实验八 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

一 实验目的

学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

二 实验原理

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

三 实验器材

（1）旋涡混合器。

（2）试管1.5cm×15cm（×8）

（3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。

（4）722型（或7220型）分光光度计。

（5）容量瓶1000ml（×1）。

（6）量筒100ml（×1）。

（7）电子分析天平。

四 实验试剂

1、9％NaCL溶液。

2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。

3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。

4、样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。

五 实验方法

（一）标准曲线的制备

1、取7支干净试管，按表15进行编号并加入试剂。

2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。

表15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备

（二）样品的测定

另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

注意

样品蛋白质含量应在10-100ug为宜。一些阳离子如K⁺ 、Na⁺、Mg⁺、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。

六 注意事项

1．研究表明，NaCl、KCl、MgCl₂、(NH₄)SO₄、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA有少量干扰，可很容易地通过用适当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显色2min-1h内完成；如果测定很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定吸光度，因为在这段时间内颜色最稳定。

2．测定那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料结合量是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

3．待测溶液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100-800ug/ml为宜。

七思考题

1．  Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？

2． 为什么标准蛋白必须用凯氏定氮法测定纯度？

 

第二篇：考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

专业班级：制药工程 3班小组成员：李梦娴李敏林晓丝

一、实验目的

   1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理

   2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤

二、实验原理

   1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。

    2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。

三、仪器与试剂       

1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100ml×2、50ml×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。  

 2、试剂：

     （1）蒸馏水。

     （2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。

     （3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。

      （4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。

四、操作步骤

    1、0~100μg/ml标准曲线的制作：

取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。以标准蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

   2、样品中蛋白质含量测定

   另取两支干净的试管（做一重复），标号A、B。分别加入1ml待测样品液体和5ml考马斯亮蓝染液，将两支试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

五、数据处理

   1、将测得的吸光度填入上表中，并根据数值作出标准曲线。

   2、计算公式：样品中的蛋白质含量（μg/g鲜重）={[查得的蛋白质含量（μg）] ×稀释倍数}/ [样品鲜重（g）]

六、注意事项

   1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

   2、测定中，蛋白-染料复合物会有少量吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色）。可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95% 的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

   3、若选择在漩涡器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难以消除。

七、思考与讨论

1、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将个试管中溶液纵向倒转混合？

答：因为可以使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有很大的偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。

2、列举几种常用的蛋白质定量测定的方法，并于考马斯亮蓝染色法相比较各有何优缺点。

答：1.目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

2.考马斯亮兰法的突出优点是：

      （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

      （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

      （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K⁺、Na⁺、Mg²⁺离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

      此法的缺点是：

     （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

     （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

     （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。