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氧化还原与电化学

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第二篇:氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库 120900字

青岛科技大学

硕士学位论文

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学 姓名:李小青

申请学位级别:硕士

专业:分析化学

指导教师:孙伟

20090608

青岛科技大学研究生学位论文

氧化还原蛋白质在离子液体屋内米材料复合体系中的直接电

化学

摘要

本论文主要研究目的在于构造和发展性能优良的以直接电化学为基础的第

三代生物传感器。血红素蛋白质是一种氧化还原蛋白质,研究其直接电化学对于 研究生命体内的电子转移过程,了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检 测方法等方面具有非常实际的意义。纳米粒子由于其独特的光学、电学、催化等 性质,在修饰电极上的应用研究已经引起人们极大的关注。近年来,室温离子液 体逐渐成为研究的热点。本论文主要开展了以下几个方面的研究工作:

1.制备了3种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体1.丁基.3.甲基咪唑 六氟磷酸盐(BMIMPF6)、六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)和1.乙基一3.甲基咪唑四氟 硼酸盐(EMIMBF4)等为粘合剂和修饰剂,与石墨粉相混合制备了新型的离子液体 修饰碳糊电极(CILE)。’

2.开展了血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(m)在CILE上的直接电化学行为研究。分

别以上述3种CILE为基底电极,以Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米 管(SWCNTs)、聚乙烯醇(PVA)、纳米Ti02、壳聚糖(CTS)等为修饰材料,采用 层层涂布法、直接混合法等固定方法,将Hb和Mb固定到不同电极的表面制备了

不同类型蛋白质电化学生物传感器,如De/Hb/CILE、CTS/nano.Ti02/Hb/CILE、 Nafion/Hb/SWCNTs/CILE、PVA/Hb/MWCNTs/CILE、Nafion/Mb/MWCNTs/CILE、 Nation.BMIMPF6/Hb/CILE。考察了Hb和Mb在不同修饰膜电极上的直接电化学和 电催化行为。采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外 光谱和多种电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。实验结果表明,Hb 和Mb在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性,循环伏安扫描出现一对准可逆的 氧化还原峰,并且在修饰电极上lib和Mb的电子传递能力明显增强,纳米粒子和 离子液体的存在提供了一个合适的微环境,对电化学行为有极大的促进作用,对 Hb和Mb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数。解释了电化 学行为的机理,进一步研究了该修饰电极对H202、三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠 (NAN02)等小分子的电催化性质,实验结果表明所制备的胁和Mb修饰电极表现出 良好的电催化性能,求解了相应的表观米氏常数(KMapp)。

3.开展了lib在纳米Ti02中的直接电化学行为研究。以BPPF6修饰的碳糊电极

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

为基底电极,采用静电吸附的方法将Hb固定到电极表面上,制备了Hb修饰电极

(nano—Ti02/Hb/CILE)。考察了Hb在电极上的直接电化学和电催化行为。实验结果 表明,Hb在nano.Ti02膜内能够保持其原始构象,循环伏安扫描出现一对准可逆的 氧化还原峰。对Hb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数。 关键词:氧化还原蛋白质,室温离子液体,直接电化学,电催化,碳糊电极, 生物传感器,纳米粒子

II

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DIRECT ELECTROCHEMISTRY OF REDOX PROTEINS

IN IONIC LIQUID AND NANOPARTICLES MATERIAL

COMPOSITE FILMS

AB STRACT

In this dissertation,the third-generation electrochemical biosensors based on direct electron transfer betw.een the proteins and the underlying electrodes were fabricated and developed.Heme proteins are a kind of redox proteins.Studies on the direct electrochemistry of redox proteins can be used for the understanding of the mechanisms of electron transfer reactions and oxidation/reduction in life processe, which call also be proposed as a sensitive method for proteins determination.Due to

the unique optical,electrical and catalytic characters of nanoparicles,nanoparticles

have attracted much attention for their novel applications in the modified electrodes.

Room temperature ionic liquids(RTILs)have excellent physical and chemical properties.The main points of the thesis are summarized as follows:

1.Three room temperature ionic liquids(RTILs)modified carbon paste electrodes (CPE) were constructed based on the substitute of paraffin with

1-butyl-3-methylimidazolium hexatiuorophate(BMIMPF6), N-butylpyrifinium

hexafluorophosphate(BPPF6)or 1-ethyl?-3??methylimidazolium tetrafluoroborate (EMIMBF4)to mix with graphite power.

2.The direct electrochemistry of hemoglobin(wo)and myoglobin(Mb)on the carbon ionic liquid electrode(CILE)were carefully studied.Hb and Mb were

immobilized on the surface of CILE with Nation and polyvinyl alcohol(PVA)film or Nafion/MWCNTs film by step—by-step method.The characteristics of Hb and Mb in these modified films were investigated by scan electron microscopy,UV-Vis spectrum, FT.IR spectrum and electrochemical methods.The results showed that Hb and Mb in Ili

氧化还原蛋向质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

these films retained its native s咖cnlre.A pair of well,defined and quasi—reversible

cyclic voltammetric peaks appeared.Nanoparticles and room temperature ionic liuqids could provide a favorable microenvironrnent and enhance direct electron transfer rate.

The electrochemical behaviors of Hb and Mb in the modifled electrode were carefully investigated with the electrochemical parameters calculated.The Hb and Mb modifled electrode showed excellent electrocatalytic behaviors to the reduction of hydrogen peroxide(H202),trichloroacetic acid(TCA)and sodium nitrite(NaN02),The apparent Michaelis.Menten constants(KM8pp)ofthe sensors were calculated.

3.The direct electrochemistry of Hb with Ti02 nanoparticle was carefully studied on the carbon ionic liquid electrode(CILE),which was fabricated by using

N—butylpyridinium hexafluorophosphate(BPPF6).Hb was immobilized on the surface of CILE with Ti02 nanoparticle by adsorption method.The direct electrochemistry and electrocatalysis ofHb in modified film was investigated.The results showed that Hb in

the film retained its native structure.A pair of well.defined and quasi-reversible cyclic

voltammetric peaks appeared and the electrochemical parameters were furthur calculated.

KEY WORDS: redox proteins,room temperature ionic liquids,direct

elelctrochemistry,electrocatalysis,carbon ionic liquid electrode,biosensor, nanoparticles

W

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独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的

研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或 证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。

申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。

本人签名:套小南签字日期:刃呵年/月扩日

关于论文使用授权的说明

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,有权保留

并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或 使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单位仍然为青岛 科技大学。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)

本学位论文属于:

保密口,在年解密后适用于本声明。

不保密口。

本人签名:

导师签名:

考^j\禹

汐?唧

1

日期:幻口7年石月8-E1

日期:二秒口7年石月莎日

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帚第一早章义文献陬琢综怂述

1.1血红素蛋白质简介

氧化还原蛋白质是一类具有氧化还原性质的蛋白质,可以接受或给出电子,

在其氧化态和还原态之间转换。血红素蛋白质是一类含有血红素辅基的蛋白质。 血红素(heme)又叫铁卟啉,是由原卟啉(protoporphyrin)与铁(II)组成,又称铁一 原卟啉IX(Fe.protoporphyriniX),是一种以多种氧化态或还原态存在的分子,其 结构如图1-1所示【l】。血红素辅基通常都是血红素蛋白质电活性基团。血红素蛋 白质在电极上的直接电化学实质上就是其中的血红素辅基与电极间的电子转移

反应。常见的氧化还原蛋白质主要有:肌红蛋白(Mb)、血红蛋白(Hb)、辣根过

氧化物酶(HI心)、细胞色素C(Cyt C)等。

C

图1.1血红素的化学结构

Fig.1-1 Chemical s缸ucn∽of heme

1.1.1血红蛋白

血红蛋(Hemoglobin,Hb)是高等生物体内负责运载氧的一种氧化还原蛋

白质。分子量约为64,500,等电点为7.4【2】,分子尺寸为6.5x5.5x5.0 nm【3】。人 体内I-Ib是由四个亚基构成,分别为两个a和两个p亚基。Hb的每个亚基由一

条肽链和一个血红素分子构成,肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形,把血红

素分子围绕在里面,这条肽链盘绕成的球形结构称为珠蛋白。血红素分子中有

一个具有卟啉结构的小分子,在卟啉分子中心,由卟啉中四个吡咯环上大的氮

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

原子与一个亚铁离子配位结合,珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲 哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合,当Hb不与氧 结合的时候,有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合,而当Hb载氧 的时候,就由氧分子顶替水的位置。

1.1.2肌红蛋白

肌红蛋I兰t(Myoglobin, Mb)位于肌肉的肌细胞中,其功能主要是储氧和载 氧。Mb是由一条多肽链和一个血红素辅基构成的中等大小的单链蛋白质,其

分子量约17,800,等电点为6.8E41。Mb的多肽链由153个氨基酸残基组成,X 射线衍射研究表明,Mb中的多肽链70%是以0【螺旋形式存在的。链中的极性 的氨基酸残基几乎全部分布在分子表面,使Mb具有水溶性;而非极性的氨基 酸残基分布在分子的内部,使得内部成一个疏水空腔,血红素几乎整个包埋在 这个空穴中。血红素卟啉环中心的铁原子有6个配位键,其中4个键与卟啉环 上的N配位,形成一个平面,第5轴向配位键与肽链的组氨酸咪唑相联,第6 轴向配位键或者空着,或者结合氧。故Mb的重要生理功能之一是储存和运载 氧分子。

1.2蛋白质的直接电化学研究进展及研究意义

生命过程离不开电子传递,无论是能量转换,还是神经传导;无论是光合

作用,还是呼吸过程甚至是生命的起源、大脑的思维、基因的传递都与电子传 递密切相关。研究生命过程很重要的一个方面就是研究生物体内的电子传递过 程【5J。蛋白质是~类重要的生物大分子,研究氧化还原蛋白质在电极表面的电 子传输过程对于了解生命体内的物质代谢和能量转换、了解生物分子的结构和 各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新型第三 代生物传感器和生物燃料电池以及生物电子学等均具有重要意义。

由于多数蛋白质的分子量较大,结构复杂,其电活性基团或氧化还原中心

深埋在多肽链内部,与电极表面距离较远,因此,溶液中的氧化还原蛋白质与 电极直接交换电子非常困难,并且直接电子传输的机理也非常复杂,同时与蛋 白质在电极表面的构象和定位等很多因素有关,同时溶液中的大分子杂质在电 极表面的吸附和蛋白质本身的吸附变性也会阻碍蛋白质与电极间的直接电子转 移【61。

20世纪90年代以来,为了实现蛋白质和电极之间有效的直接电子传递, 人们进行了大量研究,一个比较有效的方式是将蛋白质通过薄膜修饰电极固定 2

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在电极表面,因此薄膜修饰电极为蛋白质的直接电化学研究提供了一个新的思 路。

1.2.1蛋白质的固定方法

为了研制价格低,灵敏度高,选择性好和寿命长的生物传感器,蛋白质固定

化技术显得非常重要。主要包括物理吸附法,共价键合法,化学交联法,包埋法, 夹心法等。现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下【7】。

1.2.1.1物理吸附法此法是通过蛋白质的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组 分吸附于不溶性的惰性载体上,常用的惰性载体如石墨粉、活性碳、分子筛等。 物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和,对生物活性影响小,缺点是蛋白 质与固体表面结合力比较弱,容易导致蛋白质的泄露或脱附,从而造成传感器的 稳定性和重现性差,而且蛋白质暴露在外,容易受温度、pH、离子强度等环境因 素的影响,因此使用寿命无法满足实际要求。

1.2.1.2共价键合法将蛋白质通过共价键与载体表面结合而固定的方法称为共价 键合法。该方法是将基体表面进行活化处理,然后与蛋白质偶联,从而使生物组 分结合到基体表面。该法的优点是通过形成共价键将蛋白质固定,相对比较稳定, 不易发生脱附。但是容易导致灵敏度降低或蛋白质失活,操作复杂,耗时,成本 高。

1.2.1.3化学交联法使用戊二醛等双功能团试剂,使蛋白质以共价键交联在固体 表面。该法的优点是蛋白质的固定比较牢固,不易脱落。其缺点是难以控制,形 成的蛋白质比较膨松,导致扩散阻力大,且需要的试剂量比较大,容易引起蛋白 质活性降低。

1.2.1.4包埋法包埋法将生物功能物质与生物高分子或者聚合物等溶剂混合而使 生物功能物质包埋于其中,经溶剂挥发后制成敏感膜的方法称为包埋法。常用的 聚合物如壳聚糖、琼脂糖等,由于包埋法优点较多,而且方法简单,操作简便, 因而在生物传感器的构造中得到了广泛应用。

1.2.1.5夹心法此法是将蛋白质封闭在双层滤膜或电极/滤膜之间,这种方法可以 为蛋白质分子提供一个相对封闭的微环境,对提高蛋白质分子的稳定性能发挥比 较积极的作用,这种方法主要用于蛋白质反应器和早期的传感器中。

3

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1.3蛋白质修饰电极的类型

利用薄膜修饰电极来研究氧化还原蛋白质,为蛋白质的直接电化学研究开

辟了新的方向【8’9】。这里被研究的蛋白质不是处于溶液相中,而是处于修饰电极 的表面的薄膜中。在薄膜所提供的不同于水溶液的独特而有利的微环境中,氧 化还原蛋白质往往可以与电极进行直接快速的电子交换,从而表现出良好的电 化学行为,避免了由于引入外界媒介体而给电极反应带来的复杂性与局限性。 同时,薄膜修饰电极中,蛋白质和酶的用量极微,这为蛋白质的直接电化学研 究提供了极大的便利。

按照薄膜材料不同,可将蛋白质薄膜电极分为双层类脂膜【8】,表面活性剂

薄膜[101,聚合物水凝胶薄膜㈣121,复合物薄膜【13】,天然高分子薄膜‘141,纳米粒 子薄膜【1 5】等不同类型。

按照对电极修饰方式不同,薄膜电极可以分为涂布型薄膜、溶胶一凝胶薄膜、 Langmuir?Blodgett(LB)膜、自组装膜(SAMs)、双层类脂膜(BLMs)、层层组装 (Layer—by-Layer Assembly)薄膜等。

1.4纳米材料及其在生物传感器中的应用

纳米材料可以广泛地应用于生物医药领域,如进行细胞分离、细胞染色等,

正是由于纳米材料具有上述一系列优异特性及广阔的应用前景,系统地研究和 开发新型纳米材料具有重要的实际意义,同时深入研究纳米材料的各种物性及 其微观结构的内在联系对于进一步促进低维固体物理的发展也具有深刻的理论 意义。要实现蛋白质和电极之间比较有效的直接电子传递,就要构造一个合适 的薄膜电极界面,因此构建膜的物质的选择非常重要,各种新型成膜材料和物 质也不断被应用于蛋白质薄膜电极的制备。由于本论文采用了纳米材料和室温 离子液体两类物质,因此将两种类型的材料及其在蛋白质的直接电化学和生物 传感器方面的应用进行简单的介绍。

1.4.1纳米材料简介

广义地讲,纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围

(1.100 nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料【16】。由于纳米结 构单元的尺度与物质中的许多特征长度,如电子的德布洛意波长、超导相干长 度、隧穿势垒厚度、铁磁性临界尺寸相当,从而导致纳米材料的物理、化学特 性既不同于微观的原子、分子,也不同于宏观物体,从而把人们探索自然、创 4

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造知识的能力延伸到介于宏观和微观物体之间的中间领域。

1.4.2纳米材料的特性

一般来说,纳米材料有以下几个特征【17】:

(1)小尺寸效应。当超微粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的 相干长度或透射深度等特征尺寸相当或更小时,周期性的边界条件将破坏声、 光、电磁、热力学等特性均会呈现新的效应IiPd,尺寸效应。这就是纳米粒子的 小尺寸效应(也称体积效应),是其它效应的基础,这种效应为纳米材料的具体 应用开拓了广阔的新领域。

(2)表面与界面效应。纳米微粒由于尺寸小,表面积大,表面能高,位于表面

的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状态,因此其活性极高, 极不稳定,遇见其它原子时很快结合,使其稳定化,这种活性就是表面效应。

(3)量子尺寸效应。当粒子尺寸下降到某一值时,金属费米能级附近的电子能 级由准连续变为离散能级的现象以及纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据 分子轨道和最低轨道能级而使能隙变宽现象均称为量子尺寸效应。

(4)介点限域效应。随着纳米晶粒粒径的不断减小和比表面积不断增加,其表 面状态的改变将会引起微粒性质的显著变化,从而导致它比裸露纳米材料的光 学性质发生了较大的变化,这就是介电限域效应。

(5)宏观量子隧道效应。当微观粒子的总能量小于势垒高度时,该粒子仍能穿 越这一势垒的能力,后来人们发现一些宏观量,如磁化强度、量子相干器件中 的磁通量等也具有隧道效应,称之为宏观量子隧道效应。

1.4.3纳米材料的分类

纳米微粒的特异效应,尤其是其小的尺寸和大的比表面积,使得纳米材料

具有与常规材料不同的物理的、化学的和电学的性质。纳米材料尺寸、结构和 性质的可控性为设计新颖的传感体系和提高生物分析装置的性能提供了极好的 前景。纳米材料种类繁多,在酶或蛋白质的直接电化学和生物传感器构造方面 用的比较多的纳米材料包括导电的纳米材料,如贵金属、碳材料和导电聚合物 和半导体纳米材料等,这些纳米材料,不论是纳米管、纳米线、纳米球还是多 孔的纳米材料,常常可以作为电极表面的修饰材料,提高对生物分子的固定量,

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

进而起到提高传感器性能的作用。下面就这几种纳米材料在酶或蛋白质的直接 电化学和生物传感器方面的应用作一简单的介绍。

(1)金属纳米材料

这类材料中用的比较多的主要是贵金属纳米粒子,如Pt,Pd,Au,Ag等,

因为其很好的导电性可以应用在生物传感器中,同时这些材料本身又有较宽的 电位窗口和很好的化学稳定性,所以对生物传感器的发展有着重要意义。Ding

等【l 8J以离子液体和Au纳米粒子作为修饰膜研究了0L一甲胎蛋白质的直接电化学 行为。Xu等【l 9J将Au纳米粒子和离子液体EMIMBF4混合涂布到热解石墨电极 表面上,然后将Cty C固定到该修饰电极的表面上,研究其直接电化学行为, 并且该修饰电极对02具有较好的电催化行为。

(2)碳材料

碳材料是生物传感装置中用的最普遍的一类材料,因为其极好的电子导电

性、化学和电化学稳定性以及机械强度等而在生物传感装置中具有不可替代的 地位,这类材料包括碳纳米管、碳纳米纤维、介孔碳微球等,其中碳纳米管有 单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)两种形式。Yang等【20】利用 C60来修饰MWCNTs,并用于Fib的固定,实验结果表明,c60修饰MWCNTs

更有助于提高Fib的电化学活性和稳定性,C60起到了电子媒介体的作用。Li等 瞄lJ报道了C够C在SWCNTs修饰的玻碳电极上的直接电化学及其对H202的电 催化行为。Zhou等【22】观察到过氧化氢酶在SWCNTs薄膜修饰的Au"电极上有一 对可逆的循环伏安峰,并研究了其对H202的电催化行为。

(3)半导体纳米材料

半导体纳米材料,由于其通常具有高的比表面积、非毒性、生物相容性和

光学透明性较好、化学和光化学稳定性高等优点而在生物分析领域吸引了越来 越多研究者的兴趣。Ju等怛副将肌红蛋白(Mb)固定到介孔硅纳米材料上实现了

Mb在电极表面的直接电化学。Li等【24】将肌红蛋白固定在Au/Ti02/GCE表面上, 研究了其电化学和对三氯乙酸具有较好的电催化行为。Luo等【25】研究了Hb、 Mb与Cyt C在纳米Ti02膜中的直接电化学行为,提出了这三种蛋白质能够表 现出较好的电化学行为的原因可能为:纳米Ti02具有较强的生物相容性、较大 的比表面积而且能够与蛋白质分子发生特殊的键合作用。Lu掣261采用多孔片状 的C0304纳米粒子和Nation将Hb固定到玻碳电极表面上,研究了直接电化学 行为,同时制备了一种新型的过氧化氢传感器,最低检测限为0.19mol/L。 6

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(4)纳米复合材料

纳米复合材料近年来的研究和应用越来越广泛,复合材料的种类也越来越

多,像无机.无机复合材料、无机.有机复合材料、有机一有机复合材料等。复合 材料最大的优势是能够利用两种材料各自的优点而带来单种材料所不具备的一

些性能,或者利用材料之间的协同作用达到意想不到的奇特效应,在酶和蛋白

质的直接电化学和生物传感器研究方面的应用越来越广。

1.4.4纳米材料在电化学生物传感器中的应用

目前纳米材料在电化学传感器中的应用主要有贵金属纳米材料、碳纳米管、

半导体纳米材料等。Gimen∥等【2刀发现在热解石墨电极上形成的Pd纳米岛能高效的 催化氢原子的吸附和脱附反应。董绍俊等【128,29】1报道纳米Pd单层膜修饰的玻碳电极 和HOPG电极都对肼的氧化呈现出较高的催化活性,可用于检测微量的甲肼化合

物。聚合物一纳米Pd多层膜修饰碳电极可以改善对肼类化合物氧化的催化响应, 也能催化氧的还原,该修饰多层膜相当稳定【301。经层层组装形成的纳米Pt/金属卟 啉多层膜修饰玻碳电极,对氧通过4e还原生成水,具有很高的催化活性和高稳定 性,可望用于燃料电池氧阴极材料的研制【311。碳纳米管(CNT)的发现为低维纳米 结构在电化学和生物传感方面的应用开辟了崭新的方向,CNT特殊的结构表现出

优异的催化性能。Lin等【32J用CNT伟IJ备了葡萄糖生物传感器,可以在对乙酞氨基 酚、尿酸和抗坏血酸共存下选择性检测葡萄糖。WaIlg等p3J制备了CNT纤维微电 极,对NADH、I-12,02和多巴胺都有很好的催化活性,他们将CNT和聚四氟乙烯混 合修饰电极,同样对NADH表现出强的电催化活性【341,将CNT修饰在玻碳电极上, 可以实现Hb的直接电化学【351。Sun等【36】用SWCNTs和Nation将Hb固定到离子液体 修饰电极表面上,研究了m的直接电化学和电催化行为。Zheng等【3 7】将MWCNTs 固定到玻碳电极(GCE)上,然后将肌红蛋白和纳米Ti02混合修饰到MWCNTs/GCE 表面以研究其电化学行为。

由于纳米粒子高的比表面和其本身的生物兼容性,在生物电催化反应中起着

重要作用。与小尺寸纳米粒子结合组装的酶,其活性中心可更接近电极表面,易 于进行电子转移,提高了生物电催化活性。导电的纳米粒子与氧化还原蛋白质和 酶之间可以发生直接的电子转移,不需要电子媒介体,可作为理想的第三代生物

传感器,如辣根过氧化物酶(HRP)与纳米Au【38,391、纳米Ti02【251、铂黑【40】的混合组

装膜对H202的直接电催化还原。Kenneth等【41】人在Sn02电极上修饰纳米金后,对 细胞色素C的直接电化学行为进行了研究。Mn02纳米粒子与肌红蛋白(Mb)的多层 组装可形成稳定、多孔和高表面积的多层膜【421,在约30 am厚的膜层中,仍可实 7

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现Mb的直接电化学。将溶胶一凝胶和纳米自组装技术相结合来固载HRP,也实现 了酶的直接电化学,对H202的还原显示出很高的催化活性【431。Fe304纳米粒子因 兼具磁性和小尺寸效应,在生物领域内得到广泛应用。Hu等【l5】采用层层组装的方 法将Hb固定在在纳米Fe304薄膜电极上进行了研究,实验结果表明Fe304纳米粒子 薄膜为蛋白质与电极间的直接电子转移提供了一个适宜的微环境,使Hb能够很好 地实现其直接电化学行为,同时,该电极对亚硝酸盐、三氯乙酸和H202有较好的 电催化行为。

1.5室温离子液体在生物电化学中的应用

1.5.1离子液体简介

离子液体(IL)是在室温及相邻温度下完全由离子组成的有机液体物质,简称

离子液体【44,45】。许多离子液体都是有很宽的液态温度范围,从.70℃到高达 300.400℃,在这些温度下都可以作为液体使用。从结构上说,离子液体一般是 由特定的体积相对较大的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子构成,大体 可以分为A1C13型离子液体、非A1C13型离子液体和其它特殊离子液体。最常见 的阳离子又烷基铵盐、烷基磷酸盐、吡啶离子、咪唑离子等,常见的阴离子有 卤素离子、含F,P,S的离子等。由于离子液体可以根据需要设计其阴阳离子 的组成并改变其取代基,进而改变其性能,在一定程度上可以实现人为设计, 使其能够符合化学学科各个方向的研究需要,在有机化学、催化化学、电化学、 萃取分离等领域有了广泛的应用【46,47】,并且已经渗透到功能材料、能源环境和 生命科学等其它学科。

