实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇

实验七 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇

实验八 二乙酰一肟法测定血清尿素

课程名称:生物化学与分子生物学实验课 年级:2005 专业、层次:临床、营养与食品、口腔本科 授课教师:符伟玉 职称:讲师 基本教材:自编 《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求:

1、掌握酶法测定总胆固醇的原理和方法。 2、学习用比色法测定血清尿素。 3、巩固有关胆固醇和尿素的知识。

4、进一步熟练UV2100型分光光度计的使用。

大体内容与时间安排:

1、氧化酶法测定总胆固醇的原理 2、氧化酶法测定总胆固醇的注意事项 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的原理 3、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 4、学生做实验

教学方法:讲授式+启发式

教学重点、难点:

重点:1、氧化酶法测定总胆固醇的原理

2、二乙酰一肟法测定血清尿素的注意事项 难点:氧化酶法测定总胆固醇的原理

学时:4学时 5min 5min 5min 5min 140min

一、实验原理

(一)氧化酶法测定血清总胆固醇

血清总胆固醇(TC)包括:游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)两部分。本实验是

胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化物酶相偶联发生的偶联反应。

第一步:血清胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸

(FFA) 。

第二步:胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和H2O2。

第三步:H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时,经过氧化物酶催化,反应生

成苯醌亚胺非那腙的红色醌类化合物,其颜色深浅与标本中TC含 量成正比。

(二)二乙酰一肟法测定血清尿素

二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物,颜

色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定,故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用

产生二乙酰。

二、操作步骤

(一)氧化酶法测定血清总胆固醇

终点法检测TC,取试管3支按下表依次加样。

酶法测定TC操作步骤

加入物(μl)

血清

标准液或定值血清

蒸馏水

酶试剂 空白管 - - 20 1 000 标准管 - 20 - 1 000 测定管 20 - - 1 000

混匀后,37℃保温10 min,每管加3ml水混匀,用分光光度计比色,于500

nm波长处以空白管调零,读出各管吸光度。

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(二)二乙酰一肟法测定血清尿素

取试管3支,按下表依次加样。

二乙酰一肟法操作步骤 加入物(ml) 血清

尿素标准应用液 蒸馏水

二乙酰一肟溶液 酸性试剂

空白管 - - 0.02 0.5 5.0

标准管 - 0.02 - 0.5 5.0

测定管 0.02 - - 0.5 5.0

混匀,置沸水浴加热12min,取出置冷水中冷却5min,以空白管调零,在540nm处读取各管吸光度。

三、注意事项

(一)氧化酶法测定血清总胆固醇 1、最后加酶试剂,各管反应时间应一致; 2、比色应在30min内完成; 3、试管在操作前尽量保持干燥; 4、试剂中酶的质量影响测定结果 ;

5、若需检测游离胆固醇浓度,将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。 (二)二乙酰一肟法测定血清尿素

1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子,可增进显色强度和色泽稳定性,但仍有轻度褪色现象,(每小时小于5%)。煮沸显色经冷却后,应及时比色。

2、尿液中尿素也可用此法测定,但因浓度高,需先用去离子水作50倍以上稀释。 3、注意洁净干燥,加量务必准确。

4、水浴时注意打开水浴箱盖,以免水汽入管。 5、酸性试剂中酸的含量较浓,要小心使用。

四、思考题

1. 血清胆固醇浓度升高或降低有何临床意义?

2. 血清尿素浓度升高或降低有何临床意义?

3. 血清非蛋白氮(NPN)与尿素的区别,它包括哪些?

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小 结

氧化酶法测定血清总胆固醇,此方法特异性好和灵敏度高,既可用于手工操作,也可自动化分析;既可作终点法检测,也可作速率法检测。在终点法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰;胆红素高于0.1g/L时有明显负干扰;血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时,会使结果降低。但是在速率法中上述干扰物质影响较小。高TG血症对本法无明显影响。检测TC的血清(浆)标本密闭保存时,在4℃可稳定1周,-20℃可稳定半年以上。

二乙酰一肟法测定血清尿素,试剂单一,方法简便,但试剂具毒性和腐蚀性。在标本数量多时加热开始难以达到100℃,各管间受热温度也可能不一致,因而本法重复性不佳。若改善加热条件,如采用在水浴锅底部加置高约5mm的网垫,在网垫上加热显色,可使CV由不加网垫时的6.46%降至2.99%。线性上限仅达

7.14mmol/L;回收率为96%~102.1%。二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它化合物在结构中会有尿素的残基,如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素,虽然也会产生一种带颜色的产物,但这些化合物在血清中浓度很低,故很少引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高,但这些色素的最大吸收峰不同,因此不产生明显干扰。胆红素达171μmol/L、血红蛋白达10g/L均无影响。

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第二篇:20xx年内科护理辅导:血清总胆固醇(TC)测定

1.参考值

酶法 成人2.9~6.0mmol/L

2.临床意义

(1)TC增高 TC增高是冠心病的危险因素之一,高TC者动脉硬化、冠心病的发生率较高。TC升高还见于甲状腺功能减退症、糖尿病、肾病综合征、胆总管阻塞、长期高脂饮食等。

(2)TC降低 见于重症肝脏疾病如急性重型肝炎、肝硬化等。