mg/ml.

【注意事项】

必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附在比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯清洗干净。

【思考与讨论】

一、考马斯亮兰法的突出优点是：

（1）因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+、离子Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

二、此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

三、试验时应当注意分光光度计、吸量管、移液枪的正确使用。

 

第二篇：考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

摘要 

本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH值、外源添加物对果肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PVP和EDTA以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP)。

前言  

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content)是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。以比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度时，可溶性蛋白的测定也是必不可少的。

1实验部分

1.1实验原理

比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制剂纯度，同时采用考马斯亮蓝法测定蛋白质相结合，得到标准曲线。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。该方法标本用量少、灵敏度高、重复性好，是一种较为理想的方法^[7]。但该方法线性范围窄，需要选择适宜的提取缓冲液及缓冲液浓度、pH值、料液比和外源添加物等，以使测定方法有较高的灵敏度，测定值与真值相近。

1.2实验准备

1.2.1实验材料

新鲜苹果、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G-250、乙醇、85%磷酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl₂ 、抗坏血酸、半胱氨酸、β-巯基乙醇。

1.2.2仪器与设备

容量瓶（25mL 10个、100mL 1个、500mL 1个、棕色瓶 1个、分析天平、胶头滴管、烧杯（50mL 2个）、移液管（20mL）、量筒（10mL 1个 、25mL 1个）、研钵；

UV-1800型紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；旋涡混合器；PH计。

1.2.3试剂配制

1.2.3.1标准蛋白质溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：称取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL；

1.2.3.2考马斯亮蓝试剂：称取50mg考马斯亮蓝G-250，溶于25mL 90%乙醇中，加入50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸馏水定容到500mL，摇匀，贮于棕色瓶中；

1.2.3.3提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl缓冲液(100mmol/L)；

1.2.3.4梯度浓度Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L；

1.2.3.5外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl₂(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、

半胱氨酸(2mmol/L)、β-巯基乙醇(2%，V/V)。

1.3实验步骤

1.3.1考马斯亮蓝G-250溶液及其蛋白反应液全波长扫描

取3mL配制好的考马斯亮蓝G-250溶液或其与蛋白反应液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度计在400～800nm范围内进行扫描，确定考马斯亮蓝G-250溶液和其蛋白反应液的最大吸收峰和空白吸收值。

1.3.2 标准曲线的绘制

取6支试管，按表1加入标准蛋白质溶液和蒸馏水，混匀后，向各管中加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液。每加完一支试管，立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。混合后静置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求得线性回归方程

表 1 绘制标准曲线的各试剂添加量

1.3.3 果蔬组织可溶性蛋白质的提取

1.3.3.1最佳缓冲溶液和pH值的确定

称取苹果果肉样品1g，加入5mL水或梯度pH值Tris-HCl缓冲液，冰浴上充分研磨匀浆，移入10mL离心管中，于4000rpm离心15min，收集上清液即为可溶性蛋白质提取液，低温保存备用^[8]。

1.3.3.2 最佳提取缓冲液浓度的确定

    以3.3.1 节确定的提取缓冲盐和pH值为基准，分别配制该pH值下浓度依次为0、10、30、50、80、100mmol/L的提取缓冲液^[9]。提取体系及方法同3.1节。

1.3.3.3 适宜外源添加物的确定

    以3.3.2节确定的最佳缓冲溶液为基准，分别添加以下浓度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl₂(0.5mmol/L)、抗坏血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巯基乙醇(2%，V/V)。提取体系及方法同3.1节^[7-13]。（添加组合为：抗坏血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巯基乙醇、NaCl、MgCl₂、PVP＋β-巯基乙醇、PVP＋EDTA、EDTA＋PVP＋β-巯基乙醇）

1.3.3.4苹果组织可溶性蛋白质含量的测定

    吸取1.0mL样品上清液，放入试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置5min后在波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度。重复3次。

1.3.3.5 数据处理

    Excel 统计分析所有数据，计算标准误差并制图。

4.实验基本路线

                   

1.4实验结果

2结果与讨论

致谢

参考文献