1.5.2离子液体的物化性质

作为一类新型溶剂,室温离子液体具有传统溶剂所不具备的特点:(1)液态温

度范围宽;(2)溶解能力强,且具有溶剂和催化剂的双重功能,可作为许多化学反 应的溶剂或催化活性载体;(3)无显著的蒸汽压,不易挥发,不可燃性,在使用、 贮藏中不会蒸发散失,可循环使用,不会造成环境污染;(4)热稳定性和化学稳定 性高;(5)粘度大,受02、pH等的影响小,可简化实验条件;(6)较高的离子导电 性,因此无需另外加入电解质;(7)电位窗口宽;(8)低的毒性和环境影响;(9)种 类繁多,并可通过选择合适的阴阳离子对其性质进行调节;(10)具有良好的化学 和热力学稳定性。而且,离子液体中蛋白质、酶的稳定性好,有利于进行生物化 学和生物催化反应。

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综上所述,作为新颖的绿色溶剂,室温离子液体与常规的分子溶剂有很大不

同,具有更低的环境毒性,更易被回收利用,这些性质使得室温离子液体在化学、 材料学和生命科学等领域中有着广泛的应用。

1.5.3室温离子液体在生物电化学方面的研究进展

由于离子液体具有导电率高、电化学窗口宽等特点,使其在电化学和电分

析化学领域中具有较明显的优点,而且其挥发性小、溶解性好、酸碱性可调, 使其在电化学的多方面都有巨大的应用前景。孙伟【48】就室温离子液体在分析化 学中的应用进行了综述。同时,Endres【49】和Buzzeo[50】详细地介绍了室温离子液 体在各种电化学过程的应用,主要有以下几个方面:

(1)离子液体可以作为粘合剂和修饰剂。孙伟等【51-53]利用1.丁基.3.甲基咪 唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)为粘合剂代替传统石蜡制备了BMIMPF6离子液体修

饰电极(CILE),并以其为基底电极,用海藻酸钠、Nation和纳米CaC03将Hb 固定到该修饰电极表面上,研究了Hb在该电极上的直接电化学和电催化行为。 同时,也利用六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)代替传统石蜡制备了BPPF6修饰电

极,并以其为基底电极,用纳米CaC03和Nation将.I-Ib固定到该离子液体修饰 电极表面上,研究了Hb的直接电化学和电催化行为。Maleki等154J人以正辛基 吡啶六氟磷酸盐(OPPF6)为粘合剂制备了高性能的碳糊组合电极,研究结果表明 该离子液体修饰电极具有良好的电化学性能,有效地提高了各种有机/无机电活 性物质的电子转移速率,并且降低了生物分子的过电位值。同时,也采用离子 液体OpyPF6为粘合剂制备了离子液体电极(CILE),并以其为基底将Pd采用电 沉积的方法固定到该修饰电极表面制备了Pd/CILE,研究了肼的电催化行15引。 Zheng等【56】采用1.丁基吡啶六氟磷酸盐([BuPy][PF6】)作粘合剂代替液体石蜡制 备了离子液体修饰电极,研究了葡萄糖氧化酶(GOx)在该修饰电极上的电化学, 循环伏安扫描可以得到一对准可逆的氧化还原峰,并且进一步研究T(GOx)对 H202的催化行为。

各种类型碳纳米材料与离子液体复合物修饰电极被广泛应用于研究生物大

分子。董绍俊等【57】对基于室温离子液体和碳材料的复合材料进行了电化学和生 物电化学方面的研究,他们分别将HRP和微过氧化物酶(MP.11)包埋在

BMIMPF6/多壁碳纳米管(MWCNTs)或者BMIMPF6/空心碳微球复合材料中,发 现这两种基于室温离子液体和碳复合材料修饰的酶电极能够在磷酸缓冲液中发 生直接电子传输,并且酶电极能够促进氧气和过氧化氢的还原。由于碳纳米管 和离子液体之间存在着特殊的相互作用,它们的复合材料表现出优良的性质,

被广泛应用于构建各种生物传感器【5蹦o】。Zhang等[6l】人将大量的单壁碳纳米管 9

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

溶解在离子液体中制备了碳纳米管离子液体膜修饰电极,并将葡萄糖氧化酶固 定于膜中用于葡萄糖的测定。“等【62】入将单壁碳纳米管与离子液体组成的凝胶 用于微电极的制备并且研究了其对NO的电催化氧化,检测线性范围为100

nmol/L到100 I_tmol/L。Xiang等【63】人用金纳米粒子/离子液体BMIMBFd多壁碳 纳米管复合膜将cyt C固定到玻碳电极表面上,研究了其直接电子转移和对

H202的电催化行为。Zhang等【叫用室温离子液体(RTILs)、壳聚糖(CTS)、多壁 碳纳米管(MWCNTs)复合膜将细胞色素C(Cyt C)固定到玻碳电极表面上,研究

了Cyt C的直接电化学,同时该修饰电极对H202也具有良好的电催化作用, 检测限为8.O?10’7 mol/L,这为第三代生物传感器的研制奠定了基础。

由于离子液体具有高的导电性和稳定性,因此可以作为一种膜材料固定于

电极表面上。Sun等[65】将离子液体BMIMPF6、皂土和血红蛋白混合均匀后涂布 于热解石墨电极表面制备了修饰电极并研究了Hb的直接电化学与电催化行为。 Yu等【66】人将亲水性离子液体修饰于玻碳电极表面后形成单分子膜,该膜的存在 对尿酸有电催化作用,并能够促进HRP的直接电子转移过程。Zheng课题组【67】 采用离子液体HMIMPF6制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE),应用该修饰电极 考察了对苯二酚的电催化行为,并和该离子液体作为膜材料制备的(IL/CPE)进 行了比较。“掣68】人采用离子液体BMIMBF4和硅溶胶一凝胶混合制备出HRP 修饰电极,与传统的硅溶胶一凝胶修饰HRP电极相比,这种新型修饰电极具有 更好的稳定性和反应活性。

(2)离子液体可以作为电化学研究过程中的溶剂和支持电解质。王欢等【69】

采用循环伏安和计时库仑等电化学方法研究了间硝基苯酚在离子液体1.乙基.3. 甲基咪唑溴化物([EMIM]Br)中的电化学还原行为,考察了扫描速度、温度和底 物浓度等因素对其电化学行为的影响,求得扩散系数D为9.18xlO~cm2/s,电 子转移系数a为0.37,证明了在[EMIM]Br体系中,其反应是受扩散控制的不

可逆反应。杨家振等【_70,‘”】在室温离子液体四氟硼酸正丁基吡啶(BPBF4)中研究了 Fe”的电化学行为,求解了在不同浓度和温度下Fe3+的扩散系数和扩散活化能, 结果表明扩散活化能随浓度增加而增大。Wang等【72】人用琼脂糖水凝胶将亚铁 血红素蛋白固定在玻碳电极上后在离子液体BMIMPF6中研究了它的电化学行

为。

(3)离子液体还可以做电化学气体传感器。由于离子液体具有较强的溶解

能力,它还可用于制备各种类型如02、S02、C02和NH3的气体传感器。Buzzeo 等【73J人利用离子液体制备出修饰膜用于气体传感器,可以将待测气体溶解于膜 中进而产生响应,使这种传感器的响应速度非常快。这种传感器不需要再加入 任何支持电解质,而且由于离子液体的热稳定性和低蒸汽压的特点,可以使该 10

青岛科技大学研究生学位论文

种气体传感器用于高温高压的特殊环境中。Wang等【74'751人分别以【BMIM]PF6 和1.乙基.3.甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)为固体电解质制备了安培氧气传 感器,采用计时安培法可得到02产生瞬间的氧化还原电流,且可对气体混合物 中的02进行定量检测。

1.6本论文的立题思想和研究内容

1.6.1立题思想

氧化还原蛋白质和酶的直接电化学研究不仅对于了解生命体内的物质代谢

和能量转换、了解生物分子的结构和各种物理化学性质、探索其在生命体内的 生理作用及作用机制具有重要的意义,同时它为开发新型无媒介体的第三代生 物传感器以及生物燃料电池、生物医疗器件生物电子学等奠定基础。

1.6.2研究内容

利用室温离子液体和纳米材料等,通过与壳聚糖、Nation等生物相容性聚

合物优化组合,设计多种新的生物相容性复合体系,如聚合物室温离子液体的 复合体系,聚合物纳米材料的复合体系,将这种基于室温离子液体或者纳米材 料的复合体系用于构造性能优良的酶电极,为酶和蛋白质直接电化学的研究和 第三代生物传感器的发展提供新的机遇。

(1)制备了3种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体1.丁基一3.甲基咪唑六 氟磷酸盐、六氟磷酸正丁基吡啶和1.乙基一3.甲基咪唑四氟硼酸盐等为粘合剂和 修饰剂,与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极(CILE)。

(2)构建了基于氧化还原蛋白质的电化学生物传感器。以制备的多种新型的离子 液体修饰碳糊电极为工作电极,以血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)等为模拟酶,以 Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米管(SWCNTs)、纳米Ti02、皂土

(Clay)、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖(CTS)等为修饰材料,采用层层涂布法、直接 吸附、直接混合等固定方法,将蛋白质固定在电极的表面制各了不同类型的氧化 还原蛋白质电化学生物传感器如NafioMm?/MWCNTs/CILE、

NafioIl/】酏/SWCNTs/CILE、Nation一[BMIM]PFdHb/CILE等。采用扫描电子显微镜 (SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱和多种电化学法对修饰电极的 性质进行了研究和表征。实验结果表明,蛋白质在不同的修饰膜内基本保持了其 生物活性,循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰,并且在修饰电极上其电

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

子传递能力明显增强,纳米粒子和离子液体的存在对电化学行为有极大的促进作 用,对Hb和Mb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数,解释 了电化学行为的机理,构建了多种新型的电化学生物传感器。

(3)利用所制备的电化学生物传感器进行多种样品的测定。该电化学生物传感器 对H202、三氯乙酸(TCA)、亚硝酸钠(NaN02)等多种重要的小分子具有良好的电催 化效果,催化还原峰电流与测定对象的浓度成正比,进而构建了用于检测微量分 析对象的电化学传感分析的新方法,对电催化机理和反应动力学进行了研究,求 解了相应的米氏常数。

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青岛科技大学研究生学位论文

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第二章血红蛋白在葡聚糖/离子液体BMIMPF6修饰碳糊电

极上的直接电化学

摘要:采用涂布法将血红蛋白(Hb)和葡聚糖(De)层层修饰到离子液体修饰碳糊 电极(CILE)表面,制成了稳定的固载Hb和De的CILE,用电化学方法、紫外. 可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱等手段对包埋在膜内Hb的性质进行了研 究。实验结果表明,Hb在膜内没有发生变性。在pH值7.0的PBS缓冲溶液中 的循环伏安曲线上出现一对准可逆的氧化还原峰,为Hb中血红素辅基

Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰,且式电位不随扫速的变化而变化,并求解了相关的 电化学参数,其中电子转移数11为0.89,电子转移系数a为0.463,反应速率常 数忽为0.428 s~。

关键词:血红蛋白;葡聚糖;‘离子液体;碳糊电极;直接电化学

血红蛋白是一种重要的生命物质,其电化学与电分析化学方面对于研究生命

体系内的电子转移过程,了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检测方法 等方面具有非常实际的意义。由于电分析化学具有实时、快速、灵敏、易于微型 化等特点,所以将它应用于研究血红蛋白的性质是一种非常有效的方法。 室温离子液体(RTIL)是指在室温及邻近温度下完全由阴、阳离子组成的

液体物质,电化学窗口宽、导电率高、化学和热稳定性高、溶解性好等特点特 别适合于电化学与电分析化学的研究领域,它既可以作为溶剂又可作为支持电

解质,是电化学研究中的一种优良的介质功能材料【l】。Zhao等【2J人制备了多壁 碳纳米管/离子液体修饰电极和碳微须/离子液体修饰电极,采用交流阻抗谱和循 环伏安法表征了上述两种离子液体修饰电极,并将该两种电极用于辣根过氧化 物酶(HRP)的直接电化学研究及其对02和H202的催化还原测定。

葡聚糖De凝胶是蛋白质纯化中的一种层析介质,它具有生物相容性、稳

定性好、吸附性强等优点,本文采用疏水性离子液体1.丁基.3一甲基咪唑六氟磷 酸盐(BMIMPF6,其结构如图2.1所示)为粘合剂代替传统液体石蜡制备了一种 新型的离子液体修饰电极(CILE),利用葡聚糖De凝胶将Hb固定到CILE电极 表面上,用电化学方法、紫外.可见光谱、傅立叶变换红外光谱等对包埋在膜内 的血红蛋白的性质进行研究。实验结果表明,Hb在De膜内保持了良好的分子 19

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

/⑦◇√P聒/N\夕N-/\/r%

2.1实验部分

2.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司);三电极系统:以离子液体

修饰碳糊电极为工作电极(0--4 mm),饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂电极

为辅助电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Varian公司);Tensor 27型FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司);pHs.25C型酸度计(上海虹益仪器

仪表有限公司)。.

牛血红蛋白f生化纯,分子量为64500,天津市川页生化制品有限公司);1.

丁基.3.甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6,杭州科默化学有限公司);葡聚糖(De, 分子量为20000,国药集团化学试剂有限公司);石墨粉(上海胶体化工厂,颗粒

度≤30岬);O.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液(PBS)的配制方法:8.0 g NaCI+0.2 g KCl+1.44 gNa2HP04+0.2 g KH2P04用水定容至‘1000 mL,然后再用0.1 mol/L 的H3P04和O.1 mol/L的NaOH调到所需的pH值;所用试剂均为分析纯,实验 用水为二次蒸馏水。

2.1.2 De/Hb/CILE的制备

将石墨粉和离子液体BMIMPF6以质量比为4:1的比例混合,用研钵研磨均

匀后,将混合物填入玻璃管中压实,内插铜线作为导线,即可得到离子液体修

饰碳糊电极(CILE),使用前将电极表面在称量纸上打磨成镜面。

取10 pL浓度为20.0 mg/mL的Hb溶液涂布到表面处理好的CILE上,自

然晾干后,再在电极表面上涂布10 pL浓度为6.0 mg/mL的葡聚糖水凝胶,自 然晾干后就得到了所要制备的De/Hb/CILE。

2.1.3电化学行为的研究

以De/Hb/CILE为工作电极,考察了其在O.1 mol/LpH 7.0的PBS缓冲溶液 20

青岛科技大学研究生学位论文

中的电化学行为。仪器条件为:扫描速度为100 mWs,扫描电位范围为O.3 v~

-0.8 V(I;8.SCE)。测定前向PBS缓冲溶液中通高纯氮气30 min以除去氧气,测 定时保持氮气氛围。

2.2结果与讨论

2.2.1紫外可见吸收光谱

在紫外.可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红素蛋白质的

结构信息【3】,如果蛋白质的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失【4】。 用紫外可见吸收光谱考察了Hb在De膜中的结构变化,结果如图2.2所示。Hb

在水溶液中的Soret吸收带在405.7姗(曲线d);在pH为2.0时,Hb在De膜

中的Sorct吸收带在365.1 nm处(曲线a),说明Fib已部分变性,在pH为7.0

和9.0时,Fib在De膜中的Soret吸收带分别在405.9 nlrn和407.0 B.tn(曲线c与 b),与水溶液中Soret吸收带几乎相当,这表明Hb在De膜中几乎保持原本构

象,没有发生变性。

2.5

2

羔'-5

1

O。5

∞0 400 600 ∞O

Wavelength(n缃)

图2.2血红蛋白在不同溶液中的紫外一可见吸收光谱图

Fig.2-2 Uv-Ⅵs absorption spectra oflib in the different solution:(a)Hb mixedwim De in pH 2.0

PBS,(b)I-lb mixed witll De in pH 10.0 PBS,(c)Hb mixed with De in pH 7.0 PBS and(d)the solution of Hb in water

2.2.2傅立叶变换红外光谱图

FT-IR也可用于检测蛋白质的结构信息,蛋白质的酰胺I和酰胺II红外吸

21

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

收带可提供多肽链二级结构的信息,如果蛋白质变性,酰胺I和酰胺II两个吸

收带会显著改变甚至消失。酰胺I(1700.1600 cmJ)是由蛋白质肽链骨架中的肽 段连接处C=O的伸缩振动引起的;酰胺II(1620.1500 cm以)则产生于N.H弯曲 和C.N伸缩振动。实验结果显示,在2000.1000 cm。1范围内观察血红蛋白在De 膜内的红外光谱,结果如图2.3所示。血红蛋白在膜内的酰胺I和酰胺II红外

吸收带分别在1654.09 cm。1和1539.18 cm。1(图b),而天然血红蛋白的吸收带分 别为1655.34 cm以和1535.80 cm。1(图a)。从谱图的相似性可以认为Hb在De膜 内基本保持了其天然构象。

胃巴

Q

U=

c=

2000 1500 1000 2000 1500 1000

X,Vavenumber(on一1)

图2.3(a)血红蛋白和(b)葡聚糖膜内的血红蛋白红外光谱图

Fig.2-3 FT-IR spectra of(a)Hb and(b)Hb embedded in De film

2.2.3 Hb在De/CILE中的直接电化学行为

将De/Hb/CILE放入pH 7.0的PBS缓冲溶液中,在0.3~O.8 V电位范围内, 经循环伏安扫描后可观察到一对稳定且准可逆的氧化还原峰(如图2-4a),阴极

峰电位(Epc)和阳极峰电位(Epa)分别为一0.355 V和.0.195 V(vs.SCE)。与之对比, 裸CILE和De/CILE在pH 7.0的PBS缓冲溶液中,循环伏安扫描都没有氧化还 原峰出现,说明在电极表面上不存在电活性。由此说明,上述的氧化还原峰是

Hb的血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的氧化还原峰。由伏安图可以计算出Hb的 式电位(EOI)为.0.275 V,这与Hb在无机膜【5】中的结果不同,说明不同固定方 式构成的不同微环境会对Hb的式电位产生影响。

青岛科技大学研究生学位论文

o

--?■

、\△

■_■

E~

图2_4不同修饰电极的循环伏安图

Fig.2-4 Cyclic voltammograms of(a)De/Hb/CILE,(b)De/CILE and(C)bare CILE at the SCan

rate of 1 00 mV/s in pH 7.0 PBS(inset:the background-subtracted cyclic voltammogram of De

/Hb/CILE using data presented in curve a and b)

2.2.4扫描速度对Hb电化学响应的影响

考察了扫描速度与峰电位之间的关系,在扫速50-250 mV/s范围内,Hb在

不同扫描速度下都得到了准可逆的循环伏安响应,且随着扫速的增加,还原峰

电位负移,氧化峰电位正移,但式电位基本不变。根据准可逆薄层电化学过程

的Laviron理论【6】,阴极峰电位Epc与In,的斜率为一RT旭IlF,阳极峰电位Epa 与In.的斜率为RT/(1.a)nF。考察了Ep与In.的关系,结果如图2.5所示,根 据公式,可以求得电子转移数11为0.89,电子传递系数Q为0.463,说明能垒 基本对称,符合准可逆过程特征。

根据公式.109k,=tzlog(㈨+(1刊logtZ--log(等m(1刊酱

可计算得出反应速率常数忽为0.428 S~。

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

/.、

【工]

U∽

(力

>

\.—/

lrro(v/V s-1)

图2-5峰电位与扫描速度的对数之间的关系

Fig.2-5 The relationship ofthe anodic(a)and cathodic(b)peak potential against scan rate(1nv)in

pH 7.0PBS

在50—250 mWs范围内考察了峰电流与扫描速度的关系,随着扫速的增

加,峰电流在增加。以峰电流Ip为纵坐标,扫描速度l,为横坐标,做Ip川的

关系曲线可得两条直线,结果如图2-6所示,峰电流与扫描速度呈良好的线性

关系。这表明在该扫速范围内电极反应是吸附控制过程,即为薄层电化学行为

【7】。对于薄层电化学来说,电活性的Hb Fe(III)或Hb Fe(II)在发生还原或氧化反 应时,通过电极的总电量与扫速无关。对循环伏安还原或氧化进行积分,可以

得到电极中电活性物质通过电极表面发生还原或氧化时所消耗的电量(Q)。由

公式:Q=nAFF*,可求得电活性物质的表面浓度,式中11为电活性物质发生电

极反应时的电子转移数,F为法拉第常数,A为电极面积(cm2),r宰为电活性物

质的表面浓度(mol/cm2)。由此可得De/Hb/CILE中电活性Hb的平均表面浓度

(r木)为2.64x10‘9 mol/cm2。

24

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0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

12(V/s)

图2-6扫速与峰电流的关系曲线图

Fig.2-6 Linear relatiomhip of cathodic(a)and anodic(b)peak current Ip versus scan rate V for

De/Hb/CILE in pH 7.0 PBS.

2.2.5 pH值对Hb电化学的影响

缓冲溶液的pH值对Hb在De/CILE上的循环伏安行为有显著影响,随着溶

液pH值增大,De/Hb/CILE的氧化还原峰电位均负移。当pH在5.5~9.O范围内, 式电位(∥)与pH值呈良好线性关系,结果如图2.7所示,pH值每增加1个单

位,式电位增加44.7 mV,这比200C可逆体系的理论值.56 mV要小,原因可

能是Hb Fe(II)的水合作用以及氨基酸残基与血红素形成的氢键影响Hb的电势

值。式电位随pH增加而负移的现象与水分子以及血红素周围氨基酸的质子化作

用有关,因为在蛋白质分子中同时存在着氧化还原中心和质子化位点,电子传

递伴随质子转移的反应,会改变氧化态或还原态中心离子与质子化过程的静电

作用,表现形式为氧化还原峰电势随溶液pH值的增加而负移。

6

4

2

O

4

《c.oH/dH

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

/-、∞

U

∞》

\-/

>

-’\

o

图2.7pH值与血红蛋白式电位的关系图

Fig.2-7 The relationship between the formal potentials(Eo.)and pH

2.2.6电催化行为.

用循环伏安法考察了Hb修饰薄膜电极对H202的电催化还原,在pH 7.0的

PBS缓冲溶液中加入H202后进行测定,在.0.468 V出现新的还原峰,且随着

H202的加入,还原峰明显增大,而氧化峰逐渐消失。而在同样条件下,裸电极

和De/CILE电极在H202溶液中均未观察到相应的还原电信号。说明被固定在

膜中的Hb能有效地发生直接电子转移,而且保持了其生物电催化活性,能够

催化H202的还原。当H202浓度在4.O?lO西~1.5x104mol/L范围内,催化电流与 H202浓度呈良好的线性关系,其线性回归方程Iss(1aA)=O.133C(1amol/L)+35.44 (n-6,7=0.993)。利用米氏方程可以求解催化反应的动力学参数。根据

Linewearer-Burk方程的电化学表达形式【8】:

一1:上+兰墨Iss Im驭j Im.飘c

式中I。。是加底物后的稳态电流,c是底物的体积浓度,Imax是饱和底物状

态下所测得的最大电流,可以计算此催化反应的表观米氏常数为1.695pM。这比以前报道的基于血红蛋白的过氧化氢传感器的酽值要低【9,10】。胪越小

表示酶的催化能力越强,因此血红蛋白在De膜内具有较高的催化活性。

2.2.7电化学交流阻抗谱图

26

青岛科技大学研究生学位论文

交流阻抗能反映电极表面修饰过程中阻抗变化的信息。图2.8分别为裸

CILE(曲线a),De/CILE(曲线b)和De/Hb/CILE(曲线c)的电化学阻抗谱图。在裸 CILE上电子传递电阻(Ret)为72.0 Q,主要是由于CILE具有较好的导电性。修

饰有De的CILE,其Ret值为108.2 Q,因为De的存在能够阻碍电子转移。而

De/Hb/CILE上阻抗明显增大(曲线c),其Ret值为134.5 Q。这种阻抗值的逐步 增加说明了De和Hb被层层修饰于CILE电极表面,从而阻碍了[Fe(CN)6]3棒

电对的氧化还原。

g:

Z。疵

图2-8不同修饰电极的交流阻抗图

Fig.2-8 Electrochemical impedance spectroscopy for(a)bare CILE,(b)De/CILE and(c) De/Hb/CILE in the presence of 1 0.0 mmol/L[Fe(CN)6】3‘and 1 0.0 mmol/L[Fe(CN)6r and o.1

mol/L KCl with the frequencies swept from 1 0‘4 to 1 0。2 Hz一

2.2.8电极的稳定性

考察了Hb修饰电极的稳定性,实验结果表明该修饰电极在室温下放置15

天后其峰电流减少了2.7%,放置30天后其峰电流减少了7.8%,表明固定在

电极上的Hb能保持较长时间的电活性。

2.3本章小结、

采用层层涂布法用葡聚糖膜将血红蛋白固定在离子液体修饰碳糊电极表面

制备了Hb/De/CILE,采用电化学、紫外可见光谱、傅立叶红外光谱等分析方法

27

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

对埋藏在膜内的血红蛋白的性质进行了研究,结果表明Hb保持了原有的构象, 可以有效地进行电子传递。考察了Hb在De修饰CILE上的直接电化学行为, 并求解了相关的电化学参数。

28

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参考文献

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diffusionless electrochemical systems[J],J.Electroanal.Chem.,1979,101:19—28

[7】Rusling J.F'Nassar A.E.F'Enhanced electron-transfer for myoglobin in surfactant films on

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perocide[J],Anal.Chim.Acta.,1996,335,137-145

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proteins entrapped in agarose hydrogel films in room—temperature ionic liquids[J],Langmuir,

2005,21。9260.9266

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

第三章血红蛋白和纳米Ti02静电吸附修饰离子液体修饰

电极及其电化学行为研究

摘要:制备了离子液体BPPF6修饰碳糊电极(CILE),并以其为基底电极,利用

静电吸附的方法将纳米Ti02和血红蛋I兰t(Hb)固定于CILE表面,采用紫外.可见 吸收光谱、红外光谱、电化学方法等手段对吸附于电极表面的Hb的性质进行

了表征,光谱实验表明Hb保持了其原始构象,电化学实验表明在pH 7.0的PBS 缓冲溶液中循环伏安扫描出现了一对峰形良好且稳定的准可逆氧化还原峰,为

Hb Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰。由于纳米Ti02的存在提供了一个合适的微环境, 促进了Hb的电子传递能力,求解了相关的电化学参数。

关键词:血红蛋白;离子液体;碳糊电极;直接电化学;纳米Ti02

由于离子液体具有导电率高、电化学窗口宽的特点,使其在电化学和电分

析化学领域中具有较明显的优点,而且其挥发性小、溶解性好、酸碱性可调,

使其在电化学的许多方面都有巨大的应用前景【l】。Sun等【2】人以离子液体1.乙基 .3.甲基咪唑溴化物(EMIMBr)作为电解质,研究了苯甲醛的电化学行为。最近 也报道了有关离子液体修饰电极的生物电化学和电分析的研究。Moleki等【3】以 离子液体OPPF6为粘合剂制备出高性能的离子液体修饰碳糊电极,结果表明该 离子液体修饰碳糊电极具有非常好的电化学行为以及对不同有机物和无机物表 现出高的电子传递速率。

本文采用疏水性离子液体六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6,结构式如图3.1所

示)为粘合剂代替传统固体石蜡,制备BPPF6离子液体修饰碳糊电极。并采用 静电吸附的方法将Hb和纳米Ti02固定于电极表面,即可得到Hb修饰电极

(Ti02/Hb/CILE),利用光谱实验和电化学实验对该修饰电极进行了表征,求解了 相关的电化学参数。

图3-1六氟磷酸正丁基吡啶的分子结构式

Fig.3-1 The molecular structure of BPPF6

30

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3.1实验部分

3.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:自制修饰电

极为工作电极(表观面积A=0.12 cm2),饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂电 极为辅助电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Varian公司); pHs.25C型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司);Tensor 27型FT-IR红外光谱 仪(德国Bruker公司)。

血红蛋白(生化纯,分子量为64500,天津市川页生化制品有限公司,20

mg/mL储备液,4"C冰箱保存);六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6,杭州科默化学有 限公司,分子量281.18);纳米Ti02(山东锦科化工有限公司);石墨粉(上海胶

体化工厂,颗粒度<301am);铁氰化钾(天津市瑞金特化学品有限公司);0.1 mol/L PBS系列缓冲溶液,所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水,在电化学 测定前向电解质溶液中通纯N2 30 min除氧。

3.1.2电极的制备

将石墨粉和离子液体BPPF6以质量比3:1的比例放入研钵混合均匀,在80。(2 研磨l小时,将混合物填入玻璃管中压实,内插铜线作为导线,即可得到离子 液体碳糊电极(CILE),使用前将电极表面打磨光滑。首先将新磨光的CILE电极 浸泡在20.0 mg/mL的血红蛋白溶液中40分钟,用水冲洗,3次后干燥,再将 电极浸泡在6.0 mg/mL Ti02的悬浊液中40分钟,用水冲洗,干燥后即可,得 到所需要的修饰电极。

所制备的修饰电极在pH 7.0的PBS缓冲溶液中进行循环伏安扫描,研究

Hb在CILE表面的直接电化学行为。

3.2结果与讨论

3.2.1紫外一可见吸收光谱

在紫外可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红素蛋白质的结

构信息【4】,如果蛋白质的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失‘51。利用 紫外可见吸收光谱考察了Hb在Ti02混合溶液中的光谱曲线,结果如图3.2所 31

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

示。Hb在水溶液中的Soret吸收带在405.9 nm(曲线a);在不同pH值5.0,7.0

和9.0缓冲溶液中,Hb与Ti02混合溶液的Soret吸收带在405.9 ILrn处(曲线b.d), 与曲线a中的Soret吸收带相同,表明1410在Ti02的混合溶液中几乎保持其原始 构象,没有发生变性。而pH值为2.0时,Hb与Ti02混合溶液的Soret吸收带

在365.4 am处(曲线e),表明此时Hb在某种程度上有所变性。

2.5

2.O

苎1.5

1.O

O.5

300 400 500 600

VVavelengtll/nm

图3-2 Hb在不同溶液中的紫外吸收光谱图

Fig.3-2 UV-Vis absorption spectra ofTi02/Hb/CILE in pH(a)Hb in water solution,(b)5.0,(c)

7.0,(d)9.0 and(e)2.0 PBS,respectively

3.2.2傅立叶变换红外光谱图

FT.IR也可用于检测蛋白质的结构信息,蛋白质的酰胺I和酰胺II红外吸

收带可以提供多肽链二级结构的信息,如果蛋白质变性,酰胺I和酰胺II两个

吸收带会显著改变甚至消失。酰胺I(1700.1600cm。1)是由蛋白质肽链骨架中心肽 段连接处C=O的伸缩振动引起的;酰胺II(1620.1500cm。11则产生于N.H弯曲和

C.H伸缩振动。在2000.1000cm。1范围内观察血红蛋白在Ti02膜内的红外光谱, 结果如图3.3b所示,血红蛋白在膜内的酰胺I和酰胺II红外吸收带分别在

1654.43 cmd和1539.42 cm~,和天然血红蛋白的吸收带1655.34 cm。1和1535.80 cm。1(图3.3a)很接近。从光谱的相似性可以认为Hb在Ti02膜内基本保持了其 天然构象。

32

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o o

2000 1500 1000 2000 1500

1

1000

一一’ ? 一工Wavenumber/cm一

图3.3 Hb在不同修饰膜中的红外吸收光谱图

.Fig.3-3 FT-瓜spectra of the films of lib(a)and(b)Ti02/Hb/CILE

3.2.3循环伏安图

图3_4显示了不同修饰电极在扫速为200 mWs,0.1 mol/L pH 7.0 PBS中 的循环伏安曲线。在裸CILE(曲线c)上没有观察到任何氧化还原峰;当Fib吸 附到CILE表面后,可以观察到有一对准可逆的氧化还原峰(曲线b),由图3.4 可知,Hb的氧化还原峰电位分别为Epc=.0.345 V,Epa=一0.096 V(vs.SCE)(曲 线b),式电位(E∥)为.0.221 V,这一对氧化还原峰是由Hb血红素辅基

Fe(III)/Fe(II)电对的电极反应而产生的,说明Hb在CILE上实现了直接电子转 移,但是该电极的稳定性较差,循环伏安峰会逐渐减小,直至消失,表明Hb 逐步解离到溶液中。在Hb/CILE表面吸附上纳米Ti02后,电极的稳定性明显提 高,电化学响应值表现稳定。在pH 5.0 PBS中,纳米Ti02带正电,与带负电的 Hb相互作用形成Ti02/Hb/CILE,对电极表面的Hb起到了保护作用,使该修饰 电极的稳定性提高,且电化学响应也相应提高,由于纳米粒子独特的催化性质, 促进了Hb与电极之间的电子传递,循环伏安峰电流增强。

从曲线a中可知其氧化还原峰电位分别为Epc=一0.340 V,Zpa=.0.161 V(vs. SCE),式电位(E0’)为.0.251 V,AEp=179 mV。以上可以说明不同固定方式构成 的不同微环境对Hb的式电位产生了影响。

33

一琴奄。口≈#Hg{;q≈占.

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

_中

o

-?_■ \

■?一

9

E/V

图3_4不同修饰电极的循环伏安图(a)Ti02/Hb/CILE,(b)Hb/CILE和(c)裸CILE,扫速: 200 mV/s(插图为曲线a和b分别扣除空白c所得)

Fig.3-4 Cyclic voltammograms of(a)Ti02/Hb/CILE,(b)Hb/CILE and(c)bare CILE at the scan

rate of 200 mV/s in pH 7.0 PBS buffer,(inset:the background-subtracted cyclic voltammogram

ofTi02/Hb/CILE(1)and Hb/CILE(2)using data presented in calve c)

3.2.4扫速对Hb电化学响应的影响

为了研究电极反应过程,考察了扫描速度对电化学响应的影响,结果如图

3.5所示,在100,-600 mV/s范围内,Fib在不同扫描速度下都得到了准可逆的 循环伏安响应,氧化还原峰电流随扫速的增大而线性增加,其线性关系如图3-6

所示,表明Ti02/Hb/CILE表现出薄层电化学行为,说明在该扫描速度范围内电 极反应是吸附控制过程。

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卜_一

EN

图3—5不同扫速下Ti02/Hb/CILE的循环伏安图

Fig.3-5 Cyclic voltammograms ofthe Ti02/Hb/CILE in pH 7.0 PBS witll the different scan rates

(from a tO f)as 1 00,200,300,400,500,600 mV/s,respectively

0.12 O.24 0.36 0.48 0.60

u/(mV/s)

图3-6氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速(V)的关系曲线

Fig.3-6 Linear relationship of the cathodic(a)and anodic(b)peak current(Ip)versus scan rate

(V)for Ti02/Hb/CILE in pH 7.0 PBS

对于薄层电化学行为,电活性的heme Fe(III)在负向扫描时被还原为heme

Fe(II),而在反扫过程中电活性的heme Fe(II)又被氧化为heme Fe(III)。在扫速 100,600 mV/s范围内氧化还原峰电流随扫速的增加而线性增加,但是积分电量

35

-

-

盖/dH

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

基本不变。根据公式:Q=nAFF*,式中Q为积分电量,A为电极表观面积,F

为法拉第常数,n为电极反应电子转移数,r宰为电活性物质的表面覆盖度,由

此公式可以求得r}为3.05x10毋mol/cm2,这比文献报道值要大【6l。

-0.07

-0.14

/.、幽

殳-0.21 ∽

o-0.28

>

岫.0.35

旬.42

-2.5 -2.0 .1.5 .1.0 -0.5

logV(V/s)

a

b

图3-7氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数logv之间的关系

Fig.3-7 The relationship of the anodic(Epc)‘and cathodic(Epa)peak potential against logv

图3-7是氧化峰与还原峰峰电位与扫速的线性关系曲线,根据准可逆薄层

电化学过程的Laviron[7,s]公式,

epc圳‘一筹1。91, (1)

劬=^而2.3丽RT 1。91, (2) logt=tzlog”仅)+(删哪-,zl,1,og丽RZ.TjK一』紫,㈣气、

由图中的线性方程Epa(V)=0.058 logv.0.036(n=12,7=0.992)和Epc

(V)--0.065 logv-0.428(n=12,7=0.995),由方程(1)和(2)可以求得电子转移数11 =O.87,电子传递系数a=O.469,说明能垒基本对称,符合准可逆过程的特征, 根据公式(3)可计算得出反应速率常数氟=0.635 S。1。

3.2.5 pH对Hb电化学响应的影响

研究了不同pH值的缓冲溶液对m薄膜修饰电极的电化学行为的影响。随

着溶液pH值增大,修饰电极的氧化还原峰电位均负移。在5.5~10.0pH范围内, Hb的电化学行为都表现为稳定的准可逆过程,且式电位(Eo.)与pH值呈良好线

36

青岛科技大学研究生学位论文

性关系,结果如图3-8所示,其方程的斜率为41.4 mV/pH。这比25"C可逆体系 的理论值.59 mV/pH稍小,原因可能是质子化作用不是简单过程,而受血红素 轴向配位基团和水合铁离子质子化作用的共同影响【9】。但仍可以肯定Hb在该修 饰电极上发生一个电子传递的同时还伴随着一个质子的转移【101,其反应方程式 如下【11】:

Hb Fe(III)+If+e-毒Hb Fe(II)

,‘、

o

(,)

∞>

>

’、

l=U

pH

图3-8式电位(Eo.)与缓冲溶液pH的关系曲线

Fig.3-8 Linear relationship of buffer pH versus the formal potential(EoI)

3.2.6电极的稳定性

考察了Hb修饰电极的稳定性,实验结果表明该修饰电极在连续扫描200

次后,其峰电流减少了5.0%。表明固定在电极上的Hb能保持较长时间的电活 性。

3.3本章小结

制备了以离子液体BPPF6修饰的碳糊电极(CILE),并以其为基底电极,通

过静电吸附的方法将Hb和纳米Ti02固定到电极表面上,研究了Hb在Ti02/CILE 上的直接电化学行为。实验结果表明,Hb在Ti02膜内没有发生变性,保持了

其生物活性,其循环伏安曲线表现为一对准可逆的氧化还原峰,求解了电化学

参数为,电子转移数n=0.87,电子传递系数a=0.472,反应速率常数忽=0.635 S一。 37

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

参考文献

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glassy carbon[J],Chin.J.Chem.,2005,23:367—369

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an ionic liquid as a binder[J],Anal.Chem.,2006,78:3820-3826

【4】George P,Hanania G,A spectrophotometric study of ionizations in methaemoglobin[J],

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[5]Nassar A.E.F,Willis W.S,Rusling J.E,Electron transfer from electrodes to myoglobin:

facilitated in surfactant films and blocked by adsorbed biomacromolecules[J],Anal.Chem.,

1995,67:2386—2392

[6]Lariron E.,Adsorption,autoinhibition and autocatalysis in polarography and in linear

potential sweep voltammetry[J],J.Electroanal.Chem.,1974,52:355-393

【7]Laviron E.,General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of

diffusionless electrochemical systems[J],J.Electroanal.Chem.,1 979,101:l 9-28

[8]Liu,H.T.,He,P.,Li,Z.Y,et.al,An ionic liquid-type carbon paste electrode and its

polyoxometalate-modified properties[J],Electrochem.Commun.,2005,7(12):1357-1363

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myoglobin[J],Adv.Biophys.,1978,ll:249-281

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[1l】Ma H.Y Hu N.F,Rusling J.E,Electroactive myoglobin films grown layer-by-layer witIl

poly(styrenesulfonate)on pyrolytic graphite electrides[J],Langmuir,2000,16:4969-4975

38

青岛科技大学研究生学位论文

第四章血红蛋白在CTS/纳米Ti02/离子液体BMIMPF6修

饰碳糊电极上的直接电化学和电催化行为

摘要:利用直接涂布法将血红蛋白、纳米二氧化钛(nano.Ti02)以及壳聚糖(CTS) 固定于电极表面,制成以离子液体1.丁基.3.甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)为 基底的离子液体修饰碳糊电极(CILE)。采用电化学、光谱以及交流阻抗等手段 对包埋在膜内Hb的性质进行了研究和表征。光谱实验表明胁在薄膜内保持了 其原始构象,没有发生变性;电化学实验表明了在pH 7.0的PBS缓冲溶液中

出现一对峰形良好的准可逆氧化还原峰,为Hb Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰,其 式电位(E01)为.0.352 V(vs.SCE),求解了相关的电化学参数,考察了该修饰电极 对H202和TCA的电催化性能。

关键词:血红蛋白;纳米Ti02;1.丁基.3.甲基咪唑六氟磷酸盐;直接电化学; 电催化;壳聚糖

蛋白质是一种信息大分子,在生命体内起着重要的作用,研究其直接电化

学行为对于了解它的结构.功能关系及其在生物体内的电子传递机理都具有重 大意义。Hb是生命体内的呼吸蛋白,主要担负着传输氧气、分解H202和传 递电子等重要作用。目前Hb的结构研究的较为清楚,而且其价格相对便宜, 所以科学工作者们都将它作为研究生命过程中电子转移的理想模型物。

壳聚糖(CTS)是一种生物大分子,通过天然聚合物甲壳素去乙酰化得到,具

有生物相容性好、化学稳定性高、高机械强度、高亲水性和良好的成膜能力, 在分析化学的各个领域都有广泛的应用。将壳聚糖用于固定蛋白质和酬k引,可 以保持生物组分活性,又不影响电极的导电性。胡乃非等【3J利用CTS的良好性 能将Hb、Mb、HRP等固定于热解石墨电极表面,对其电化学性质进行研究,

并探讨了其电化学催化性能。本文以离子液体l一丁基.3一甲基咪唑六氟磷酸盐 (BMIMPF6)修饰碳糊电极(CILE)为基底电极,利用CTS和llano.Ti02作为膜 材料,将Hb固定在电极表面上,详细研究了Hb的直接电化学和电催化行为, 并且利用红外光谱、紫外光谱、扫描电子显微镜和电化学交流阻抗对包埋在膜 内Hb的性质进行了研究。

39

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

4.1实验部分

4.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:自制修饰电

极(①=4.0 mm)为工作电极,饱和甘汞电极(SEE)为参比电极,铂丝电极为辅助 电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Vanan公司);Tensor 27 型FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司);JSM.6700F型扫描电子显微镜(日本电 子株式会社);pHs.25C型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

牛血红蛋白(生化纯,分子量为64500,天津市川页生化制品有限公司,20.0

mg/mL储备液,4"C冰箱保存);1.丁基。3.甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6,杭州 科默化学有限公司,分子量284.18,熔点12℃,密度1.37 g/em,粘度281 cp); 壳聚糖(CTS,脱乙酰度95%,大连新蝶化工有限公司);纳米Ti02(nano—Ti02, 山东锦科化工有限公司,颗粒度为60 rim);石墨粉(上海胶体化学厂,颗粒度 ≤3呻m);三氯乙酸(TCA,天津市科密欧化学试剂开发中心);铁氰化钾(天津市 瑞金特化学品有限公司);O.1 mol/L磷酸盐(PBS)系列缓冲溶液,所用其它试剂 均为分析纯,实际用水为二次蒸馏水,在电化学测定前必须向电解质溶液中通 N2 30 min除氧,并在N2氛下进行测定。

4.1.2实验方法

离子液体BMIMPF6修饰碳糊电极(CILE)的制备方法见第二章2.1.2。

CILE在称量纸上打磨光滑后,取10“L 20.0 rag/mE的Hb溶液涂布到

CILE表面,自然晾干后,再在电极上涂布6皿Ti02(4.0 g/L),自然晾干后, 最后涂布6 luL4.0 g/L CTS溶液到电极表面,自然晾干后就得到了所要制备的修 饰电极CTS/nano.Ti02/Hb/CILE。

所制各的修饰电极在pH 7.0的PBS缓冲溶液中进行循环伏安扫描,研究

Hb在修饰电极上的直接电化学行为。

4.2结果与讨论

4.2.1傅立叶变换红外光谱图

蛋白质红外光谱中酰胺I(1700.1600 cmJ)和酰胺II(1620.1500 cm-1)的位 置对于蛋白质多肽链构象的变化较为敏感,能够为其多肽链二级结构提供较为

青岛科技大学研究生学位论文

详细的信息。酰胺I是由蛋白质肽链骨架中的肽段连接处C=O的伸缩振动引起

的; 酰胺II则产生于N.H面内弯曲振动和C—N伸缩振动结合引起的。在

2000.1000 cm。1范围内观察血红蛋白在CTS/nano.Ti02复合膜内的红外光谱。结

果如图4.1所示,天然血红蛋白的吸收带1655.34 cm。1和1535.80 cm。1(图4.1 a), 当血红蛋白在膜内的酰胺I和酰胺II红外吸收带分别在1654.25 cm-1和1539.46 era-1(图4—1 b),两者吸收带位置相差很少。从谱图的相似性可以认为Hb在

CTS/nano.Ti02膜内基本保持了其天然构象。

2∞0 t500 10∞ 2000 t500 1000

Wavenumber/cm。1

图4-1(a)血红蛋白和(b)CTS/nano.Ti02/Hb的红外光谱图

Fig.4-1 FT-IR spectra of Hb(a)and CTS/nano—Ti02/Hb Co)

4.2.2紫外可见吸收光谱图

在紫外可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红素蛋白质的

结构信息,尤其可以反映血红素辅基周围区域的构象情况,如果蛋白质的结构

发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失【4】。利用紫外可见吸收光谱考察了Hb 在nano.Ti02与CTS混合溶液中的光谱曲线,结果如图4.2所示。Hb在水溶液

中的Soret吸收带在409.0 Bin(曲线a);在pH为2.0时,m在nano.Ti02与CTS 混合溶液中的Soret吸收带在366.0 mn处(曲线d),说明Hb已经部分变性;在

pH 7.0和10.O时,助在nano.Ti02与CTS混合溶液中的Soret吸收带分别在407.0 nin和408.0 nIn(曲线b,c),与水溶液中Soret吸收带几乎相当,这表明Hb在 修饰膜中几乎保持原本构象,没有发生变性。

41

氧化还原蛋白质在离子液供/纳米材料复台体系中的直接电化学

300 4∞ 6∞ 600

w.I?n舛h忡m)

盈4-2皿红蛋白盔不同溶液中的紫”可见吸收光i营田

Fig 4-2UV-VIs absorption spectra of(a)Hbmw{lIer solution,(b—d)CTS/nano-TiOJHbin pHfb)7 0.(c)10 0。(d)2.0 PBS,respectively

4.2 3扫描电子显微镜图

用扫描电予显微镜考察了不同物质修饰的C1LE的表面形貌,结果如图4—3

所di。裸CILE表面为较光埽的平面r图片A1,主要是由丁高朴度的离子液体较

好地将碳粉粘合在起;修饰了lib的CILE表面明显被一层大分子所覆盖(罔

片B);修饰在CILE基底』J的nano.Ti02薄膜早现m颗粒状.粒径人约为100

nm(I划片c),这足由于13ano.Ti02本身是球形状颗植可能部分发生团聚。当在

CILE丛底上层层修饰上Hb、naflo—Ti02和CTS后,电极表面彤貌明显不同于

其它情况,表面的CTS将nailo—Ti02也埋,使其粒径进步增大(图片D)。

图4.3不同修饰电极的扫描电子昱微镜冒

Fig 4-3 SEMimages ofthe differenttypicalmodified electrodes

A CILE;B Hb/CILE;C㈣-Ti02/CILE;D CTSinano-Ti02/Hb/CILE

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4.2.4 Hb的直接电化学

图4-4 A和B是将不同的m修饰电极放入pH 7.0的PBS缓冲溶液中进

行循环伏安扫描图,扫速为100 mWs。裸CILE(曲线a)和CTS/nano.Ti02/CILE(I曲 线b)的循环伏安扫描都没有氧化还原峰出现,说明在电极表面上不存在电活性

物质。但是CTS/nano—TiOE/CILE比裸CILE的背景电流大,主要是由于电极表 面存在CTS/nano.Ti02增加了电极表面膜的厚度。在Hb/CILE(曲线c)也没有氧 化还原峰出现,主要是由于Fib在电极表面不稳定,并且很快能够溶解到PBS

缓冲溶液中。在CTS/Hb/CILE(曲线d)上出现一对氧化还原峰,该修饰电极电化 学响应较小且电极的稳定性较差。而在CTS/nano.Ti02/Hb/CILE上可观察到有 一对稳定且准可逆的氧化还原峰(曲线e),说明Ti02的存在能够有效地增强

Hb的电子传递过程,有效地缩短了被深埋于多肽链中心的电活性基团与电极之

间的距离,增加了导电的几率,增强了Hb与电极的电子传递,促进了氧化还

原反应的进行。

Hb修饰电极上峰电位分别为Epc=.0.479 V,Epa=.0.198 V(vs.SCE),式

电位(E0’)为.0.340 V,峰电位差(aEp)为281 mV,这对氧化还原峰是Hb中

血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的循环伏安峰,其Ipa/Ipc接近于1.0。这些现象都 可以说明Hb在电极上发生了明显的电子传递过程。在CTS/Hb/CILE,氧化还

原峰电位分别为.0.543 V和.0.225 V(vs.SCE),Eo--0.384 V,说明可逆性不如 曲线e好。

图4_4不同修饰膜电极的循环伏安图

Fig.4-4.(A)Cyclic voltammograms ofbare CILE(a),CTS/nano—Ti02/CILE(b),Hb/CILE(c),

CTS/Hb/CILE(d),and CTS/nano-Ti02/Hb/CILE(e)at the scan rate of 1 00 mV/s in pH 7.0 PBS.

(B)The background-subtracted cyclic voltammogram of CTS/Hb/CILE and

CTS/nano-Zi02&吣|CILE using data in curve b.

43

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

4.2.5扫描速度对Hb电化学响应的影响

考察了扫描速度对电化学响应的影响,其循环伏安曲线如图4—5所示。在

扫速10--400 mV/s范围内Hb在不同扫描速度下都得到了准可逆的循环伏安响

应,且随着扫速的增加,还原峰电位负移,氧化峰电位正移,但式电位基本不

变。根据准可逆薄层电化学过程的Laviron理论【5】,考察了Ep与logv的关系(如 图4-6所示),根据图中的线性关系和公式(1),(2),可以求得电子转移数n=O.93, 电子传递系数a=0.422,该结果符合准可逆过程特征。根据公式(3)可进一步

计算得出标准电极反应速率常数忽=O.117 s一。

酗=E0.一等l。g秒(1) 伽:Eo’+—黑log秒(2)

【l—a)nP logk,刊og”妒”酬别聆g,a1,。g罴Z.jj一(.f警,㈣3、

',-4r

-__■ \

H△

E/V

图4.5不同扫速下Hb在CTS/Ti02/CILE中的循环伏安图

Fig.4-5 Cyclic voltammograms of the Hb Oil CTS/Ti02/Hb/CILE in pH 7.0 PBS buffer. The scan rates from a to e are 1 0,50,1 00,1 50,200 mV/s,respectively

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日-0?2

U

氅-0。3

>

k-,

之m.4

_0.5

∞.6

-4.9 -4.2 .3.5 .2.8 -2.1 -1.4 —0.7

log吣心|昏

图4.6氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数logv之间的关系

Fig.4-6 nle relationship of the anodic(a)and cathodic(b)peak potential against logv 9

《6

o

≤3

a

O

.3

.6

.O 100 200 300 400

1)(mV/s)

图4.7氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速的关系曲线

Fig.4-7 The relationship bet、)I,een cathodic(a)and anodic(b)peak current with the SCan rate(v)

图4.7为峰电流与扫速的关系曲线,峰电流与扫描速度呈良好的线性关系,

表现出薄层电化学行为【6】。根据公式:Q=nAFF*,式中Q为积分电量,A为电

极表观面积,F为法拉第常数,n为电极反应电子转移数,r宰为电活性物质的

表面覆盖度。由此公式可以求得r宰为4.513x10一mol/cm2,本实验中固定在修 饰电极表面上的Hb的理论计算值为2.47x10一mol/cm2,因此参与电极反应的电 活性物质占电极表面Fib总量的15.07%,这比文献报道的值(2.0%)要高【7J。 45

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

4.2.6 pH值对Hb电化学行为的影响

研究了pH值对Hb在CTS/nano.Ti02/CILE上电化学行为的影响,随着溶液

pH值增大,CTS/nano。Ti02/CILE中舶的氧化还原峰电位均负移。当pH在

4.0—8.5范围内,Fib的电化学行为都比较稳定且准可逆的,式电位(Eo。)与pH值 呈良好线性关系(图4.8),其线性回归方程为E∥GO=-o.0379 pH一0.072(n=9, 间.993),这比20 oC可逆体系的理论值.56 mV要小,但仍能表明Fib发生一

个电子传递的同时还伴随着一个质子的转移[8】,其反应方程式如下所示【9】:

Hb heme Fe(III)+H++e。车?Hb heme Fe(II) (4)

而且实验结果表明测定溶液pH值对其电化学行为的影响是可逆的,即如

果把该Hb修饰电极从一种pH缓冲液转移到另一种pH缓冲液扫描,再回到

原先的溶液中得到的循环伏安图与原先基本一致。

旬.20

^‘V.‘J

U∽

兽43?30

、,一/

>

?、

o

固?o.35

4 5? 6 7 8 9

pH

图4-8式电位(Eo。)与pH的关系

Fig.4-8 The relationship be铆een the formal potential(Eo.)and pH,scan rate:1 00 rows

4.2.7对H202的催化活性

用循环伏安法考察了该Hb修饰薄膜电极对H202的电催化还原,在pH 7.O

的PBS缓冲溶液中加入H202后,在.0.445V出现新的还原峰,且随着H202的

加入,还原峰电流增大,而氧化峰几乎消失,这是电化学催化还原过程的特征

[101。而在同样条件下,裸电极和CTS/nano.Ti02/CILE电极在H202溶液中均未 观察到响应的还原电信号。说明被固定在CTS/nano.Ti02膜中的Hb能有效地发 生直接电子转移,而且保持了其生物电催化作用,能够催化H202还原。当H202 浓度在1.0x10"5~1.4x104mol/L范围内,催化电流与H202浓度呈线性关系(图

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4-9),其线性回归方程Iss(衅)=o.219C(I.tmol/L)+2.731(n=8,丫=0.998) 《

o

●_ 、?

叫10。5 rml/L

图4-9催化峰电流与H202的浓度的关系曲线

Fig.4-9 Plot of catalytic peak current versH$concentration of H202

表观米氏常数僻∥’是酶.底物反应动力学的重要指标,可以通过

Lineweaver-Burk方程的电化学表述形式来计算【11】:

1k=i1+罢Im C

=一十———zL一(\5o,)

ISS I㈣j 强

式中I。。是加底物后的稳态电流,c是底物的体积浓度,Inmx是饱和底物状

态下所测得的最大电流。用双倒数作图法(1/Ip~l/[H202])可以计算此催化反应

的表观米氏常数为4.192 luM。这比以前报道的一些基于血红蛋白的H202传感器的酽值为要低【12,131,表示酶的催化能力强。

4.2.8对TCA的电催化

三氯乙酸作为一种有机卤化物,稳定性强,难以在一般电极上被直接还原

去卤化。考察了Hb修饰电极对三氯乙酸(TCA)的电催化还原反应,结果如图

4.10所示。实验结果发现,当向pH 7.0除氧后的PBS缓冲溶液中加入TCA时, 在.0.646 V处出现一个新的不可逆的催化还原峰,并且在Hb Fe(III)还原电位 处的还原峰增大,同时伴随着Hb Fe(II)氧化峰的降低或消失(图4.10)。图4.10 中曲线c为CTS/nano.Ti02/Hb/CILE在空白PBS缓冲溶液中的循环伏安曲线, 曲线a为CTS/nano.Ti02/CILE在0 mol/L TCA中的循环伏安曲线;曲线b为

CTS/nano.Ti02/CILE在1.6x 10。2 mol/L TCA中的循环伏安曲线,可以看在扫描 47

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

的电位范围内,没有任何氧化还原峰,TCA未能被还原。曲线d.=j分别为加入

O.4, 1.O,2.O,4.O,10,12,32 mmol/L的TCA后的测定结果。说明

CTS/nano.Ti02/Hb/CILE中Hb能使稳定性高的三氯乙酸在较正的电位范围内电 催化还原。在1.O?104“.O?10。3 mol/L范围内催化峰电流与TCA浓度呈线性关 系,其线性回归方程为Iss(mA)=0.96C(mmol/L)+0.136(n=9,T---0.997),检测限 为4.0x 10~mol/L(30)。

f^

k.一

-’、、△

卜_■

图4.10 Hb修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图

Fig.4-1 0 Cyclic voltammograms of CTS/Nano-Ti02/Hb/CILE in O.I mol/L pH 7.0 PBS

containing(a)0 and(b)1.6x 1 0。2 mol/L TCA solution,and CTS/Nano.Ti02/Hb/CILE in O.1

mol/L pH 7.0 PBS containing 0,4.0x104,1.0x10一,2.0x10~,4.0xlO一,1.0x10~,

1.2x10一,3.2

x l 0之mol/L TCA(curve c-j),respectively,with the scan rate as 100 mV/s. 根据方程(5)可求出表观米氏常数为0.281 mmol/L,这比Zhang等㈣报道的基于Hb的三氯乙酸传感器的酽值要低,说明Hb在CTS/nano.Ti02膜内具

有很高的电活性。根据文献【151,Hb对TCA可能的催化机理如下所示:

Hb Fe(III)+H++e。H Hb Fe(II)at electrode

C13CCOOH H C13CCOO‘+H+pKa=O.89

2[Hb Fe(II)]+C13CCOOH+H+一2[Hb Fe(III)]+C12HCCOOH+C1.

(6)

(7)

(8)

4.2.9电化学交流阻抗谱图

电化学阻抗法能反映电极表面修饰过程中阻抗变化的信息。图4.11分别为

裸CILE(曲线a),nano—Ti02/CILE(曲线b),CTS/CILE(曲线c),Hb/CILE(曲

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线d),CTS/Hb/CILE(曲线e)和CTS/nano.Ti02/Hb/CILE(曲线f)的电化学阻 抗谱图。在裸CILE(曲线a)上电子传递电阻(Ret)为1lO Q,由于离子液体的

存在而具有高的导电性,电阻较小。相对于裸CILE,修饰有nano.Ti02的CILE, 阻抗明显增大(曲线b),其为Ret值为165 Q,主要是由于nano.Ti02是一种半

导体材料;修饰有CTS的CILE其阻抗值进一步增大(曲线c),说明CTS的存

在能够阻碍电子转移;修饰有Fib的CILE其阻抗值增大到322 Q(曲线d),比

CTS/CILE阻抗值进一步增大。当CTS修饰Hb/CILE上时(曲线e),其Ret值为

383 Q,说明Fib被成功地固定到了电极表面上;当修饰上CTS和nano.Ti02进

一步修饰到Hb/CILE(曲线f)时,其阻抗值为520 Q,这是由于生物大分子Hb

的不导电性和纳米粒子的存在,增大了电子传递电阻,同时修饰膜的厚度增大, 也阻碍电子的传递。

Z’/Q

图4.11不同修饰电极的交流阻抗谱图

Fig.4—1 1 Electrochemical impedance spectroscopy for bare CILE(a),nano-Ti02/CILE(b),

CTS/CILE(c),Hb/CILE(d),CTS/Hb/CILE(e)and CTS/nano-Ti02/Hb/CILE(f)in the presence

of 10.0 mmol/L[Fe(CN)6】3脾and O.1 too/L-1 KCl with the frequencies swept from 105 tO 10之

Hz.

同时考察了不同修饰电极在10.0 mol/L[Fe(CN)6】3“‘溶液中的循环伏安曲

线,结果如图4.12所示,在裸电极上出现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线a), 而在CTS/Hb修饰的CILE上,峰电流明显减小,而且峰电位变大,式电位也增

大(曲线e),说明Hb的存在阻碍[Fe(CN)6】3粕‘扩散到电极表面,而在

CTS/nano.Ti02/Hb修饰的CILE上,峰电流比CTS/Hb修饰的CILE上的峰电流 49

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

更小(曲线0,说明CTS,nano.Ti02和Hb的存在能够阻碍电子转移,使得

[Fe(CN)6]3描’到达电极表面的阻力更大。当nano.Ti02涂布到电极表面时,峰电 流比裸CILE小(曲线b),主要是因为mno.Ti02是一种半导体纳米材料的缘故。

而在CTS/CILE(曲线c),峰电流比nano.Ti02/CILE进一步减小,主要是由于CTS 能够阻碍电子转移。与CTS/CILE相比,Hb/CILE(曲线d)峰电流进一步减小,

说明Hb的存在增加了电极表面膜的厚度,阻碍了电子的转移。这与电化学交

流阻抗谱图得到的结果一致,说明Hb被成功地固定到电极的表面上。

'

o

一?

图4.12不同修饰电极的循环伏安图

Fig.4-12 Cyclic voltammograms ofbare CILE(a),nal'lo—TiOJCILE(b),CTS/CILE(c), Hb/CILE(d),CTS/Hb/CILE(e)and CTS/nano—Ti02/Hb/CILE(0 in 0.1 mol/L KCl solution

containing 10.0 mmoFL K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6】(1:1).Scan rate:100 mV/s.

4.3本章小结

采用离子液体BMIMPF6修饰碳糊电极作为基底电极,利用CTS/nano.Ti02

复合膜将Hb固定于CILE表面上,考察了Hb在该修饰膜中的直接电化学及电

催化行为。实验结果表明BMIMPF6的存在有利于提高碳糊电极的导电性,利

用扫描电镜观察了不同修饰电极的表面形貌,光谱实验表明Hb在

CTS/nano.Ti02膜中保持了其天然构象,利用电化学法详细研究了Hb在

CTS/nano.Ti02膜中的电化学行为,求解出电化学参数为,电子转移数n=-0.92, 电子传递系数a=0.422,反应速率常数岛=0.1 1 7 S一,且在CTS/nano.Ti02膜中 的Fib对H202、TCA表现出良好的电催化行为。

青岛科技大学研究生学位论文

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51

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

第五章血红蛋白在SWCNTs/离子液体修饰碳糊电极中的直

接电化学和电催化行为

摘要:以室温离子液体BMIMPF6为粘合剂制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE), 并进一步采用单壁碳纳米管(SWCNTs)修饰到电极表面上,制备了SWCNTs/CILE。 然后用Nation将血红蛋白(m)固定到该碳纳米管修饰电极上,得到

Nafion/Hb/SWCNTs/CILE。采用紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱等对膜 内Hb的性质进行了研究,结果表明Hb在膜内基本保持了其生物活性,没有发生

变性。用循环伏安法对Hb的电化学和电催化性质进行了研究,结果表明在pH 7.0 的PBS缓冲溶液中循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰,为Hb血红素辅

基Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰,其式电位(E∥)为一0.306 V(vs.SCE)。利用电化学方 法求解了相应的电化学参数,其中电子转移数n为0.989,电子传递系数a为0.34, 反应速率常数砖为0.538 s~,该修饰电极对三氯乙酸(TCA)有良好的电催化效果, 检测浓度范围为20.0.150.0 mmol/L,检测限为10.0 mmol/L(30)。

关键词:血红蛋白;单壁碳纳米管;BMIMPF6;碳糊电极;直接电化学;电催

氧化还原蛋白质的空间结构庞大,电活性中心不易暴露,因此需要借助电

子传递媒介体【l】、促进剂【2】或特殊电极材料【3】才能实现与固体电极之间的直接电 子交换。对氧化还原蛋白质在电极上的直接电化学研究,为开发新型生物传感

器提供理论指导。

Nation是一种全氟化阳离子交换剂,Nation膜由氟碳骨架和许多项端为磺

酸根离子(.S03-)的侧链构成,由于.S03‘,离子束的静电作用,Nation膜可以通 过离子交换牢固地固定一些电活性物质[41。自从19xx年日本Iijima教授在高分 辨率透射电镜下发现CNT以来【5】,由于其特殊的结构和独特的物理、化学、电

学特性以及潜在的应用前景而倍受人们关注。CNT作为电极修饰材料使用时,

其优良的导电性能很好地促进电活性物质的电子传递,而且可以使生物酶在电

极表面和电极之间发生有效的直接电子转移并保持其生物电催化活性。北京大

学的李南强等【6J人将单壁碳纳米管涂布在玻碳电极表面制备了单壁碳纳米管修 饰电极并研究了其电化学行为,这种修饰电极具有明显的促进生物分子电子传

52

青岛科技大学研究生学位论文

递作用的电催化性能。

本文制备了离子液体BMIMPF6修饰的碳糊电极,并将SWCNTs、Hb和

Nation层层涂布到该修饰电极表面制备出相应的修饰电极,实现了Hb的有效

固定,详细研究了Hb在该修饰电极上的直接电化学和电催化行为。

5.1实验部分

5.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:自制修饰电

极(①=4.0 mm)为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为辅助 电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Varian公司);Tensor 27 型FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司);JSM.6700F型扫描电子显微镜(日本电 子株式会社);pHs.25C型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

牛血红蛋白(生化纯,分子量为64500,天津市川页生化制品有限公司,20.0 mg/mL储备液,40C冰箱保存);1.丁基.3.甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6,杭

州科默化学有限公司,分子量284.18,熔点120C,密度1.37 g/cm,粘度281 cp); 单壁碳纳米管(SWCNTs,深圳纳米港有限公司,纯度>95%,内直径<10 nln,

长度为5~151am,灰分<o.2%,比表面积40~300 m2儋);Nation(0.5%乙醇溶液, 美国Sigma公司);石墨粉(上海胶体化学厂,颗粒度≤30lam);三氯乙酸(TCA, 天津市科密欧化学试剂开发中心);铁氰化钾(天津市瑞金特化学品有限公司); 0.1 mol/L磷酸盐(PBS)系列缓冲溶液,所用其它试剂均为分析纯,实验用水为 二次蒸馏水,在电化学测定前必须向电解质溶液中通N2 20 min除氧,并在N2 氛下进行测定。

5.1.2 Nafion/Hb/SWCNTs/CILE的制备

离子液体BMIMPF6修饰碳糊电极(CILE)的制备方法见第二章2.1.2。

取20 pL浓度为O.1∥L的SWCNTs悬浮液涂布到处理好的CILE表面,自

然晾干后再在电极表面上涂布10 pL浓度为20.0 mg/mL的Hb溶液,自然晾干, 最后涂布8 pL 0.5%的Nation溶液到电极表面,自然晾干后就得到了所要制 备的Nafioll/Hb/SWCNT§/CILE。

所制备的修饰电极在pH 7.0的PBS缓冲溶液中进行循环伏安扫描,研究

Hb在CILE表面的直接电化学行为。

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

5.2结果与讨论

5.2.1紫外可见吸收光谱图

在紫外可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红素蛋白质的

结构信息【7】,如果蛋白质的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失【81。用 紫外可见吸收光谱考察了Hb在SWCNTs与Nation混合溶液中的结构变化,结

果如图5.1所示。Hb在水溶液中的Soret吸收带在405.9 nm处(曲线a);在pH 为7.0和10.0时,Hb在SWCNTs与Nation混合溶液中的Soret吸收带均在407.0 am(曲线b,c),与水溶液中Soret吸收带几乎相当,这表明Hb在修饰膜中几乎 保持原本构象,没有发生变性。而pH值为2.0时,Hb、SWCNTs与Nation

混合溶液的Soret吸收带在368.9 nin处且吸收强度降低(曲线d),表明此时Hb 在某种程度上有所变性。

o

o

8

300 400 500 800

Wax,elei喀th/nm

图5-1 Hb在不同溶液中的紫外可见吸收光谱图

Fig.5-1 UV-Vis absorption spectra of(a)Hb in water solution,(b—d)NafioI棚b/SWCNTs in pH

(b)7.0,(c)1 0.0 and(d)2.0 PBS,respectively

5.2.2傅立叶变换红外光谱图

FT-IR也可以用于检测蛋白质的结构信息,蛋白质的酰胺I和酰胺II红外

吸收带可以提供多肽链二级结构的信剧91,如果蛋白质变性,酰胺I和酰胺II 两个吸收带会显著改变甚至消失。酰胺I(1700.1600 cmJ)是由蛋白质肽链骨架中

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的肽段链接处C=O的伸缩振动引起的:酰胺1I(1620.1500 cm-。)则产生于N.H 弯曲和C.N伸缩。图5.2是Hb和N瓶。们拍/SWCNTs复合膜的傅立叶变换红 外谱图。从图中可以看出,Nafiorl/Hb/SWCNTs复合膜的酰胺I和酰胺II特征吸

收带分别为1654.32 cm一,1534。66 cm"1和lib固有的特征吸收带(1655.34 cm-1 和1535.80 cm"11是基本一致的。这两个谱图的相似说明NafioIl/Hb/SWCNTs复 合膜中的Hb保持了其固有的二级结构的本质特征,显示了N瓶oⅣSWCNTs复 合膜对Hb具有很好的生物相容性。酰胺I吸收带位置的轻微移动(从1655.34

cm’1到1654.32 cm。1)说明研)和NafioIl/SWCNTs之间有相互作用,这种相互作 用可能是有静电力,氢键以及亲疏水相互作用引起的。

2000 1500 1000 2∞0 1500 10130

Wayenumber/cm一1

图5-2(a)血红蛋白和(b)Nafion/Hb/SWCNTs的红外光谱图

Fig.5-2 FT-IR spectra of(a)Hb and(b)Nafion/Hb/SWCNTs

5.2.3扫描电子显微镜图

扫描电子显微镜可以考察电极表面的形貌情况。不同电极的扫描电镜如图

5.3所示。裸CILE表面为较光滑的平面(图片A),主要是由于离子液体较好地 将碳粉粘合在一起;修饰了Hb的CILE表面明显被一层大分子所覆盖(图片

B);修饰在CILE基底上的SWCNTs呈现出球形的颗粒和长条状(图片C),这是 由于SWCNTs本身是管状颗粒可能部分发生团聚。当在CILE基底上层层修饰

上Hb、SWCNTs和Nation后,电极表面形貌明显不同于其它情况,表面的Nation 将Hb和SWCNTs包埋(图片D)。

55

一摹D茧#薯su霸占

氧化还原蛋白质在离子液体,纳米材料复合体系中的直接电化学

图5-3不同修饰电极的扫描电子昱擞镜周

Fig 5-3 SEMimages ofthe differenttypica}modified elecⅡodes

A)CILE;(B)HblCILE;(C)SWCNTsICILE and(D)NaflorgHb/SWCNTs

5 2.4 Hb在Nafion/SWCNTs/CILE中的直接电化学行为

罔5-4{正示了不同修饰电椴在pH 7.0的PBS缓冲溶液中的循环伏安图,在

裸CILE(曲线a)和SWCNTs/CILE上没有氧化还原峰m现(曲线b),酏明电极表 曲币存存任何电活性物质,世足背景电流变天,这是山于电极表面的SWCNTs

进一步增大了电极的电容电流。存Nafioll,Hb/CILE(曲线c)上,出现一对峰形较 小的氧化还原峰,说明Hb在屯极表面j。发生了直接电子转移,但是电子转移 速率较慢,电化学啊应较小。向在Nanon,Hb,swcNTs/cILE(曲线d)上,电化学 响应明显增大,出现对峰形良好的准可逆的氧化还原峰。l驸极峰电位(Epc)和

阳极峰电fF(Epa)分别为一0.412V和一0 199V(vs SCE).Hb的式电位(Eu)为一0 306 V fw SCE),这是Hb辅基Fe(1lI)/Fe(1]1IU对的氧化还原特征峰¨.,由此说明碳 纳米管独特的物理化学性质为血红蛋白提洪了一十良好的微环境,有效地缩短 了被深埋丁多肽链中的电活性基团与电极之M的距离,增强了血红蛋白与电极 的直接电子传递,促进了氧化还原反应的进行。

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2

2

2

乒{

b 1

■0

主0

H 0

.0

.0

.O

-1

.1

.1

E/V

图5.4不同修饰电极的循环伏安图

F逸.5_4 Cyclic voltammograms of(a)bare CILE,(b)SWCNTs/CILE,(c)Nafion/Hb/CILE and(d)

Nafion/Hb/SWCNTs/CILE at the scan rate of 200 mV/s in pH 7.0 PBS buffer

5.2.5扫描速度对Hb电化学行为的影响

考察了扫速对循环伏安响应的影响,结果如图5—5所示。在扫速80~700 mV/s

范围内,氧化还原峰电流随扫速的增加而线性增an(图5.6),线性回归方程分别Ipc

(pA)=2.0011)(V/s)+0.046(n=15,y=0.993),Ipa舢A)=-1.820 1)(V/s)一0.26(n=15, FO.990),表现出表面控制薄层电化学行为。对于薄层电化学来说,电活性的Hb Fe(III)或Hb Fe(II)在发生还原或氧化反应时,通过电极的总电量与扫速无关,根 据公式:Q=nAFF*,可得到电活性物质的表面覆盖度,式中n为电活性物质发生

电极反应时的电子转移数,F为法拉第常数,A为电极面积(cm2),r宰为电活性物

质的表面覆盖度(mol/cm2)。在pH 7.0的缓冲溶液中,在80~700 mV/s的扫描范围 内,Hb Fe(III)还原的阴极峰面积基本不变,求得Nafion/Hb/SWCNTs/CILE中电 活性Hb的表面覆盖度(r卑)为3.65x10-9 moYcm2。固定在修饰电极表面上的Hb的

理论计算值为2.47x 10。8 mol/cm2,因此参与电极反应的电活性物质占电极表面Hb 总量的14.8%,该值比文献报道值要大【11】。

57

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

乒。一

、、

一●_

H

E/V

图5-5不同扫速下Nafion/Hb/SWCNTs/CILE中的循环伏安图

Fig.5-5 Cyclic voltammograms Oil Nafion/Hb/SWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS buffer. The scan rates台oln a to h are 100,150,200,300,400,500,600,700 mV/s,respectively

1)(V/s)

图5-6氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速的关系曲线

Fig.5-6 Plots of cathodic(a)and anodic(b)peak current with the scail rate(v) 随着扫速的增大,氧化峰电位正移,还原峰电位负移,并且AEp也逐渐变

大。氧化还原峰电位与lnv成线性关系,其线性回归方程为Epa(V)-0.0373

lnv-0.180(n=11,y---O.993)和Epc(V)二O.0751 lnv一0.525(n=11,y---o.996)。根据准

可逆薄层电化学过程的Laviron理论【12,13】和相应的公式,

58

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(1)

(2) logks=alog”妒”叫啷-109,丽Z, RTV一厶紫jA1 (f3)、3

根据公式(1)和(2)可以求得电子转移数11为0.898,电子传递系数a为0.34,基 于公式(3)可以进一步求得反应速率常数忽为0.538 S一。

5.2.6对TCA的电催化还原

用循环伏安法考察了Nafioll/】胁/SWCNTs/CILE对三氯乙酸(TCA)的电催化

作用。图5.7为Na矗on门曲/SWCNTs/CILE在不同浓度的TCA存在时的循环伏

安图。当将TCA加入pH 7.0的PBS后时,N瓶oIl/】拍/SwCNTs/CILE在一0.285 V (w.SCE)处Hb Fe(III)的还原峰明显增大,伴随着Hb Fe(II)的氧化峰的减小(曲 线a-i)。说明Nafion/】如/SWCNTs/CILE对TCA表现了较强的电催化活性, 司

n

o一

、、

一■_

E/V

图5.7 Hbff#4"午电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图

Fig.5.7 Cyclic voltammograms of Nafion/Hb/SWCNTs/CILE in O.1 moVL pH 7.0 PBS containing 0,3.5,3.8,4.4,4.8,5.3,7.3,14.0,16.0 mmol/L TCA(curve a-i)

respectively,with the scan rate as 200 mV/s

59

t‘

L

》%h

.一

一0

O

P

=

E

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

随着TCA浓度的增大,还原峰电流也相应变大,还原峰电流与溶液中TCA的

浓度在20.0—150.0 mmol/L之间呈线性关系,其线性回归方程为Ip(mA)=3.87 C (mmol/L)+0.013(n=13,y=0.999),检测限为10.0 mmol/L(30)。表观米氏常数酽) 是酶.底物反应动力学的重要指标,可以通过根据Lineweaver-Burk方程的电化学表 述形式来计算【16】: .

一一=一1+—=—上—=+二堕_一●H珥)-

I嚣I—I僦C 一

式中Is。是加底物后的稳态电流,C是底物的体积浓度,I。懈是饱和底物状态下

所测得的最大电流。根据氧化还原峰电流和TCA浓度的斜率和截据的关系,可以计算此催化反应的表观米氏常数酽)为2.013 mmol/L,该值比文献报道值

47.0 mmol/L要小[171。

5.2.7电化学交流阻抗曲线

电化学交流阻抗是反映电极表面修饰过程的一种重要手段。电子转移阻抗

值(Ret)反映了电极表面传递电子的能力,所以可以用Ret来描述电极界面的性

质。图5-8分别是不同修饰电极在O.1 mol/LKCl,包含10.0 mmol/L[Fe(CN)6]争 和10.0 mmol/L[Fe(CN)6】舢,频率范围为105~10。2 Hz的阻抗谱图。在裸CILE(曲 线a)上,其Ret为103.2 Q。当Nation涂布到CILE上时(曲线b),Ret值明显增 大,主要是由于Nation膜的存在能阻碍电子转移。而修饰有碳纳米管的CILE

上的电子传递电阻在高低频率范围内均近似为一条直线(曲线c),这是由于碳纳 米管高的导电性,使得铁氰化钾很容易到达电极表面发生电子转移。在

Nafion/Hb/SWCNTs/CILE上(曲线d)Ret值为203.0 Q,介于Nafion/CILE和 SWCNTS/CILE之间,说明Hb被成功地固定到该修饰电极的表面上。

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a

>

Z‘/Q

图5-8不同修饰电极的交流阻抗谱图

Fig.5-8 Electrochemical impedance spectroscopy for(a)bare CILE,(b)Nafion/CILE,(c)

SWCNTs/CILE and(d)Nafion/Hb/SWCNTs/CILE in the presence of 10.0 mmol/L[Fe(CN)6]3摊

and O.1 moFL KCl with the frequencies swept from 105 to 102 Hz.

5.2.8 N蚯on,Hb/SWCNTs电极的稳定性和重现性

考察了Nafi011/Hb/SWCNTs/CILE的稳定性,在pH 7.0的PBS中的循环伏

安,扫描50圈之后,氧化还原峰电流几乎没有任何的降低,说明

NajcioIl/Hb/SWCNTs/CILE在该缓冲溶液中具有较好的重现性。将该修饰电极放 入4 oC pH 7.0 PBS中30天,峰电流降低4.0%,说明Nafio棚b/SWCNTs具有 较长时间的稳定性,主要是由于Nation和SWCNTs为Hb提供了一个较稳定的

微环境。

5.3本章小结

以离子液体修饰碳糊电极(CILE)作为基底电极,用SWCNTs修饰该电极来研

究了Hb的直接电化学和电催化行为。光谱实验表明,Hb在该修饰电极上保持了其 生物活性。电化学实验表明,其循环伏安曲线表现出一对准可逆的氧化还原峰, 说明Hb能够有效地进行直接电子传递过程。同时该修饰电极对三氯乙酸(TCA)表

现出良好的电催化作用。

61

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

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氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

第六章PVA/Hb/MWCNTs/离子液体EMIMBF4修饰碳糊电

极的直接电化学与电催化

摘要:研究了血红蛋白(Hb)在多壁碳纳米管(MWCNTs)修饰的离子液体碳糊电

极(CILE)上的电化学行为。以亲水性的离子液体1.乙基.3一甲基咪唑四氟硼酸盐 (EMIMBF4)为修饰剂,制备了离子液体碳糊电极,进一步采用MWCNTs进行表 面修饰制备了MWCNTs/CILE。采用层层涂布的方法,利用聚乙烯醇(PVA)将 Hb固定到电极表面,制备了PvA/Hb/MWCNTs/CILE。利用电化学方法、光谱 方法和扫描电子显微镜对包埋在膜内的Hb的性质进行了研究和表征。实验结 果表明Fib在膜内保存了其生物活性。电化学实验表明循环伏安图中出现一对

准可逆的氧化还原峰,为Hb血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰。求解了相 关的电化学参数,其中电子转移数n=1.37,电子转移系数a=0.49,反应速率常 数岛=1.054 s~。考察了该修饰电极对H202和TCA的电催化行为, 结果令人 满意。.

关键词:血红蛋白;EMIMBF4;多壁碳纳米管(MWCNTs);碳糊电极;直接电 化学

由于纳米材料具有独特的物理化学性质如比表面积大、反应活性高、易于与

其它物质交换电子等,因此被广泛应用于电分析化学领域【l'2】,特别是碳纳米管

【3捌,在生物分析领域特别有吸引力,因为它不仅具有高的比表面积,非毒性、生 物相容性较好、容易构造、化学和光化学稳定性高等优点,而且具有极好的导电 性和电化学催化活性。室温离子液体的诸多优点也吸引了越来越多的研究者的目 光。目前在离子液体的分析应用方面比较有效的方式是将离子液体与传统的材料 相结合,形成独特的既保持传统材料的优点又具有离子液体优势的复合材料,如 室温离子液体/碳纳米管复合材料6’¨。

本文以离子液体1.乙基.3.甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)修饰碳糊电极 (CILE)为基底电极,用聚乙烯醇(PVA)和多壁碳纳米管(MWCNTs)为固定材料将血 红蛋白(Hb)固定于CILE表面,利用光谱和电化学等手段对Hb在复合膜中的电化学 和电催化性质进行了研究。实验结果表明,在PVA膜中Hb保持了良好的分子构象 和生物活性,电化学扫描表现出一对准可逆的氧化还原峰,该修饰电极对H202和

青岛科技大学研究生学位论文

三氯乙酸(TCA)表现出较好的电催化性能。

6.1实验部分

6.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:自制修饰电

极(西=4.0 mm)为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝电极为辅助 电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Vafian公司);Tensor 27 型FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司);JSM.6700F型扫描电子显微镜(日本电 子株式会社);pHs.25C型酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。

牛血红蛋白(Hb,生化纯,分子量为64500,天津市川页生化制品有限公司);

1.乙基.3.甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4,杭州科默化学有限公司);多壁碳纳 米管(MWCNTs,纯度>95%,深圳纳米港);聚乙烯醇(PVA,聚合度7500,MW. 14000,天津市博迪化工有限公司);石墨粉(上海胶体化工厂,颗粒度_<301xm); 过氧化氢(H202,30%,天津市巴斯夫化工有限公司);三氯乙酸(TCA,天津市 科密欧化学试剂开发中心);O.1 mol/L磷酸系列缓冲溶液(PBS),所用试剂均 为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。在电化学测定前必须向缓冲溶液中通高纯 N2 30 min除氧,并在N2氛下进行测定。

6.1.2 PVrA/Hb/MWCNTs/CILE的制备

将O.15 mL EMIMBF4,0.85 mL液体石蜡和3.2 g石墨粉放入研钵研磨均 匀,将混合物填入玻璃管中压实,内插铜线作为导线,即可得到离子液体修饰 一碳糊电极(CILE)。

取3.0 gL 1.0 mg/mL的MWCNTs悬浊液涂布到CILE表面自然晾干后,

再在电极上涂布10.0 lxL 20.0 mg/mL的Hb溶液到MWCNTs表面,自然晾干 后,最后涂布10.0此PVA(2.0 mg/mL)溶液到电极表面,自然晾干后就得到了 所要制备的修饰电极PVA/Hb/MWCNTs/CILE。

6.2结果与讨论

6.2.1紫外可见吸收光谱图

65

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

在紫外可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红素蛋白质的

结构信息,如果蛋白质的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失。紫外

可见吸收光谱考察了Hb在PVA与MWCNTs混合溶液中的结构变化,结果如

图6.1所示。Hb在水溶液中的Soret吸收带在406.0 nm(曲线a);在pH为5.0, 7.0和10.0时,Hb在PVA与MWCNTs混合溶液中的Soret吸收带均在406.0

rim(曲线b, c,m,与水溶液中的Soret吸收完全一样,这表明Hb在修饰膜

内没有发生变性,较好的保持了原始构象。而在pH为2.0时,Hb在PVA与

MWCNTs混合溶液中的Soret吸收带在372.1 am处(曲线e),说明Hb已经部分

发生变性。

25

ZO

蛊1.5

1.O

o.5

300 400 500 6∞

Wavelength(nm)

图6.1 Hb在不同溶液中的紫外一可见吸收光谱图

Fig.6-l UV-Vis absorption spectra of Hb in water(a)and PVA/Hb/MWCNTs witll pH(b)5.0,

(c)7.0,(d)10.0,(e)2.0 PBS,respectively

6.2.2傅立叶变换红外光谱图

FT-IR也可用于检测蛋白质的结构信息,蛋白质的酰胺I和酰胺II红外吸

收带可以提供多肽链二级结构的信息【8J,如果蛋白质变性,酰胺I和酰胺II两 个吸收带会显著改变甚至消失。酰胺I(1700.1600 cm"1)是由蛋白质肽链骨架中 的肽段连接处C=O的伸缩振动引起的:酰胺II(1620.1500 cmq)则产生于N.H 弯曲和C.N伸缩。在2000.1000 cm以范围内观察血红蛋白在多壁碳纳米管和聚 乙烯醇膜内的红外光谱,结果如图6.2所示。血红蛋白在膜内的酰胺I和酰胺

II红外吸收带分别在1653.55 cm以和1538.66 cm?(图b),和天然血红蛋白的吸 收带1655.34 cm以和1535.80 cm。(图a)很接近。从谱图的相似性可以认为Hb在 多壁碳纳米管/聚乙烯醇膜内基本保持了其天然构象。

∞∞1∞o¨'.o

Wavenumber,cm。1

图6-2不同修饰电极的红外光谱囝

Fig 6-2 FT-IR spectra of(aJIib and(b)PVAIHb/MWCNTsfilm

6.2 3扫描电子显微镜图

扫描电了显微镜可以考察电极表面的形貌情况,图6—3是不同物质修饰

CILE的表血形貌。掺杂EMIMBF4修饰电极为连续光滑的界面(罔H a),这是 囚为离子被雄的耕度较人,能够很好的把碳粉料台在一起,从而形成光滑的界 向。图片b是在电极表而涂布多壁碳纳米管,电极表咖有许多的管状的物质覆 盖在表面。修饰了Hb的MWCNTs/CILE表面明显被一层大分子所覆盖f幽片 c):赴Hb的基础r涂布PVA的CILE表面形貌明显发生了改变,有一层膜状的 物质(图片d),可以看到有膜状物质覆盖在电极表面。

(a) fb) (c1 fd)

图6-3不同修饰电极的扫描电子显微镜图

Fig 6—3 SEM images of(a)CILE,(b)MWCNTs/CILE,(c)Hb/MWCNT目'CILE and(d) PVA/Hb/MWCNTs/CILE

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

6.2.4 Hb在PⅥVMWCNTs/CILE中的直接电化学行为

图6_4显示了不同修饰电极在pH 7.0的PBS缓冲溶液中进行循环伏安扫

描曲线,扫速为200 mV/s。在裸CILE(曲线a)、PVA/CILE(曲线b)和

MWCNTs/CILE(曲线c)上的循环伏安扫描都没有出现任何氧化还原峰,说明电

极上没有可以发生电子转移的物质,而在PVA/Hb/CILE(曲线d)上,出现一对

峰形较小且不对称的氧化还原峰,说明Hb能够在电极上实现直接电子转移。

与之对比,在PVA/Hb/MWCNTs/CILE(曲线e)上,Hb的电化学响应提高,出

现一对稳定的峰形良好的准可逆氧化还原峰,可以说明这一对氧化还原峰是Hb

的血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的氧化还原峰。这说明不同的修饰膜材料对电 极的微环境有不同的影响,MWCNTs的存在能够更有效的促进Hb与电极之间

的直接电子转移。

●^

o一

、、盘

E/V(vs.scE)

图6.4不同修饰膜电极的循环伏安图

Fig.6-4 Cyclic voltammograms of(a)bare CILE,(b)PVA/CILE,(c)MWCNTs/CILE,(d) PVA/Hb/CILE and(e)PVA/Hb/MWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS at the scan rate of 200 mV/s

由伏安图中可以计算出,该氧化还原峰电位分别为Epc=-0.436 V,Epa:-0.303

V(vs.SCE),式电位(Eo’)根据公式Eot-(Epa+Epc)/2可计算为.0.370 V(vs.SCE), 电位差(△Ep)为133 mV,实验结果表明,Hb在PVA/MWCNTs/CILE_E实现了直接

电子转移。

6.2.5扫描速度对Hb电化学响应的影晌

青岛科技大学研究生学位论文

图6.5是PVA/Hb/MWCNTs/CILE在不同扫速下的循环伏安曲线,在扫速

50~800 mV/s范围内均可得到一对氧化还原峰,这表明膜中电活性的Hb Fe(III) 均被还原为Hb Fe(II),而在反扫过程中电活性的Hb Fe(II)又被氧化为Hb Fe(III)。 氧化还原峰电流与扫速成线性关系(图6-6所示),其线性回归方程分别为Ipc mA)

=0.0054v(V/s)+o.558(n=21,y--O.999)和Ipa(pA)--0.0058u(V/s)一0.326(n=21, T--0.995),表现出薄层电化学行为【91,说明在该扫速范围内电极反应是吸附控制 的过程。

乒。一

、、

H

E/V

图6-5不同扫速下Hb在PVA/Hb/WMCNTs/CILE中的循环伏安图

Fig.6-5 Cyclic voltammograms of PVA/Hb/MWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS wi吐l the scan rates嬲

50,100,1 50,200,250,300,350,400,450,500,550 mV/s(from a to k),respectively

4.5

3.0

‘各1.5

善0.0

-1.5

.3.0

.4.5

O 150 300 450 600 750

1)(V s-1)

图6-6氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速的关系曲线

Fig.6-6 Plots of cathodic(a)and anodic(b)peak current with the stall rate(v)

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

在扫速100~500 mV/s范围内,氧化还原峰电流随扫速的增加而线性增加,

而积分电量基本不变,根据公式:Q=nAFF*,式中Q为积分电量,A为电极表

观面积,F为法拉第常数,n为电极反应电子转移数,r木为电活性物质的表面

覆盖度。由此公式可以求得11木为3.5x10一mol/cm2。在实验中固定在修饰电极表 面上的Hb的总浓度为2.47x10一mol/cm2,因此参与电极反应的m占电极表面

Hb总量的14.2%。

由图6-5可以看出△Ep也随扫速的增大而变大,当nAEp>200 mV时,根

据准可逆薄层电化学过程的Laviron理论【10】和图6.7的线性关系,

%=EO,丽RT 111口(1)

%趔‘+篙≥111口(2)

109ks=tzlog(1一叻+(1一却1。g口一l。g嚅2.3RT)一以1一口’inFjA万Ev (3) ,彬秒厶j』(』

可求得电子转移数n≈1,电子传递系数a=0.490。根据公式(3)可计算得出

反应速率常数忽=1.054 s~。

岔U

、-/

之幽

aro(u/vsl)

图6.7氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数Inv之间的关系

Fig.6-7 Linear relationship of the peak potential of Epa(a)and Epc(b)versus lnD for PVA/Hb/MWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS buffer

70

青岛科技大学研究生学位论文

6.2.6 pH值对Hb电化学行为的影响

P、後/Hb/MWCNTs/CILE的循环伏安行为在很大程度上受到外部缓冲溶液

pH值的影响。随着溶液pH值增大,P、,A/MwcNTs/cILE中Hb的氧化还原峰

电位均负移,而且此变化在pH 3.5.9.0的范围内是可逆的。在pH 4.0.10.0的 范围内lib的电化学行为都比较稳定而且是准可逆的,式电位(E0’)与pH值呈良 好的线性关系(图6.8),线性回归方程为E盯(V)二0.0422 pH.0.0305(n=13, 7=0.998),斜率为42.2 mV/pH,这比200C可逆体系的理论值.56 mV要小,原 因可能是HbFe(II)的水合作用以及氨基酸残基与血红素形成的氢键影响Hb的

电势值。

,.一、

【口

U∽

、__一,

>

?-\

4.5 6.0 7-5 9.0 lO.5

pH

图6-8Hb的式电位(EoI)与pH值的关系图

Fig.6-8 pH effect on the formal potential(Eot)with scan rate as o.1 Ws

6.2.7修饰电极的电催化性质

6.2.7.1对H202的催化还原

图6.9为PVA/Hb/MWCNTs/CILE在空白的缓冲液和不同浓度的H202存

在时的循环伏安图。从图中可以看出,随着H202的加入还原峰电流明显增大, 同时氧化峰减小,这是电化学催化还原过程的特征.】。当H202的浓度在

1.0x10。6~3.0x 10巧mol/L范围内时还原峰电流随着H202浓度的增加而线性增

加,其线性回归方程式为Ip(1aA)=O.286 C(1amol/L)+o.256(n=15,7---0.997),检测 限为1.OxlO。6mol/L(30)。表观米氏常数(KMapp)是酶.底物反应动力学的重要指 标,可以通过根据Lineweaver-Burk方程的电化学表述形式来计算【12J:

7l

{8

n

n

n

n

也 n

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

上=上+竺翌(4)

I鳃I燃j I㈣≦

式中I豁是加底物后的稳态电流,C是底物的体积浓度,Im觚是饱和底物状态下

所测得的最大电流。由此公式可以计算该电极催化反应的表观米氏常数为0.928 lamol/L,这比以前报道的一些基于血红蛋白的H202传感器的酽值为要低

[13,141,表示Hb在此条件下具有较强的催化能力强。

-4"

--_

、\

H

E/V

图6-9 Hb修饰电极在不同浓度H202存在下的循环伏安图

Fig.6-9 Cyclic voltammograms ofP、公旧㈣CNTs/C几E in pH 7.0 PBS谢n1 different amounts ofH202(from a to e 0,1.0,3.0.4 0,5.0,20.0 lamol/L)respectively,诵tll the scall rate

嬲100mV/s

6.2.7.2对TCA的电催化还原

用循环伏安法考察了该Hb修饰电极对三氯乙酸(TCA)的电催化还原反

应,结果如图6.10 A所示。当将TCA加入pH 7.0的PBS中时,可以观察到

P、,A,Hb/MwCNTs/CILE在.0.302 V的Hb Fe(III)的还原峰明显增大,伴随着Hb Fe(II)的氧化峰的减小(曲线b-h),这主要是由于Hb Fe(II)又被氧化为Hb Fe(III) 的缘故。随着TCA浓度的增大,Hb Fe(III)的催化还原峰也逐渐增大。当TCA

浓度在5.0?104~1.2?10。2 mol/L范围内,催化峰电流与TCA浓度呈线性关系(如 图6.10 B所示),其线性回归方程为Ip(mA)=0.0322 C(mmol/L)+O.001 5(n=22,

下----0.998),检测限为1.O?104 mol/L(30)。根据方程(5)可求出表观米氏常数为5.13 mmol/I,。

72

青岛科技大学研究生学位论文

4.0

’32

毫24

、协

—P1.6

0B

0.0

0 2 4 6 8 10 12

C1r_fflO。5n’d/L

图6-10(A)Hb修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图;(B)催化峰电流与TCA的浓 度关系曲线

Fig.6—10 Cyclic vo|tammograms of PVA/Hb/MWCNTs/C眦in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS containing 0,0.8,3.6,4.4,6.0,8.0,1 0.0,1 2.0 mmol/L TCA(curve a-h),respectively,with the

scar rate as 100 mV/s.(B)Plot of cataclytie peak current Versus concentration of TCA.

6.2.8电化学阻抗谱图

电化学阻抗能反映电极表面修饰过程中阻抗变化的信息。图6.11分别为裸

CILE(曲线a)、PVA/CILE(曲线b)、MWCNTs/CILE(曲线c),PVA/MWCNTs/CILE

(曲线d)和P、,A/H:b/MWCNl’s/CILE(曲线e)在含0.1 mol/LKCl和10.0mmol/L Fe(CN)63-/4-溶液中的电化学阻抗谱图。MWCNTs/CILE呈一条直线(曲线c),这

是由于MWCNTs具有高导电性。而裸CILE阻抗值明显增大(曲线a)。当修饰

有PVA上时,阻抗值进一步增大(曲线b)。当在MWCNTs/CILE修饰上PVA时,

阻抗值增大。PwL/Hb/MWcNTs/CILE的阻抗值进一步增大,这是由于膜中存

在的生物大分子Hb的不导电性增加了电子传递电阻,同时也可以说明Hb成功

地固定到电极表面上。

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

C=

>N

I

Z。/Q

图6.11不同修饰电极的电化学交流阻抗谱图

Fig.6—11 Electrochemical impedance spectroscopy for(a)bare CILE,(b)PVA/CILE,(c)

MWCNTs/CILE,(d)PVAJMWCNTs/CILE and(e)P、,A胆㈣CNl's/CILE in the presence of 1 0.0 mmol/L[Fe(CN)6]3摊and O.1 mol/L KCI solution with the frequencies swept from 1 05 to 0.1

Hz

<

_寸

、一’__

、\

■一

O.8 O.7 O.6 O.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.O。1-O.2.o.3-0.4

E/V

图6.12不同修饰电极的循环伏安图

Fig.6?1 2 Cyclic voltammograms of(a)bare CILE,(b)PVA/CILE,(c)MWCNTs/CILE,(d)

PVA/MWCNTs/CILE and(e)PVA/Hb/MWCNTs/CILE in 0.1 mol/L KCl solution containing 1 0.0 mmol/L[Fe(CN)6】3#,with the scan rate as 1 00 mV/s

考察了不同修饰电极在10.0 mmol/L[Fe(CN)6]3脾溶液中的循环伏安曲线,

74

青岛科技大学研究生学位论文

结果如图6.12所示。在裸CILE上出现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线a),

PVA/CILE的氧化还原峰明显减小(曲线b),说明PVA能够阻碍电子转移,主要

是PVA是一种不导电的高聚物,而MWCNTs/CILE在[Fe(CN)6】3w。溶液中电化

学信号明显增强(曲线c),说明MWCNTs的存在下够促进电子转移。与之相比,

PVA/MWCNTs/CILE上峰电流减小(曲线d),说明PVA对电子的阻碍作用大于

MWCNTs对电子的促进作用。在PVA/Hb/MWCNTs/CILE上,峰电流进一步减

小(曲线e),说明Hb阻碍[Fe(CN)6]川。扩散到电极表面,这与电化学交流阻抗谱 图得到的结果一致。

6.3本章小结

用亲水性的EMIMBF4修饰的碳糊电极作为基底电极,用MWCNTs和

PVA将Hb成功地固定到电极表面上,从而制得PVA/Hb/MWCNTs/CILE。光谱

实验表明,Hb在该修饰电极中保持了其天然构象。电化学实验表明,在0.1 mol/L pH 7.0磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描(PBS),该修饰电极有一对峰形良好

的且准可逆的氧化还原峰,其式电位(Eo’)为.0.370 V(vs.SCE),为Hb Fe(III)/Fe(II) 电对的特征峰。式电位不随扫速的变化而变化,求出电子传递系数(0【)和反应速

率常数(忽)分别为0.490和1.054 s~,并且该修饰电极对三氯乙酸(TCA)和H202 有较好的电催化活性。

75

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

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青岛科技大学研究生学位论文

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peroxide[J],Anal.Chirm Acta,1996,335:137-145

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

第七章肌红蛋白在Nafio州WCNTs/离子液体修饰碳糊电

极中的直接电化学和电催化行为

摘要:本文用Nation和多壁碳纳米管(MWCNTs)复合膜将肌红蛋白(№)固定在 离子液体修饰碳糊电极(CILE)表面制备了Na丘oMⅥb/MWCNTs/CILE,研究了 Mb在该修饰电极上的直接电化学行为。在pH 7.0的PBS缓冲溶液中循环伏安

扫描可得到一对准可逆的氧化还原峰,为Mb血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的特 征峰,式电位(E0’)为一0.320 V(vs.SCE),并求解了相关的电化学参数,电子转移 数n为1.108,电子传递系数a为O.43,反应速率常数恕为0.332 S~。该修饰电 极对三氯乙酸(TCA),H202和亚硝酸钠(NaN02)表现出较好的电催化行为。

关键词:肌红蛋白;多壁碳纳米管;离子液体;EMIMBF4;直接电化学;电催 化.

蛋白质是重要的生物大分子,氧化还原蛋白质与电极之间的电子转移在某

种程度上类似于生物体内分子之间的电子转移。因此,蛋白质分子的氧化还原 性质的电化学研究可以为动、植物生理学研究提供一些必要的科学根据和有用 信息,对于了解蛋白质在生命体内的能量转换和物质代谢,了解生物分子的结 构和各种理化性质,探索其在生命体内的生理作用,研制新型的生物传感器具 有重要的理论和实际意义【l‘3J。

肌红蛋白(Mb)是以血红素为辅基的蛋白质,在生物体内的主要功能是贮存

和运输氧气。由于它的三维结构已经确定,所以常用作研究蛋白质或酶的结构 与功能关系的模型物[4,51。它还能与一氧化氮结合,起着平衡血液和骨骼肌中一 氧化氮浓度的作用【6】。所有这些生理过程都涉及到一系列氧化还原反应。用电 化学方法研究肌红蛋白,可更进一步阐明其生理功能。利用它能够选择性识别 某些生物分子的特点,可进一步制备生物电化学传感器。本文制备了离子液体 EMIMBF4修饰的碳糊电极,并将Mb、MWCNTs和Nation层层涂布到该修饰

电极表面,实现了Mb的有效固定,详细研究了Mb在该修饰电极上的直接电 化学和电催化行为。

78

青岛科技大学研究生学位论文

7.1实验部分

7.1.1仪器与试剂

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司);三电极系统:自制Nation/

Mb/MWCNTs/CILE仲=4.0 mm)为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极, 铂电极为辅助电极;Cary 50 probe型紫外可见分光光度计(澳大利亚Varian公 司);Tensor 27型FT-IR红外光谱仪(德国Bruker公司);pHs.25C型酸度计(上海 虹益仪器仪表有限公司)。

马心肌红蛋白(Mb,分子量为17800,美国Sigma公司);1.乙基一3.甲基咪

唑四氟硼酸盐(EMIMBF4,杭州科默化学有限公司);Nation(O.5%乙醇溶液,美 国Sigma公司);石墨粉(上海胶体化工厂,颗粒度<301xm);O.1 mol/L PBS系列 缓冲溶液同第二章2.1.1;所用试剂均为分析纯,实验用水为二次石英蒸馏水。 在电化学测量前必须向电解质溶液中通高纯氮气30 min除氧,并在氮气氛下进 行测定。

7.1.2实验方法

离子液体EMIMBF4修饰碳糊电极(CILE)的制备方法见第六章6.1.2。

取10.0 mg Mb溶于1.0 mL pH 7.0的PBS缓冲溶液中,制成10.0 mg/mL的

Mb溶液;多壁碳纳米管的质量浓度为1.0 g/L,分散在N,N一二甲基甲酰胺(DMF) 中。

CILE在称量纸上打磨光滑后,取3.0 lxL MWCNTs涂布到电极表面,自然

晾干,再取配好的Mb溶液10.0 pL滴涂于电极表面,最后将8.0肛LO.5%的Nation 滴涂于表面,室温过夜干燥,所制备的修饰电极表示为NafioIl/]m/MwCNTs/ CII,E。

7.2结果与讨论

7.2.1紫外.可见吸收光谱

在紫外.可见吸收光谱中,三价铁的Soret吸收带可以提供血红蛋白的结构

信息,如果血红蛋白的结构发生变化或变性其吸收带就会迁移或消失。用紫外

可见吸收光谱考察了Mb在MWCNTs和Nation溶液中的结构信息,结果如图

79

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

7.1所示。Mb在水溶液中的Soret吸收带在409.1 nlTl处(曲线a),在pH分别在 5.0,6.0,10.0 PBS缓冲溶液、MWCNTs和Nation的混合溶液中的Soret吸收

带均在409.1 nnl处(曲线c.e),与水溶液中Soret吸收带一致,这表明Mb在

MWCNTs和Nation的混合溶液中保持原始构象,没有发生变性。而在pH 2.0

PBS中,Soret吸收带在369.0 nnl处(曲线b),与水溶液中Soret吸收带值差别较 大,说明Mb已经部分发生变性。

1.5

盖1.o

O.5

o.O

300 400 500 600 700

WavelengthAlm

图7.1 Mb在不同溶液中的紫外一可见吸收光谱图

Fig.7一l UV-Vis absorption spectra of(a)Mb in water solution,(b-e)

Nafior泖vIb瓜nⅣCNTs/CILE in pH(b)2.0,(c)5.0,(d)6.0 and(e)1 0.0 PBS,respectively

7.2.2傅立叶变换红外光谱图

FT-IR也可用于检测蛋白质的结构信息,蛋白质的酰胺I和酰胺II红外吸

收带可以提供多肽链二级结构的信息,如果蛋白质变性,酰胺I和酰胺II两个

吸收带会显著改变甚至消失。酰胺I(1700.1600 cm’1)是由蛋白质肽链骨架中的 肽段连接处C=O的伸缩振动引起的;酰胺II(1620.1500 cmo)则产生于N.H弯

曲和C-N伸缩。在2000.1000 cm。1范围内观察肌红蛋白在Nafion/MWCNTs复

合膜内的红外光谱,结果如图7.2所示。血红蛋白在膜内的酰胺I和酰胺II红

外吸收带分别在1653.73 cm-1和1535.59 em。1(图7-2b)处,和天然血红蛋白的吸 收带1653.24 cm叫和1540.89 cm。(图7-2a)很接近。从谱图的相似性可以认为 Mb在Nation/MWCNITs膜内基本保持了其天然构象。

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:2000 1∞0 1000 2000 1500 1000

T’r 1 , ?l Wavenl】mDer/Cm‘

图7-2(a)肌红蛋白和(b)Nafion/Mb/MWCNTs的红外光谱图

Fig.7-2 FT-1R spectra of(a)Mb and(b)Nafion/Mb/MWCNTs.

7.2.3 Mb在Nafio础ⅥWCNTs/CILE中的直接电化学行为

图7.3显示了不同修饰电极在pH 7.0的PBS缓冲溶液中的循环伏安扫描图, 从图中可以看出,在裸CILE(曲线a),MWCNTs/CILE(曲线b)和

NafioⅣMWCNT’s/CILE(曲线c)上没有出现任何氧化还原峰,说明在电极表面

不存在电活性的物质,同时,由于MWCNTs的存在增大了背景电流。而在

NafioMⅥb/CILE上出现一对峰形较小的氧化还原峰(曲线d),说明Mb在Nation 膜修饰的CILE上能够发生较慢的电子转移。与之对比,当MWCNTs修饰到

CILE表面时,电流响应明显增加(曲线e),可观察到一对峰形良好的且准可逆

的氧化还原峰,表明Mb在电极表面发生了较快的电子转移,由此说明MWCNTs

的高的导电性,Nation良好的生物相容性和CILE的优点均为Mb的电子转移

提供了良好的微环境。从曲线e中可以看出,阴极峰电位(Epc)和阳极峰电位(Epa)

分别为.0.41 1 V和.0.229 V(vs.SCE),其式电位(EoI)为.0.320 V,这是Mb辅基 血红素Fe(III)/Fe(II)电对的氧化还原特征峰,且氧化还原峰电流基本相等,表明 电极反应是一个准可逆的电化学过程。

一显o看#售∞辱JL

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

E/V

图7.3不同修饰电极的循环伏安图

Fig.7-3 Cyclic voltammograms of(a)bare CILE,(b)MWCNTs/CILE,(c)

Nafion仆压WCNTs/CILE,(d)N蚯011/Mb/CILE and(e)Nafion侏仙删阿CNTs/CILE at the$call

rate of 100 mV/s in pH 7.0 PBS buffer

图7.4为Nafioll/】Mb/MWCNTs/CILE在不同扫速的循环伏安图,从图中可

以看出,随着扫速的增加,峰电流增大。在扫速30-400 mV/s范围内,氧化还

原峰电流与扫描速度呈良好的线性关系,如图7.5所示,其线性回归方程分别

为Ipc(pA)=29.59u(V/s)+1.410(n=13,间.991)和Ipa(pA)--22.729(V/s)一2.183 (n=13,间.990),说明电极反应表现出薄层电化学行为。对于薄层电化学来说, 电活性物质在电极表面发生还原或氧化反应时,通过电极的总电量与扫速无关。

根据公式Q--nFAF*17l,可得到电活性物质的表面覆盖度,式中n为电活性物质

发生电极反应时的电子转移数,F为法拉第常数,A为电极面积(cm2),r木为电活

性物质的表面覆盖度(mol/cm2)。由此公式可以求得r木为4.64x 10一mol/cm2,而 电极表面Mb的总量为4.47x10一moVcm2,所以电活性物质占电极表面总量的

10.4%,只有离电极表面近的Mb分子才能发生电子转移。

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o

’一\^

_

E/V

图7_4不同扫速下Nafiom/MWCNl's/C肛的循环伏安图

F谵.7-4 Cyclic voltammograms on Nafion/Mb/MWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS buffer at various

scan rate,the scan rate is 30,50,80,1 00,1 50,1 80,200 mV/s(from a to曲,respectively.

12

8

岬4

o

五0

■_

4

.8

.12

O.O 0.1 0.2 0.3 0.4

m'o(V/s)

图7.5氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速的关系曲线

Fig.7-5 Plots of cathodic(a)and anodic(b)peak current with the scan rate(D 考察了扫描速度与峰电位之问的关系,从图7—4中可以看出,峰电位差随

着扫速的增大而增加,表现为准可逆的过程,根据准可逆薄层电化学过程的

Laviron’s理论‘28’291,峰电位Ep与l肿呈良好的线性关系(图7-6所示),其线性

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

回归方程为Epa(V)=0.0403 lnv一0.127(n=13,y--0.991)和Epc(V)=-0.0539 lnv.0.542(n=13,fO.993),根据公式可计算出电子转移速率常数(伐)和电极反应 速率常数(忽)分别为0.43和0.332 s一。

旬.15

旬.20

/一、

吕旬.25

兽-0.30

、--/

之42.35

42.40

旬.45

_0.50

.3.6 .3.O -2.4 .1.8 —1.2 -o.6

lrm(./vsl)

图7-6氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数lnv之间的关系

Fig.7-6 Linear relationship of the peak potential of Epa(a)and Epc(b)‘versus lno for

P、璐,Hb/MWCNTs/CILE in pH 7.0 PBS buffer.

7.2.4电催化还原TCA

用循环伏安法考察了Nafiofl/Mb/MwCNTs/CILE对三氯乙酸(TCA)的电催

化还原。结果如图7.7所示。当TCA加入pH 7.0 PBS中时,

Nafior删b/MWcNTs/CILE在。0.344 V(W.SCE)的还原峰明显增大,同时氧化峰

逐渐减小(曲线d.h),而在Najcio棚ⅥWCNTs/CILE上没有类似的现象(曲线a,b), 结果表明Mb的存在对TCA的电化学还原具有催化作用。还原峰电流与溶液中

的TCA的浓度在1.57~1.20 mmol/L之间呈线性关系,其线性回归方程为

Ip(104A)=O.582 C(mmol/L)+6.031(n=19,y=0.991),检钡0限为1.0?10‘4 mol/L (30)。表观米氏常数”)是酶一底物反应动力学的重要指标,可以根据

Lineweaver-Burk方程可计算‘10】:

一1一上+』芝I路I泓j I僦C

式中Is。是加底物后的稳态电流,C是底物的体积浓度,Im弧是饱和底物状态下所测的最大电流。用双倒数作图法可以计算出胪为3.396 mmol/L,比文

献报道值要小.】。

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E/V

图7.7修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图

F远.7-7 Cyclic voltammograms ofN娟on/MWCNTs/CILE in pH 7.0 buffer containing 0(a)and

3.1xl矿mol/L TCA(b),andNafion/Mb伍压WCNTs/CILE in buffer containing 0,2.91x 10一,

5.66x 10~,6.72x lo-3,9.42x 10。,9.91 x 10’3 mol/L TCA(curve c-h),respectively,at 100 mV/s in

pH 7.0 PBS.

7.2.5电催化还原H202

图7.8是NafioMⅥb/MWCNTs/CILE在pH 7.0 PBS缓冲溶液中对H202的催

化还原。当加入H202时,还原峰电流明显增加,伴随着氧化峰电流减小(曲线

c.i),这是电化学催化还原过程的特征【12】;同样在N娟011,MWCNTs/CILE上没 有类似的现象。H202浓度在8.0?10吒1.96x104 mol/L范围内与催化电流成线性 关系,其线性回归方程为Ip(IIA)=o.0185 C(10~mol/L)+O.989(n=14,y---O.992),测限为6.0x10西mol/L(30)。根据Lineweaver-Burk公式,可计算出酽为

0.181 lamol/L,这比以前的一些报道的酽值要低【l}15J。

85 检

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

、~

■一

E/V(vs.SCE)

图7-8修饰电极在不同浓度H202存在下的循环伏安图

Fig.7-8 Cyclic voltammograms ofNafion/MWCNTs/CILE in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS containing

(a)0 and(b)4.0x 10巧moVL H202,and Nafion/Mb/MWCNTs/CILE in 0.I mol/L pH 7.0 PBS

containing 0,8.0xlO~,9.0xlO~,1.0x10一,1.1 x10一,1.6x10~,3.0x10一M H202(curve c.i),

respectively.Scan rate:1 00 mV/s.

7.2.6电催化还原N02‘

研究了Nafi9n门Ⅵ1)/MWCNTs/CILE对N02-的催化还原,结果如图7-9所示。

当N02-加入pH 7.0 PBS中时,还原峰电流增加,Mb Fe(II)的氧化峰消失(曲线

a-h)。当N02-浓度在2.0x10-4~1.1x10。3 mol/L范围内,与催化电流呈线性关系, 其线性回归方程为Ip(10。4A)=o.269C(mmol/L)+1.083(n=18,T:0.996)。根据Lineweaver-Burk公式,可计算出酽为“.1 mmol/L。

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o

'■一

、、

一■_

■■

E/V

图7-9修饰电极在不同浓度N02"存在下的循环伏安图

Fig.7-9 Cyclic voltammograms of NafioⅣMb瓜酉WCNl’s/CⅡ厄in 0.1 moFL pH 7.0 PBS

containing 0,2.91,4.21,4.76,5。66,6.54,7.06,1 1.0 mmogL NaN02(curve a-h),respectively,

scan rate:100 mV/s

7.2.7电化学交流阻抗曲线

电化学交流阻抗法是测定修饰电极表面的电子传递的一种有效方法。电子

传递电阻(Ret),反应了在[Fe(CN)6]3埘。溶液中电子到达电极表面的阻力。图7.10 为不同修饰电极的电化学阻抗谱图。传统的CPE电极的Ret为1617.1 Q(曲线

a),这是说明电极表面存在阻碍电子转移的物质,主要是由于不导电的液体石

蜡的存在减低了碳糊的导电性,存在着较大的电荷转移电叫16】。而对于离子液

体修饰电极,Ret为925.8 Q(曲线b),该值比CPE要小,这是由于离子液体的

具有高的导电性,减小了电子到达电极表面的阻碍。当MWCNTs修饰到CILE

上时(曲线c),阻抗谱在所以频率范围内近似一条直线,说明电极表面不存在阻

挡电子转移的物质,这归因于MWCNTs的高导电性。当Nation修饰到CILE

上时,Ret为493.7 Q(曲线d),该值比裸CILE要小,这主要是因为在电极表面 带正电荷的Nation能和带负电荷的[Fe(CN)6】川4’相吸附。而在

Nafion/Mb/MWCNTs/CILE,其Ret为78.4 Q(曲线曲,该值比MWCNTs/CILE

大,这是因为Mb能阻碍溶液中电子的传递,同样也可以说明Mb已经成功地

固定到了电极上。

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

Z|Q

图7.10不同修饰电极的交流阻抗谱图

F远.7-10 Electrochemical impedance spectroscopy for(a)CPE,(b)CILE,(c)MWCNTs/CILE,

(d)Nafion/CILE and(e)Nafion/Mb/MWCNTs/CILE in the presence of 10.0 mmol/L

[Fe(CN)6】3摊and O.1 mol/L KCl solution with the frequencies swept from 1 05 to O.1 Hz

7.2.8电极的稳定性和重现性

通过电化学方法进一步研究了NafioMⅥb/MWCNTs/CILE的稳定性,实验

结果表明,该修饰电极在40C冰箱中存放两周之后,其峰电流减少了3.2%,存 放30天后,峰电流仍可保持91.O%,表明固定在电极表面上的Mb能较长时间

保持电活性。用循环伏安法对该修饰电极的重现性进行了考察,对4.21xlO弓

mol/L NaN02连续进行6次平行测定,相对标准偏差(RSD)为3.2%,表明该修

饰电极具有较好的重现性。

7.3本章小结

采用亲水性的离子液体EMIMBF4制备了离子液体修饰电极,并以该修饰

电极作为基底电极,利用Nation,MWCNTs将Mb成功地固定到电极表面上,

实现了Mb和电极之间的直接电子转移,实验结果表明,Mb在Nafion/MWcNTs

膜内保持了其天然构象,详细研究了Mb在NafioI州wCNTs膜内的电化学行为, 在该膜内Mb对TCA,H202和N02-表现出良好的电催化行为,并且具有较宽

的浓度范围和较低的检测限。

88

青岛科技大学研究生学位论文

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青岛科技大学研究生学位论文

第八章肌红蛋白在Nation一离子液体BMIMPF6复合膜/离

子液体EMIMBF4修饰碳糊电极上的直接电化学和电催化

摘要:利用亲水性的离子液体EMIMBF4作为粘合剂来制备离子液体修饰电极

(CILE),再用Nation和疏水性的离子液体BMIMPF6复合膜将肌红蛋白(Mb)固 定到CILE表面上,构建了Mb电化学生物传感器。实验结果表明,在pH 7.0 的PBS缓冲溶液中,Mb在Nation.BMIMPF6/CILE上出现一对峰形良好的准可

逆的氧化还原峰,其氧化还原峰电位分别为一0.345 V和.0.213 V(vs.SCE),式电 位(E0’)为.0.279 V,表明是Mb Fe(III)/Fe(II)电对的特征峰。研究了m在电极上 的电催化行为,该复合膜修饰电极对三氯乙酸(TCA)和NaN02表现出较好的电 催化性能。

关键词:肌红蛋白;Nation;离子液体;BMIMPF6;EMIMBF4;直接电化学

室温离子液体(RTIL)是指在室温及邻近温度下完全由阴、阳离子组成的

液体物质,它具有电化学窗口宽、导电率高、热稳定性和化学稳定性好、几乎 没有可测量的蒸气压、不易挥发、对有机物和无机物都有良好的溶解性等优点。 由于离子液体的研究时间短,研究内容多集中于有机合成、绿色化学、分离科 学、材料化学等领域【㈧。“等【5】制备并表征了PMol2掺杂BMIMPF6修饰碳 糊电极,并应用于亚硝酸盐的测定,研究结果表明离子液体的存在能够有效地 改变电极的性能。Zhao掣6J用离子液体修饰电极研究了尿酸和维生素c存在下

多巴胺的循环伏安测定。Yan等【|7】研究了多壁碳纳米管/离子液体修饰玻碳电极 用于尿酸的测定。

本文采用一种亲水性的离子液体(EMIMBF4)制备了一种离子液体碳糊电

极,用一种疏水性的离子液体和Nation作为复合膜,将Mb固定到电极表面上, 电化学结果表明,Mb在该修饰电极上具有较好的电化学行为,对三氯乙酸(TCA) 和NaN02表现出良好的电催化性能。

8.1实验部分

91

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

8.1.1试剂与仪器

马心肌红蛋白(Mb,分子量为17800,美国Sigma公司);1.乙基.3一甲基咪 唑四氟硼酸盐(EMIMBF4,杭州科默化学有限公司)和1.丁基.3.甲基咪唑六氟 磷酸盐(BMIMPF6,杭州科默化学有限公司);Nafion(5%Z.,醇溶液,美国Sigma 公司);石墨粉(上海胶体化学厂,颗粒度≤30 1.tm);?三氯乙酸(TCA,天津市科 密欧化学试剂开发中心);0.1 mol/L PBS缓冲溶液,所用试剂均为分析纯,水 为二次蒸馏水,在电化学测定前必须向电解质溶液中通高纯N2气30 min除氧, 并在N2气氛下进行测定。

CHI 750B型电化学工作站(上海辰华仪器公司),三电极系统:自制

Nation-BMIMPF6/Mb/CILE为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂 电极为辅助电极。

8.1.2 Nation.BMIMPF6/Mb/CILE的制备

EMIMBF4修饰碳糊电极的制备方法见第六章6.1.2。

将石墨粉和液体石蜡以70/30(w/w)放入研钵中研磨均匀,将混合物填入玻 璃管中压实,内插铜线作为导线,即可制备传统碳糊电极(CPE),使用前将电极 表面在称量纸上打磨成镜面。

取10 pL浓度为10.0 mg/mL的Mb溶液涂布到表面处理好的CILE表面,

自然晾干后,再取8 pL BMIMPF6和Nation(1:1,v/v)混合物滴涂到Mb/CILE表 面,静置放置12 h后,即可得到所要制备的修饰电极Nation.BMIMPF6/Mb/CILE, NafioⅣMb/CILE,Nafio玎俸伯/CPE.Nation.BMIMPF6/CILE也是同样的方法。

8.2结果与讨论

8.2.1电化学交流阻抗曲线

电化学交流阻抗可以用于研究电子转换机理和修饰电极表面阻抗变化的信

息。在阻抗谱图中,半圆的直径(Ret)ff一.映了电极表面电化学探针的电子转移情 况,为了进一步了解电极/溶液的阻抗,其电流原理图如图8.1插图。图8.1分 别为裸CILE(曲线a),Nafion.BMIMPF6/CILE(曲线b),Mb/CILE(曲线c), Nafion-BMIMPF6/Mb/cILE(曲线d)和Nafion/ClLE(曲线e)的电化学阻抗谱图。 在裸CILE上电子传递电阻Ret为104.7 Q(曲线a),主要是由于离子液体的高

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导电性。而在Nafion/qCILE上其Ret为499.5 Q(曲线e),表面Naton能阻碍电 子转移,能阻止[Fe(CN6)】3粕。扩散到电极表面。而当Nafion-BMIMPE6涂布到 CILE上时,电子传递电阻降低为117.8 Q(曲线b),这是由于BMIMPF,6能加速

电子的转移,当用Mb修饰到CILE上时,其Ret为145.2 Q(曲线c),说明电极

表面由Mb存在。而当Nation.-BMIMPE6复合膜修饰到Mb/CILE上时,其Ret

为进一步增大到202.3 Q(曲线d),说明Mb成功的固定到了电极表面上,它的

存在增大了电子传递电阻。

Z’/Q

图8.1不同修饰电极的交流阻抗谱图

Fig.8—1.EIS for(a)CILE,(b)Nation一.BMIMPF6/CILE,(c)Mb/CILE,(d)

Nation-BMIMPF6/Mb/CILE,(e)Nafion/CILE in 1 0.0 mmol/L ffe(CN)6】3棒and O.I mol/L KCl

solution with the frequencies swept from 1 0"4 to 0.1 Hz.

不同修饰F删E[Fe(CN),6】3-溶液中循环伏安图是一种反映电极表面的修饰

过程的方法。图8.2是不同修饰电极在1.0 mmol/L[Fe(CN,;)】j-溶液中的循环伏安 曲线,在裸CILE上出现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线b),这是CILE的特

征【8】。而当Nation涂布到CILE上时(曲线d),几乎没有电化学响应并且电流背 景增大。对于电极Nation..BMIMPF6/CILE(曲线a),电化学响应比裸CILE小, 但比Nation/CILE大,说明BMIMPE6的存在能增加电子转移速率。在Mb/CILE 上(曲线c)峰电位增大,说明电极表面的Mb能阻碍电子转移。对于

Nation..BMIMPF6/Mb/CILE(曲线e),氧化还原峰电流进一步降低并且电流背景 也相应增大,说明电极表面的修饰物质能阻碍溶液中[Fe(cN6)】3-向电极表面的扩 散。这与电化学交流阻抗谱图得到的结果一致。

93

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

o一?

’、

_

图8-2不同修饰电极的循环伏安图

Fig.8-2.Cyclic voltammograms of(a)Nation-BMIMPF6/CILE,(b)CILE,(c)Mb/CILE,(d)

Nafion/CILE,(e)Nation—BMIMPF6/Mb/CILE in O.1 mol/L KCl solution containing 1.0 mmol/L

[Fe(CN)6】孓at the scan rate as 1 00 mV/s.

8.2.2 Nation.BMIMPF6/Mb/CILE的直接电化学

将不同修饰电极放入pH 7.0的PBS缓冲溶液中进行循环伏安扫描以研究

其电化学行为。图8.3是不同工作电极的循环伏安曲线,在裸CILE(曲线a)和

Nation.BMIMPF6/CILE(曲线b)上没有任何氧化还原峰出现,说明电极表面不存

在任何的电活性物质。在Nation/Mb/CILE(ffft线d),出现了一对峰形较小且不对 称的氧化还原峰,说明Mb在电极表面发生了直接电子转移,但速率较慢。与

N撕oM怖/CILE相比较,Nafion/Mb/CPE(曲线f)显示了准可逆的过程。说明

CILE比CPE电极在电子传递速率方面具有更多的优点。但是在

Nation.BMIMPF6/Mb/CILE(曲线e),可观察到一对稳定且准可逆的氧化还原峰, 阴极峰电位Epc和阳极峰电位Epa分别为.0.345 V和.0.213 V(vs.SCE)。式电 位(E盯)根据公式E01=(Epa+Epc)/2,可计算为一0.279 V。由此可见,这对峰是 Mb中的血红素辅基Fe(III)/Fe(II)电对的氧化还原特征掣91。由循环伏安图可以 计算出,在扫速为100 mV/s时,峰电位差AEp为132 mV,表明Mb包埋在

Nation.BMIMPF6复合膜中发生了较快的电子转移。所以Nation.BMIMPF6复合

膜在Mb和CILE之间的电子转移起到了很重要的作用,并且为Mb提供了一个

良好的微环境。

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。一?

、、‘

■■

E/V

9

图8.3不同修饰膜电极的循环伏安图

Fig.8-3.Cyclic voltammograms of(a)CILE,(b)Nation-BMIMPF6/CILE,(c)BMIMPF6/Mb/CILE,

(d)Naf如n/Mb/CILE(e)Nafion-BMIMPF6/Mb/CILE and(O Na丘om/CPE in pH 7.0 PBS at the

scan rate of 100谨N|s.

考察了扫描速度对电化学信号的影响,图84是Nation.BMIMPF6/Mb/CILE在

不同扫速下的循环伏安图,在50,--400 mWs的扫速范围内,Mb在不同扫速下都得 到了准可逆的循环伏安响应。这表明膜中所有电活性的Mb Fe(III)均被还原为Mb Fe(II)。图8.5为峰电流随扫速的增加而线性增加(结果如所示),其线性方程分别为

ipc mA)=11.686U(V/s)+23.48(n;1l,T---O.997)和Ipa(pA)=-6.087v(V/s)-12.16 (n=11,y--0.991), 说明电极反应表现为表面控制的薄层电化学行为。’

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接屯化学

o

■■一

’、^

E/V

图8-4不同扫逮下Mb在BMIMPF6-Nafion/CILE中的循环伏安图

Fig.8-4 Cyclic voltammograms of Nation—BMIMPF6/Mb/CILE in pH 7.0 PBS with the scan

rates(from a to f)as 50,80,100,120,150,200 mWs,respectively

‘台

'_

1)(V/s)

图8-5氧化峰电流(a)和还原峰电流(b)与扫速的关系曲线

Fig.8-5 Linear relationship of cathodic(a)and anodic(b)peak current Ip versus scan rate V for

BMIMPF6-Nafion/Mb/CILE in pH 7.0 PBS.

根据Q—r木的关系方程Q=nFAF*,式中n为电活性物质发生电极反应时的

电子转移数,F为法拉第常数,A为电极面积cm2,r誊为电活性物质的表面覆

盖度m01/cm2。可以求出得到电活性物质的表面覆盖度r宰为4.97x 10一mol/cm,

青岛科技大学研究生学位论文

这比理论上单分子层的表面覆盖度要小,而电极表面的Mb的总量为4.47x10垲 mol/cm,所以电极表面的电活性物质占11.1%,这比报到值2.0%要大【lo】。 随着扫速的增大,氧化峰电位逐渐正移,还原峰电位负移,根据准可逆薄层

电化学过程的Laviron理论【ll’12】,求解了Ep和lnl,的关系,结果如图8-6所示, 线性回归方程分别为Epa(V)=0.03091nv一0.133(n=12,T--0.994)和

Epe(V)=O.0494 Inv.0.475(n=12,T--O.991),可求得电子转移数n=1.35,电子传递 系数a=O.520和电极反应速率常数忽:0.532 s一。

岔U

c,)

∞》

、-_一,

之衄

Int)(uVsl)

图8-6氧化峰电位(a)和还原峰电位(b)与扫速的对数lnv之间的关系

Fig.8-6 Linear relationship of peak potential Epa(a)and Epc(b)versus lnv for Nation-BMIMPF6/Mb/CILE in pH 7.0 PBS buffer

8.2.3 Nation.BMIMPF6/Mb/CILE的电催化行为

用循环伏安法考察了该修饰电极Nation.BMIMPF6/Mb/CILE对TCA的电催

化还原作用,结果如图8.7所示,TCA在Nation.BMIMPF6/CILE上没有任何氧 化还原峰(曲线b), 与溶液中不存在TCA时的循环伏安信号相比(曲线c),当

pH 7.O的PBS缓冲溶液中加入TCA后,可观察到在.0.345 V左右出现一个新 的还原峰,随着TCA加入量的增加,还原峰电流逐渐增大,伴随着氧化峰消失, 这是典型的TCA还原过程。当TCA的浓度在1.6~19.6 mmol/L范围内,催化电 流与TCA浓度呈线性关系,其线性回归方程为IpmA)=O.329 C(mmol/L)+15.1 (n=29,y=0.996),检测限为O.2 mmol/L(30),该检测限值比文献报道的TCA生

物传感器值要低【13,14】。根据Lineweaver-Burk方程【15】可进一步求解表观米氏常数")

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

一1=上+竺巴I

ss I僦l I嗽xC

式中Is。是加底物后的稳态电流,C是底物的体积浓度,Im戤是饱和底物状态下 所测得的最大电流。用双倒数作图法(1/Ip~I/[TCA]),根据截据和斜率可计算出 表观米氏常数为90.8 mmol/L。

。一?

._、

H

图8.7修饰电极在不同浓度TCA存在下的循环伏安图

Fig.8-7.Cyclic voltammograms of(a)Nation—BMIMPF6/CILE in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS,(b)

Nation?BMIMPFdCILE in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS containing 4.8 mmol/L TCA,and Nation—BMIMPF6/Mb/CILE in 0.1 mol/L pH 7.0 PBS containing 0,5.7,12.0,15.0,16.0,16.4,

1 7.0 mmol/L TCA(curve c-i),respectively,with the scan rate as 1 00 mV/s. 修饰电极Nation.BMIMPF6/Mb/CILE对NaN02也表现出良好的电催化行

为,随着NaN02浓度的增加,还原峰电流增大,氧化峰电流减小,且浓度在

0.1~8.4 mmol/L范围内,还原峰电流与NaN02的浓度呈线性关系,如图8.8所 示,其线性回归方程为Ip(pA)=0.183 C(mmol/L)+36.23(n=20,y=0.995),检测

限为5.0 x 10。5 mol/L(30),这比文献报道值要小【16’171。根据Lineweaver-Burk方程,可求得表观米氏常数(∽为1.46 mmol/L。

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5.5

5.0

‘鲁

气4.5

-P

4?0

3.5

CN斟q/IO"s

mol/L

图8.8催化峰电流与NaN02的浓度关系曲线

Fig.8-8 Relationship be骶en the catalytic peak current ofNation-BMIMPF6/Mb/CILE versus

concentration ofNaN02

8.3本章小结

同时采用两种不同的离子液体应用于研究Mb的直接电子转移过程,通过

固定Mb在离子液体EMIMBF4修饰碳糊电极的表面并且进一步包埋在

Nafion.BMIMPF6复合膜内,实现了直接电子转移,出现一对峰形良好且准可逆

的氧化还原峰。实验结果表明,该修饰电极对TCA和NaN02有良好的电催化

行为。所以,离子液体膜为蛋白质的固定提供了一种新型的基质,实现了第三

代生物传感器的制备。

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

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101

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

结论

本论文对室温离子液体和纳米材料在蛋白质的直接电化学和生物传感器方

面进行了研究,主要包括以下几方面:

1.开展了Hb和Mb在CILE上的直接电化学行为研究。以室温离子液体1.丁 基.3一甲基眯唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)和1.乙基.3.甲基咪唑四氟硼酸盐 (EMIMBF4)代替传统液体石蜡为粘合剂与石墨粉相混合制备了离子液体修饰碳 糊电极(CILE)。以上述CILE为基底电极,以壳聚糖(CTS)、纳米Ti02、Nation、 葡聚糖、乙烯醇(PVA)、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米管(SWCNTs)等

为膜材料,采用层层涂布法和直接混合法制备了不同类型的Hb和Mb修饰电极如 CTS/Ti02/Hb/CILE、Nafion/Hb/SWCNTs/CILE、PVA/Hb/MWCNTs/CILE、

N瓶oIl/】M晒/MWCNTs/CILE、Nation-BMIMPF6/Mb/CILE。考察了Hb和Mb在不同 复合膜电极上的直接电化学和电催化行为,实验结果总结如下表所示。

表本论文的实验结果总结

102

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2.开展了Hb在纳米生物材料中的直接电化学。以室温离子液体六氟磷酸正丁 基吡啶(BPPF6)制备了离子液体修饰电极,采用静电吸附的方法将Ti02和Hb固 定到电极表面上,制备了该修饰电极Ti02/Hb/CILE。考察了该修饰电极的直接 电化学行为,电化学实验表明了在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中出现一 对峰形良好的准可逆氧化还原峰,并求解了相关电化学参数,电子转移数a =0.87,电子传递系数a=0.469,反应速率常数岛=0.635 s~。

103

氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学

致谢

本学位论文是在孙伟教授的悉心指导下完成的。孙伟教授渊博的学识、严谨

的治学态度、执着的钻研精神、活跃的学术思想永远是我效仿的典范,在此表示 学生最诚挚的敬意。求学期间,在学习、工作和生活诸方面都得到导师的关心和 帮助。在此,谨向孙伟老师表示深深的谢意。

论文完成期间焦奎教授、赵常志教授给予了我热心的指导和帮助,在此真诚 的感谢他们。

此外感谢本实验室的高瑞芳、王丹丹、钟江华、杨茂霞、赵娜、翟白芹、李

音卓、牛学良、蒋强、王艳、赵瑞军、段园园、覃鹏等同学对我无私的帮助和支 持。

最后,我要特别感谢我的父母,他们多年的支持、关怀和爱护是我顺利完成 学业的保证。

感谢国家自然科学青年基金和湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实 验室开放基金对本课题的资助。

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攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录

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氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化

作者:李小青

学位授予单位:青岛科技大学

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1.学位论文吕雪基于聚合离子液体/氧化还原蛋白质修饰电极的直接电化学研究 2009

氧化还原蛋白质在电极上的电化学研究是生物电化学界和生命科学界非常关注的研究问题。它的研究对于探索蛋白质的电子传递机制以及开发新型

的无媒介体电化学生物传感器具有重要的意义。探索生物相容性的新型材料对于实现蛋白质与电极的直接电子传输具有重要意义。

聚合离子液体是促进氧化还原蛋白质和电极之间电子转移的一种重要材料。作为一类新型的聚合物材料,聚合离子液体由于它的优良的物理化学性

质,已经在许多的化学领域受到人们的关注。

目前,聚合离子液体已经广泛的应用在相分离,构筑电极等领域。聚合离子液体是离子液体单体聚合得到的。本论文主要做了以下几个方面的研究

工作:

1、合成了乙烯基咪唑离子液体单体。1-乙烯-3-乙基咪唑溴盐和1-乙烯-3-丁基咪唑氯盐。并以利用合成的单体进行自由基聚合,得到聚合1-乙烯3-

乙基眯唑溴盐和聚合-乙烯-3-丁基咪唑氯盐。

2、我们合成一个新颖的复合材料poly(ViBuIm+Cl-)/Hb,利用紫外-可见光谱和红外光谱说明在poly(ViBuIm+Cl-)/Hb复合膜中Hb保持了天然结构。

此外,我们考察了poly(ViBuIm+Cl-)/Hb/GC电极的电化学性质,在pH7.0的PBS缓冲溶液中可看到一对明显的氧化还原峰,势电位为-0.289 V(vs.

Ag/AgCl),该峰对应于Hb在电极上的特征氧化还原反应(Hb-FeⅡ/FeⅢ),该修饰电极对过氧化氢催化的线性范围为3.5-224μM,当信噪比为3时,最低检

测限为1.17μM。这种较好的电化学响应是由于poly(ViBuIm+Cl-)较好的生物相容性和固有的导电性。

3、基于聚合离子液体,辣根过氧化酶和壳聚糖构筑了poly(ViBuIm+Cl-)/HRP/Chi修饰电极。这种复合膜不仅可以为蛋白质提供一个适宜的微环境

,而且实现了蛋白质在电极表面电子传输,通过紫外可见光谱和红外光谱实验表明在poly(ViBuIm+Cl-)/HRP/Chi复合膜中HRP仍然保持了其二级结构。在

对poly(ViBuIm+Cl-)/Chitosan/HRP/GC修饰电极进行电化学表征时,可观察到一对明显的氧化还原峰,该峰对应于HRP在电极上的特征氧化还原反应

(HRP-FeⅡ/FeⅢ),此外,该修饰电极对过氧化氢和三氯乙酸的具有较宽的检测范围,此外,

该修饰电极还显示较好的稳定性。

聚合离子液体为电化学生物传感器提供新的平台。迄今为止还没有利用聚合离子液体作为电极材料的报道。

2.学位论文高瑞芳基于离子液体和纳米材料的氧化还原蛋白质修饰电极研究 2010 离子液体和纳米材料因具有独特的物理化学性质,已在氧化还原蛋白质修饰电极的

构置方面引起人们越来越多的关注。本论文基于离子液体和纳米材料,构置了十种氧化 还原蛋白质修饰电极,研究了血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)和葡萄糖氧化酶(GOx)的直 接电化学和电催化行为。该研究对丰富氧化还原蛋白质的电化学及其生物传感器的研究 内容,拓宽离子液体和纳米材料的应用范围具有一定的意义。全文共分四章,作者的主 要贡献如下:

1、采用滴涂法,构置了Hb-HA-BMIMBF4-GCE、Hb-CS-BMIMPF6-SiO2/GCE、

Hb-CS-BMIMBF4-clay/GCE和Mb-CS-BMIMBF4-GR/GCE,研究了Hb和Mb的直接电

化学和电催化行为。光谱实验表明Hb和Mb在这些复合膜中均保持了其原始的立体构 象;电化学实验表明,这四种修饰电极上的Hb和Mb均实现了它们的直接电子转移, 且离子液体的存在提高了它们在电极上的电化学响应;并对H2O2均表现出了良好的电 催化作用,催化还原电流均与一定浓度范围内的H2O2呈良好的线性关系。研究表明, 这些复合膜可为研究氧化还原蛋白质(酶)的电化学行为提供新的研究平台。

2、采用电化学沉积法,制备了蛋白质的固载膜;采用层层组装法构置了

GOx-IL-GNP-IL-SWCNT/GCE、Hb/IL/DNA/PDDA/ITO电极和Mb/DNA/CILE,研究了

GOx、Hb和Mb的直接电化学和电催化行为,建立了检测葡萄糖、H2O2和三氯乙酸(TCA) 的电化学新方法。实验结果表明,GOx、Hb和Mb在不同固载膜修饰的电极上均出现 了峰形良好的、准可逆的氧化还原峰;在GOx-IL-GNP-IL-SWCNT/GCE上GOx对葡萄

糖表现出良好的电催化作用,测定葡萄糖的线性范围为2.0?10-6~5.0?10-5mol?L-1,检 出限为8.0?10-7mol?L-1(S/N=3),表观米氏常数(KM)为2.21?10-5mol?L-1;在 Hb/IL/DNA/PDDA/ITO电极上Hb对H2O2具有良好的电催化活性,催化还原峰电流与

1.0?10-6~3.8?10-4mol?L-1范围内的H2O2呈良好的线性关系,检出限为1.0?10-7 mol?L-1(S/N=3);在Mb/DNA/CILE上Mb对H2O2和TCA均具有良好的电催化能力,得到测定 H2O2和TCA的线性范围分别为1.0?10-6~1.6?10-4 mol?L-1和5.0?10-4~4.0?10-2mol?L-1,检出限分别为2.0?10-7 mol?L-1和8.3?10-5 mol?L-1(S/N=3)。该方法制备的这三

种修饰膜可为研究其它氧化还原蛋白质(酶)的直接电化学行为提供良好的研究平台。

3、以BPPF6和石蜡油为黏合剂,制备了离子液体修饰碳糊电极(CPE-IL);以此电极 为基底电极,采用电沉积和层层涂布法,构置了Hb/CoNP/MWCNT/CPE-IL、

HA/CeO2/Mb/CPE-IL和GG/MgO/Hb/CPE-IL,研究了Hb和Mb的电化学行为,建立了H2O2 和TCA的循环伏安测定新方法。实验结果表明,少量石蜡油的加入,可以极大地减小 CPE-IL电极的背景电流;BPPF6、CoNP/MWCNT、HA/CeO2和GG/MgO纳米复合膜在促 进Hb和Mb与电极之间的直接电子传输中起着非常重要的作用,且这三种修饰电极对 H2O2或TCA表现出了良好的电催化作用。对Hb/CoNP/MWCNT/CPE-IL,其电极表面电

活性Hb的覆盖度为Γ=8.92? 10-10 mol?cm-2,Hb催化H2O2和TCA的KM值分别达到2.61?10-5mol?L-1和2.31?10-4mol?L-1;以GG/MgO/Hb/CPE-IL为工作电极,得到了宽的H2O2检测范

围(2.0?10-7~1.7?10-4mol?L-1)和很低的检出限(5.0?10-8 mol?L-1)。这类修饰电极具有表

面易于更新,可批量构置等特点。该方法构置的修饰电极对构建性能优良的第三代电化 学生物传感器具有一定意义。

关键词:传感器,修饰电极,电催化,纳米材料,离子液体,氧化还原蛋白质

3.学位论文乔广军基于三种咪唑类离子液体的修饰电极构置及其应用 2009

本论文共分四章,主要研究内容如下:

以离子液体1—丁基-3—甲基咪唑六氟磷酸([BMIM]BF6)为黏合剂制备了离子液体碳糊基体电极([BMIM]PF6—CPE),采用层层组装技术构置了

Nafion/AuNPs/[BMIM]PF6—CPE,研究了多巴胺(DA)的电化学行为。研究表明,DA在Nafion/AuNPs/[BMIM]PF6—CPE上出现了一对氧化还原峰,峰电位差

△Ep=0.129 V,DA在该修饰电极上的电子转移常数ks=0.71 s-1;其氧化峰电流与浓度在5.0?10-7~1.0?10-5 mol?L-1范围内呈线性关系,检出限为

2.0?10-7 mol?L-1(S/N=3),该法用于盐酸多巴胺注射液中多巴胺测定获得了满意结果。

构置了基于离子液体1—十四烷基-3—甲基咪唑六氟磷酸([C14mim]PF6)—壳聚糖(CS)复合物修饰的玻碳电极([C14mim]PF6—CS/GCE),研究了DA和抗

坏血酸(AA)的电化学行为,建立了同时测定DA和AA的伏安新方法。研究表明,在[C14mim]PF6—CS/GCE上,AA和DA产生的氧化峰完全分开(△Ep=0.385

V),可实现两者的同时测定;AA氧化峰电流与其浓度在2.6?10-5~1.0?10-3 mol?L-1范围内呈线性关系,DA氧化峰电流与其浓度在1.3?105~

5.2?10-4 mol?L-1范围内呈线性关系。

以离了液体1—丁基-3—甲基咪唑三氟乙酸([BMIM]TA)—透明质酸(HA)复合膜为固定矩阵,采用滴涂法分别构置了细胞色素c(Cytc)或肌红蛋白

(Mb)修饰的玻碳电极Cyt c—HA—[BMIM]TA/GCE和Mb—HA—[BMIM]TA/GCE,采用电化学方法和光谱法对两种电极进行了研究。结果表明,Cyt c或Mb在

[BMIM]TA—HA复合膜内均能保持其生物活性;修饰电极Cyt c—HA—[BMIM]TA/GCE和Mb—HA—[BMIM]TA/GCE在0.1 mol?L-1 PBS(pH7.0)中均出现了一对

准可逆的氧化还原峰。Mb—HA—[BMIM]TA/GCE对H2O2具有电催化作用,催化峰电流与H2O2的浓度在3.0?10-6~1.2?10-4 mol?L-1范围内呈线性关系

;Cytc—HA—[BMIM]TA/GCE对H2O2具有电催化作用,催化峰电流与H2O2的浓度在3.0?10-6~1.0?10-4 mol?L-1范围内呈线性关系。

4.学位论文张谦基于纳米材料和氧化还原蛋白质的生物复合材料的组装和应用 2007

氧化还原蛋白质在电极上的电化学研究是生物电化学界和生命科学界非常关注的研究问题。它的研究对于研究蛋白质的电子传递机制以及开发新型

的无媒介体电化学生物传感器具有重要的意义。

纳米技术的介入为电化学生物传感器的提供了广阔的发展空间。纳米材料具有比表面积大,催化活性高等特点,这使得它们可以活化电极表面,加

速蛋白质的活性中心与电极表面的直接电子转移,同时保持蛋白质的生物活性。本论文利用多种具有生物亲和性的纳米材料(纳米碳管,无机介孔材料和

量子点)设计和修饰电极表面,探讨了氧化还原蛋白质的直接电化学性质及其催化特性。这些研究对于构造性能优良的第三代的生物传感器提供了新的思

路和机遇。本论文主要做了以下几方面的研究工作:

(1) 本文利用静电组装的方式,在温和条件下利用Hb,DNA 和多壁纳米碳管(WMNTs)构筑了具有三明治结构的复合纳米材料 DNA-Hb-MWNTs。这种独

特三明治结构的不但保持了所固载的 Hb 的天然结构和生物活性,而且还有效地防止了蛋白质的泄漏。此外,相对于 Hb-MWNTs/GC电极,DNA-HbMWNTs/

GC电极对 H<,2>O<,2>表现出更好的电催化性能,如宽检测范围,低检测限,高灵敏度。这种通过多步骤组装而构筑的多组分平台为新颖的生物传

感器的制备出提供了一种有效的方法和途径。

(2) 我们首次使用碲化镉量子点(cdTe QDs)和大孔径泡沫硅材料(MCFs)制备了 QDs-MCFs 复合材料,并用其固载肌红蛋白(Mb),成功实现了 Mb 在

电极表面的直接电子转移。负电荷的 QDs 同胺基化的 MCFs 在静电吸附的作用下形成 QDs-MCFs 复合材料。由于 QDs-MCFs 复合材料具有介孔结构,较

好的生物相容性以及较大的比表面积,因此被用来作为 Mb 固定化的载体。实验结果表明固载于 QDs-MCFs 复合物中的 Mb不但能够实现直接电子转移

,而且对H<,2>O<,2>表现出较好的电催化性质。与 Mb 直接固载于 MCF(Mb-MCFs)相比,Mb-QDs-MCFs/GC电极对H<,2>O<,2>的检测范围更宽,检测限更低

,灵敏度更高。这种较好的催化性能与复合材料所提供的适宜的微环境有关。 (3) 我们首次利用戊二醛交联的方法将 Mb 价键固载在胺基化的大孔径泡

沫硅介孔材料中。与物理吸附的方法相比,这种价键固载的方法有效地防止了蛋白质在介孔材料中的泄漏。FTIR 与 Uv-Vis 结果表明所固载的 Mb 较好

地保持了它们的天然构象。Mb-MCFs 复合材料与 Nafion 共同构筑的 Mb-MCFs/Nation/GC电极不但能够实现直接电子转移,而且对H<,2>O<,2>表现出较

好的电催化性质,例如较宽的浓度检测范围,较高的灵敏度以及较低的检测限。我们推断这种较好的电催化性能一方面与硅基介孔材料良好的生物相容

性有关,另一方面同 MCFs特有的大孔结构相关,这种大孔结构可以有效促进物质的传输。此外,由于介孔材料对于固载于其中的生物分子具有很好的保

护作用,Mb-MCFs/Nation/GC电极表现出很好的热稳定性。实验结果表明,Mb-MCFs/Nafion/GC 电极在 80℃的高温下加热20分钟后仍然保持了其82%的

生物活性。

(4) 我们首次合成了离子液体修饰化的有机粘土(1—丙基—3—甲基咪唑基氯离子液体修饰的镁基硅酸盐有机粘土)。这种有机粘土不需要有机碱的

作用即可在水溶液中自发剥离为单层纳米片。然后在静电吸附的作用下,剥离的纳米片和血红蛋白可以通过组装,重新叠加成有序的层状复合物,从而

在温和条件下实现对蛋白的固载。XRD 结果表明 Hb 以单分子层的方式嵌入到有机粘土的层状结构中。TEM 和 SEM 结果表明复合物在多步骤的合成及组

装过程中保持了层状结构。蛋白质的活性测定实验结果表明固载的Hb保留了大部分的催化活性。此外,在无机层状载体和咪唑基离子液体的共同作用下

,Hb 表现出了极好的热稳定性。Hb-pmim<'+>Cr<'->clay 在70 ℃和100 ℃加热 20 分钟后时仍能保持 72.5%和 50.5%的活性。

5.期刊论文覃鹏.王艳.赵瑞军.孙伟.赵常志.焦奎基于血红蛋白/纳米金修饰离子液体电极的电化学生物传感器 分

析化学2009,37(z1)

氧化还原蛋白质在工作电极上的直接电化学对于研究生命体系的电子转移机理,了解生命过程中的氧化还原机理,开发新型电化学生物传感器有着重

要的意义~([1]).目前较多的工作是利用各种媒介体、促进剂和纳米材料修饰电极来实现蛋白质的直接电子转移.离子液体修饰电极(CILE)是以离子液体

为修饰剂和粘合剂的一种新型化学修饰电极,在生物电分析化学已经应用.本文在CILE表面修饰纳米金用于血红蛋白的固定及其直接电化学行为的研究,取

得了较好的结果.

6.学位论文翟自芹几种血红蛋白修饰电极的制备与电化学行为研究 2009

血红蛋白(Hemoglobin,Hb)是一种血红素蛋白质,是研究氧化还原蛋白质直接电子传递的理想分子。由于氧化还原蛋白质与裸电极很难发生直接电

子传递,不同类型的膜修饰电极可以加快电子传递速率。最近几年,纳米粒子由于其独特的物理化学性能而被广泛应用于蛋白质膜修饰电极。室温离子

液体由于具有以下特殊性质,如高的导电性、良好的化学和热稳定性、宽的电化学窗口和良

好的生物相容性而受到电化学工作者的青睐。本论文结合室

温离子液体和纳米材料的特性制备了几种血红蛋白修饰电极,并研究了血红蛋白的电化学和电催化行为。论文主要包括以下内容:

1.开展了Hb在离子液体修饰碳糊电极(CILE)上的直接电化学行为研究。通过将碳粉与室温离子液体1—丁基-3—甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)均匀

混合制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE)。以上述CILE为基底电极,以壳聚糖(CTS)、Nafion、纳米ZnO、多壁碳纳米管(MWCNT)等为成膜材料,采用层层

涂布法制备了不同类型的Hb修饰电极如Nafion/nano—ZnO/Hb/CILE、CTS/Hb/MWCNT/CILE。采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换

红外光谱和电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。考察了Hb在不同修饰膜电极上的直接电化学和电催化行为。实验结果表明,Hb在不同的修饰

膜内基本保持了其生物活性,循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰,对Hb的直接电化学行为进行了研究,求解了相关的电化学参数。进一步研究

了该修饰电极对三氯乙酸(TCA)的电催化性质,实验结果表明所制备的Hb修饰电极表现出良好的电催化性能。

2.开展了Hb在离子液体1—乙基-3—甲基咪唑—四氟硼酸盐(EMIMBF4)、MWCNT修饰的碳糊混合电极中的直接电化学行为研究。将血红蛋白、

EMIMBF4、MWCNT以及石墨粉均匀混合,并在表面涂布Nafion得到血红蛋白—碳糊修饰电极(Nafion/Hb—CPE)、血红蛋白—离子液体—碳糊修饰电极

(Nafion/Hb—IL—CPE)、血红蛋白—碳纳米管—碳糊修饰电极(Nafion/Hb—MWCNT—CPE)。采用电化学方法和扫描电子显微镜(SEM)对混合在碳糊修饰电

极中的血红蛋白(Hb)的性质进行了研究,实现了Hb在碳糊修饰电极中的直接电化学,并根据实验数据求解了相关的电化学参数。进一步研究了三氯乙酸

(TCA)、H2O2等小分子在修饰电极上的电催化行为。

7.学位论文闻艳丽氧化还原蛋白质基于微纳结构材料的生物电化学研究 2009

氧化还原蛋白质的直接电化学在生物学和生物电化学领域引起了广泛关注。蛋白膜伏安法是一种新的有效的方法研究氧化还原蛋白质的直接电化学

,可以给蛋白质的氧化还原反应提供重要的动力学和热力学数据,另外,研究固载蛋白质和电极间的直接电子传递可以为制备新型的无媒介传感器提供

理论基础。本论文中分别采用天然的胞外多糖—结冷胶(GG),聚乙二醇接枝的多壁碳纳米管(PEG—g—MWCNTs),晶化的有序介孔C—TiO2(MCT)复合材料

和新型的蠕虫状二氧化钛等新型高聚物和纳米结构材料为载体固定蛋白质,并研究它们的生物电化学性质。本论文的主要研究工作如下:

1、一种新型的细胞外多糖结冷胶和室温离子液体的复合膜首次作为基底去包埋蛋白质分子,并且研究了它的生物电化学性质。选择血红蛋白(Hb)作

为一种模型蛋白去研究结冷胶和离子液体复合体系。采用紫外可见分光光度法、循环伏安法和电化学交流阻抗技术表征了膜的性质。结果表明Hb在膜中

能够很好的保持天然结构和显示良好的电化学行为。在pH7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)中,出现了一对清晰的准可逆的氧化还原峰,其势量电位(E?’)为

—0.368V(vs.SCE),与典型的血红素Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化还原对电位一致。Hb—IL—GG修饰电极对过氧化氢(H2O2)表现出良好的电催化还原能力。

2、采用共价接枝法制备了聚乙二醇(PEG)修饰的多壁碳纳米管(PEG—g—MWCNTs),合成的材料具有良好的水溶性和生物相容性。用傅立叶红外光谱

,透射电子显微镜,热重分析法表征PEG—g—MWCNTs,证明PEG嫁接到了MWCNTs表面上。并以PEG—g—MWCNTs为生物载体来固载Hb,研究其生物电化学行

为。采用电化学交流阻抗技术证明了Hb有效吸附到PEG—g—MWCNTs修饰电极表面。Hb/PEG—g—MWCNT修饰电极在pH7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)中的循环伏

安结果显示了一对清晰的准可逆的氧化还原峰,其峰电位为—0.34V(vs.SCE),与典型的血红素Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化还原对电位一致。Hb固载到

PEG—g—MWCNTs显示出对亚硝酸盐良好的生物电催化还原活性。

3、以酚醛树脂和“酸碱对”TiCl4和Ti(OC4H7)4分别为碳源和钛源,通过三嵌段共聚物直接模板法合成了有序介孔C—TiO2(MCT)纳米材料,通过无

定型的碳将纳米晶锐钛矿很好的“粘连”堆砌在一起组成晶化墙壁,具有有序的介孔结构,高的比表面积(200㎡/g),大的孔体积(0.15cm3/g)。其中二

氧化钛的含量高达87wt%。将有序介孔C—TiO2用于蛋白质固定和生物电化学研究,循环伏安结果表明,MCT修饰电极在pH7.0的磷酸缓冲溶液(PBS)中的

显示了一对清晰的准可逆的氧化还原峰,其峰电位为—0.336V(vs.SCE),与典型的血红素Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化还原对电位一致。Hb固载到MCT上对H2O2显

示出良好的物电催化活性。

4、以新型的蠕虫状二氧化钛和室温离子液体复合膜为载体,首次用于辣根过氧化物酶(HRP)的固载及其生物电化学性质研究。采用紫外光谱(UV)和

电化学交流阻抗(EIS)研究了HRP/wTiO2/IL膜的性质,结果表明wTiO2和IL膜提供了一个很好的微环境保持HRP的生物活性。通过循环伏安法研究了

wTiO2和IL对HRP的直接电子转移反应,HRP/wTiO2/IL修饰电极在pH7.0的磷酸缓冲溶液中显示出一对良好的、对称的氧化还原峰,峰电位为

—0.349V(vs.SCE)。实验结果还表明该修饰电极对过氧化氢具有良好的生物电催化作用。

8.学位论文孙至浴新型纳米修饰电极的研究及其在蛋白质直接电化学行为探讨中的应用 2008

纳米技术是20世纪80年代发展起来的一门新兴学科,这项跨世纪的高技术,如初升的太阳在地平线上冉冉升起,引起各国家科技界、企业界及普通百姓

的高度重视。该技术以多门现代科学技术为基础,是现代科学和现代技术结合的产物,代表着今后人类科学技术发展的趋势,也将成为现代高科技和新兴学

科交叉发展的研究热点,并已渗透到现代科学的各个领域。

当物质小到纳米数量级时,会产生独特的常规材料所不具备的优越性能,因此,纳米材料在催化、电子材料、微器件、增强材料等方面有着广阔的应用

前景。如果将纳米材料用作电极表面修饰材料,由于其尺寸效应和介电限域效应等特性,能增大电流响应,大大提高检测的灵敏度并降低检测限;另外,由

于许多纳米材料都具有特有的生物兼容性,因此可用于许多微量的生物活体样品的分析。

蛋白质和酶等生物大分子是构成生命的主要基元,参与完成生命体中的新陈代谢等许多生理过程,同时在这些生命过程中很多蛋白质和酶都要经历电

子转移过程,在其氧化型和还原型之间相互转化。从某种意义上讲,研究生命过程实质上就是研究生物体中的电子传递过程。因此,用电化学方法来研究蛋

白质的电子传递过程有着特别的优越性。纳米材料独特的比表面积大、催化活性高、亲和力强的特点,使其能活化电极表面,加速蛋白质的活性中心与电

极间的直接电子转移,同时最大限度地保持蛋白质的生物活性。因此,将纳米技术应用于蛋白质的电化学分析研究,是一个崭新而具有挑战性的领域,有利

于创新性地建立一些新理论、新技术和新方法。

本论文致力于新型纳米材料和纳米修饰电极的研究,在保持蛋白质的良好生物活性和电化学活性的同时提高氧化还原蛋白质与电极之间的电子交换速

度,从而制备具有高灵敏度、低检测限和高稳定性的化学与生物传感器。研究工作着重在于选

择和制备具有良好特性的纳米材料并在此基础上进行化学修

饰电极的功能化设计。

文中尝试以中空纳米球体、分子筛及二氧化硅等多种材料作为氧化还原蛋白质反应平台,通过蒸气滴涂、静电吸附、层层组装等方法构筑可以加速蛋

白质与电极间电子转移过程的纳米材料修饰电极;以SEM、TEM等表征手段研究传感器表面物理状态,同时结合UV等技术探究其生物活性;以交流阻抗、脉

冲伏安以及循环伏安等电化学方法作为主要研究手段,探讨蛋白质在纳米材料修饰电极上的电化学性质,研究蛋白质对过氧化氢的催化响应机理。通过以

上工作,既获取了蛋白质分子中电子转移的动力学参数,也为研制新一代的生物传感器提供了理论基础和初步模型。本论文工作将努力实现纳米技术、生

命科学和电分析化学三者的有机结合。

全文共有四个部分:

1.绪论(第一章)本部分内容主要包括纳米材料概况、化学修饰电极简介、氧化还原蛋白质的电化学研究三部分。文中简要介绍了纳米材料的分类、

特性、制备等;简述了化学修饰电极的发展、制备和相关应用;综述了氧化还原蛋白质的电化学研究意义和进展。

2.基于表面蒸气溶胶凝胶法制备二氧化硅及其在血红蛋白的直接电化学和电催化性质中的研究(第二章)首次创新性地尝试了在50℃pH=5.0的酸性条

件下,基于表面蒸气溶胶凝胶法制备二氧化硅溶胶凝胶(SiO2),并将其与血红蛋白(Hb)通过静电吸引力层层组装制备{Hb/SiO2}n薄膜修饰电极,研究了该薄

膜中血红蛋白的直接电化学和电催化性质。该方法保持了传统溶胶凝胶材料的优点,所制备二氧化硅溶胶有较多孔洞结构,可以更好地传递物质,提供更大

的蛋白质负载量,是较好的固定蛋白质的基质,同时该法大大缩短了制备过程且避免了在传统方法中酸环境和无机助溶剂带来的不良影响,使此修饰膜中的

蛋白质能保持良好的原始结构且能在较宽温度范围内保持其生物活性。该修饰电极的循环伏安图呈现一对形状较好的准可逆氧化还原峰

(△E=76mV,E1/2=-0.330V),为血红蛋白血红素中心FeⅢ/FeⅡ氧化还原电对的特征峰,说明该修饰电极上的二氧化硅溶胶凝胶确实有效地加速了血红蛋白

和电极之间的电子传递。此外,该修饰电极还对过氧化氢表现出良好的催化活性,米氏常数(Kmapp)为0.155mmol/L。该方法不但为蛋白质的电化学与电催

化研究提供了坚实的基础,还为第三代酶传感器的研制和开发提供了一种新的思路。

3.MSU层层自组装膜中的血红蛋白直接电子转移和电催化行为的研究(第三章)纳米颗粒型材料与传统材料相比比表面积大大增加,表面结构发生较大

的变化,在能量存储或转换、传感等方面存在广泛应用前景,近年来更是在化学修饰电极制备中有大量应用。本文中,我们首次用前驱体沸石Y以离子液体

CMIMB为模板在碱性条件中合成A1-MSU-S材料,并将其用于固定氧化还原蛋白质,基于静电吸引力层层组装制备成{MSU/Hb}n/PDDA修饰电极。与用CTAB为模

板制得的分子筛相比,用离子液体CMIMB为模板制得的MSU材料具有更大的孔径、孔体积和表面积,所以{MSU/Hb}n/PDDA修饰电极具有较大的蛋白质荷载量

且能长久保持其生物活性,同时具有良好的电化学和电催化性质。我们还研究了组装层数和外界溶液pH值等条件对该修饰膜中血红蛋白电子传递过程的影

响。此外,{MSU/Hb}n/PDDA修饰电极对过氧化氢表现出良好的催化活性,线性范围是1.0?10-6到1.86?10-4mol/L,检测限是5.0?10-7mol/L,(S/N=3),米

氏常数(Kmapp)为0.368 mmol/L。该研究扩大了分子筛材料的应用范围,也为电分析化学中化学与生物传感的深入研究开辟了新的途径。

4.血红蛋白在中空金纳米球/壳聚糖薄膜中的电化学性质研究及其在生物传感器中的应用(第四章)本文成功制备了内径约为10nm,外径约为30nm的中

空金纳米粒子并创新性地将其用于氧化还原蛋白质的固定修饰电极的制备。壳聚糖生物相容性好,亲水性高,能为血红蛋白分子提供特殊的生物兼容性微

环境,降低由于蛋白质溶液吸附造成的电子传递受阻现象。同时,薄膜中小尺寸金纳米粒子能充当血红蛋白与电极之间的电子传递通道,且保持血红蛋白生

物活性不变,更有利于氧化还原蛋白质在电极表面的直接电子传递。该修饰电极的电化学性质研究表明在-0.3V左右的一对准可逆氧化还原峰为血红蛋白

血红素辅基FeⅢ/FeII电对的特征峰,峰电位差(△Ep)为+92mV。该修饰电极还对H2O2表现出良好的电催化还原效应,其还原电流与H2O2浓度在1.0?105~

1.5?10-4mol/L范围之内呈良好的线性关系,最低检测限是5.0?10-6mol/L(S/N=3),米氏常数(Kmapp)为0.388mmol/L。由于该纳米粒子易制备,易于附

着生物分子且具有特殊的中空结构,有望在癌症治疗、药物靶分子、传感器以及药物释放研究中得到应用。

9.学位论文乔丽芳基于离子液体与纳米材料的四种修饰电极构置及其应用 2010

将离子液体、纳米材料及其复合膜用于新型修饰电极的构置和相关研究已经成为修

饰电极研究的一个热点方向之一。本论文基于离子液体与纳米材料构置了四种新的修饰 电极,并进行了Hb和HRP的直接电化学和电催化研究。该研究发展了新型Hb和HRP 修饰电极,扩大了离子液体和纳米材料的应用范围,有一定的科学意义和实用价值。全 文共分三章,主要内容如下:

1、综述了离子液体、纳米材料及其在修饰电极构置中的应用情况,引用参考文献 119篇。

2、构置了Hb-[BMIM][BF4]-GG/CILE和Hb-[BMIM][BF4]-CS-ZrO2/CILE,研究了

Hb的直接电化学和电催化行为。实验结果表明,[BMIM][BF4]-GG和

[BMIM][BF4]-CS-ZrO2复合膜均能为Hb提供良好的生物微环境,保持其生物活性和电 催化能力;在Hb-[BMIM][BF4]-GG/CILE上,Hb对TCA和H2O2均表现出良好的电催

化作用,测定TCA的线性范围为2.0?10-5~9.1?10-3mol?L-1,检出限为6.8?10-6mol?L-1,测定H2O2的线性范围为4.6?10-6~7.8?10-4 mol?L-1,检出限为1.5?10-6mol?L-1。用Hb-[BMIM][BF4]-CS-ZrO2/CILE作为工作电极,测定TCA的线性范围为2.0?10-4~1.0?10-2 mol?L-1,检出限为6.7?10-5 mol?L-1;Fb在

Hb-[BMIM][BF4]-CS-ZrO2/CILE上具有较大的表观覆盖度,其值达到5.80?10-9mol?cm-2。可见,上述两种修饰电极上Hb对TCA和H2O2均具有较高的电催化能力,

建立的测定方法均具有较低的检出限,同时[BMIM][BF4]-GG、[BMIM][BF4]-CS-ZrO2 复合膜均可为其他蛋白质(酶)的固载提供良好的微环境。

3、构置了Co/CILE和HRP-GG/Co/CILE,研究了维生素C(Vc)和HRP的电化学行

为,建立了测定Vc和H2O2的新方法。实验结果表明,用Co/CILE作为工作电极,测

定Vc的线性范围为6.0?10-4~1.8?10-2 mol?L-1,检出限为2.1?10-4mol?L-1;用 HRP-GG/Co/CILE作为工作电极,HRP对H2O2具有良好的电催化作用,测定H2O2的线

性范围为4.0?10-6~1.9?10-2mol?L-1,检出限为1.4 ? 10-6mol?L-1。与离子液体碳糊电

极相比较,利用电沉积方法构置的Co/CILE表现出较强的电催化效果,建立的微分脉冲 伏安测定Vc的新方法可用于不含多巴胺的样品中Vc的测定;HRP-GG/Co/CILE具有良 好的稳定性和重复性,对H2O2的催化有较宽的线性范围。

关键词:传感器,修饰电极,离子液体,纳米材料,氧化还原蛋白质,三氯乙酸,过氧化氢

10.学位论文张玲无机纳米材料、溶胶凝胶材料在电化学生物传感器中的研究 2007

生物传感技术是一个由生物、化学、材料、医学、物理等多种学科相互渗透形成的研究领域。生物传感器具有选择性高、分析速度快、操作简易和

仪器价格低廉等特点,在临床诊断、环境监测、食品工业等方面得到了高度重视和广泛应用。开发稳定的、能够保持生物活性的固载材料来实现氧化还

原蛋白质的直接电化学是非常必要的。本论文以介孔材料、层状材料以及离子液体基溶胶凝胶材料作为蛋白质载体构建了稳定性良好的电极,并对其性

质及其在第三代生物传感器的应用方面做了研究。具体内容如下:

(1)以层状钛酸盐剥离的二氧化钛片为重构层状材料的前体,基于带负电荷的二氧化钛纳米片和电正电荷的HRP分子的静电组装,成功地构建了HRPTNS

酶电极。XRD结果表明HRP以单分子层的方式嵌入到二氧化钛层状结构中。嵌入到二氧化钛层状结构中的HRP不仅保持了自身的天然构像并且能够和电

极之间实现直接电子转移。此外,HRP-TNS电极对H<,2>O<,2>表现出很好的催化性能,能够检测2.1?10<'-6>到1.85?10<'-4>M浓度范围内的

H<,2>O<,2>。HRP-TNS电极具有很好的重复性和稳定性。使用二氧化钛片作为蛋白质的载体构建生物传感器,为制备出新颖的生物传感器提供了一种方法

和途径。

(2)基于前期使用二氧化钛片制备固载HRP的层状材料并成功构建了第三代生物传感器的研究,使用Mb与二氧化钛片进行组装,形成Mb嵌入的层状二

氧化钛的复合物(Mb-TNS composite)修饰电极。高分辨透射电镜和X射线衍射实验表明Mb是以单分子层形式嵌入到二氧化钛层状结构中的。紫外可见光谱

和红外光谱实验表明嵌入的Mb仍然保持了其天然构像。循环伏安技术研究了嵌入在二氧化钛层状结构中的Mb在电极表面上的直接电子转移行为,并详细

地讨论了固载的Mb与电极表面电子转移的可能机理。相对于其他的Mb修饰电极,Mb-TNS电极对过氧化氢的催化具有宽的浓度检测范围(2?10<'-6>到

1.6?10<'-4> M),很低的检测限(0.6μM),很小的米氏常数(137μM),这些都说明Mb-TNS电极对过氧化氢具有优良的电催化性能。层状材料对于固载于

其中的生物分子具有很好的保护作用,本论文使用电化学方法考察Mb-TNS电极的稳定性(热稳定性和pH稳定性)。实验结果表明,Mb-TNS电极在pH 2.2的

高酸性条件下仍然能够实现对H<,2>O<,2>的电催化:Mb-TNS电极在85℃的高温下加热20分钟后仍然保持了其92%的原始活性。

(3)通过双孔径介孔硅(BMS)和壳聚糖杂化膜来固载Hb成功构建了Hb/BMS/CS电极。Hb/BMS/CS电极在除氧的pH 7.0的PBS缓冲溶液中于-0.32V(vs.Ag/AgCl)处表现出可逆的氧化还原峰,

对应于血红蛋白中铁原子与电极表面间的直接电子转移过程。相对于不存在BMS的Hb/CS电极,Hb/BMS/CS电

极对H<,2>O<,2>表现出更明显的直接电化学信号,这表明BMS的存在能够促进Hb的直接电子转移行为。此外,相对于不存在BMS的Hb/CS电极

,Hb/BMS/CS电极表现出更好的电化学催化性能,如宽检测范围,低检测限,高灵敏度。由此,表明这与BMS的双孔径结构有关,即BMS大于Hb尺寸的大孔

结构为Hb提供了高固载量和适宜的微环境,有利于多层Hb参与直接电子转移过程,同时,BMS小于Hb尺寸的小孔结构为H<,2>O<,2>提供了"传输通道",有

利于H<,2>O<,2>在膜内的扩散。

(4)基于离子液体的独特性质和溶胶凝胶工艺的特点,将离子液体与溶胶凝胶通过简单的物理混合,制备了物理包埋[BMIM][BF<,4>]离子液体的溶胶

凝胶修饰电极([BMIM][BF<,4>]/Oel/Au);通过[PMIM][PF<,6>]离子液体硅烷化试剂,将

[PMIMI[PF<,6>]离子液体共价修饰到凝胶骨架上,制备了共价

[PMIM][PF<,6>]离子液体基溶胶凝胶修饰电极([PMIM][PF<,6>]-Oel/Hb/GC)。本论文分别对这两种离子液体基溶胶凝胶修饰电极的电化学性质作了研究

,发现相对于裸Au电极,Fe(CN)<,6><'3+>在[BMIM][BF<,4>]/Gel/Au电极上峰位负移,并且在多圈扫描条件下,电极上有普鲁士蓝生成;相对于裸GC电

极,Fe(CN)<,6><'3->在[PMIM][PF<,6>]-Gel/GC电极上的氧化还原被明显的抑制了。使用循环伏安技术以及光谱技术,对[BMIM][BF<,4>]/Gel/Au、

[PMIM][PF<,6>]-Gel/Hb/GC电极表现出的电化学行为作了解释。此外,本论文还尝试了以共价[PMIM][PF<,6>]基溶胶凝胶(BMIM][PF<,6>]-Gel)为载体固

定Hb构建了蛋白质修饰电极,发现固载到[PMIM][PF<,6>]-Gel中的Hb能够在电极表面实现很好的直接电子转移,并能够催化H<,2>O<,2>,催化电流在1070μM

范围内与H<,2>O<,2>浓度成正比。从而为构建了第三代生物传感器提供了一个新的平台。 本文链接:http://d..cn/Thesis_Y1456808.aspx

授权使用:淮阴师范学院(hysfxy),授权号:5d2021a6-2766-4c94-9be1-9e2a008ba5af

下载时间:20xx年11月10日

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