实验七、血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）

实验目的：

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理、方法及临床意义。

实验原理：

总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

实验讲授：

722型分光光度计的使用

    测量原理
    分光光度法测量的理论依据是伯郎—比耳定律：当容液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c（g/l）或液层厚度b (cm) 成正比。其定律表达式A = abc（a是比例系数）。当c的单位为mol/l时，A = εbc，比例系数用ε表示，称为摩尔吸光系数。其单位为L·mol-1·cm-1，它是有色物质在一定波长下的特征常数。
    T (透光率) = I/I₀ A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)
    测定时，入射光I, 吸光系数和溶液的光径长度不变时，透过光是根据溶液的浓度而变化的，即“K”为常数。比色皿厚度一定，“L”、“I₀”也一定。只要测出A即可算出“C”。《分光光度计的表头上，一行是透光率，一行是吸光度。》

    722型分光光度计的使用
    1、将灵敏度旋钮调至“1”档（信号放大倍率最小）。
    2、开启电源，指示灯亮 ，选择开关置于“T”，波长调至到测试用波长。仪器预热20分钟。
    3、打开试样室（光门自动关闭），调节透光率零点旋钮，使数字显示为000.0。（调节100%T旋钮），盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率100%旋钮使数字显示100.0。如显示不到100.0，则可适当增加微电流放大的倍数。（增加灵敏度的档数同时应重复（3）调节仪器透光率的“0”位）但尽量使倍率置于低档使用。这样仪器会有更高的稳定性。
    4、预热后，按（3）连续几次调整透光率的“0”位和“100%”的位置，待稳定后仪器可进行测定工作。

    吸光度“A”的测量
    将选择开关置于A 。调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为零，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。

    浓度C的测量
    将选择开关由“A”旋至“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路即可读出被测样品的浓度值。
    使用方法
  （1）预热仪器 将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。
  （2）选定波长 根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。
  （3）固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的挡，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。

  （4）调节T=0% 轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。
  （5）调节T=100% 将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。
  （6）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。
  重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值。
  （7）浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。
  （8）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。

注意事项：
    1、测量完毕，速将暗盒盖打开，关闭电源开关，将灵敏度旋钮调至最低档，取出比色皿，将装有硅胶的干燥剂袋放入暗盒内，关上盖子，将比色皿中的溶液倒入烧杯中，用蒸馏水洗净后放回比色皿盒内。
    2、每台仪器所配套的比色皿不可与其它仪器上的表面皿单个调换。

仪器：

722分光光度计、台式离心机、试管及试管架、刻度吸量管或移液器等。

试剂：

（1）10％三氯化铁溶液：10gFeCl₃.6H₂O (A.R) 溶于磷酸 (A.R)，定容至100ml。储于棕色瓶，冷藏。

（2）磷硫铁试剂：取10％FeCl₃溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内，加浓硫酸 (A.R)至刻度。

（3）胆固醇标准储液：准确称取胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml。

（4）胆固醇标准溶液：将储液用无水乙醇准确稀释10倍即得。每毫升含0.08mg胆固醇。

（5）无水乙醇 (A.R)、无水乙醇 (A.R)。

操作

（1）吸取血清0.1ml于干燥离心管，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇2.0 ml，摇匀，10分钟后离心（3000rpm 离心5 min），上清液备用（分两次加入乙醇的目的是使作用完全）。

（2）取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0ml（空白管）、胆固醇标准溶液1.0ml（标准管）、上述乙醇提取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml，摇匀，10分钟后，分别转移至0.50 cm光径的比色杯内，用分光光度计560nm比色。

硫磷铁试剂须沿管壁缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振摇20次，放置10分钟（冷却至室温）后，于560nm进行比色，以空白管调零读取各管吸光度。

计算

    （1）通过制作标准曲线来求得血清胆固醇的含量。

（2）因胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系，可由吸光值A的比值求其含量，本实验即用此法。

（3）如按方法1使用血清为样品，亦可根据线性关系计算

血清胆固醇mg%=

A₂=标准液吸光值；A₁=样品液吸光值

注意事项：

1、颜色反应与加硫磷铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管口径及厚度要一致：加硫磷铁试剂时必须与乙醇分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；硫磷铁试剂要加一管混合一管，混合的手法，程度也要一致；混合时试管发热，注意勿使管内液体溅出，以免损伤衣服、皮肤、眼睛。

2、所用试管和比色杯均须干燥，浓硫酸的质量很重要，放置日久，往往由于吸收水分而使颜色反应降低。

3、空白管应接近无色，如带橙黄色，表示乙醇不纯，应用去醛处理。

4、人血清胆固醇正常含量为2.8-5.9mmol/L(110-230mg/dl)。计算公式中的0.026为mg/dl转换成mmol/L的系数。

 

第二篇：脂肪酸酸价测定与血清胆固醇的测定

脂肪酸酸价测定与血清胆固醇的测定

一、实验目的

1.了解脂肪酸价测定的原理和方法；

2.了解并掌握胆固醇测定的醋酸酐法。

二、实验原理

A、  天然油脂长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败。酸败是由于油脂水解释放出的游离脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味。酸败的程度用酸价来表示。酸价是中和1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的毫克数。

         油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应式如下：

         RCOOH + KOH               RCOOK + H₂O

B、  血清意胆固醇测定对高脂血症的诊断、冠心病和动脉粥样硬化和防治均有意义。血清总胆固醇升高常见原发性高胆固醇血症、肾病综合症、甲状腺机能减退、糖尿病等疾病。

胆固醇的测定临床常用的比色法有两类：

1、固醇化的氯仿式醋酸溶液中加入醋酸酐-硫酸试剂，产生蓝绿色。

2、固醇的醋酸、乙醇式异丙醇溶液中加入高铁-硫酸试剂产生紫红色。

         由于胆固醇颜色反应特异性差，直接测定往往受血液中其倔因素干扰，所以精细的方法是先经抽提，分离及纯化等步骤，然后显色定量。

         本实验采用醋酐-硫酸单一试剂显色法。本法测定100ml血清总胆固醇的正常值为125~200mg。

         醋酐能使胆固醇脱水，再与硫酸结合生成绿色化合物。反应如下：

三、实验器材

A、

1.油脂

2.天平

3.碱式滴定管

4.三角烧瓶

5.量筒

6.水浴锅

B、

1.血清

2.试管

3.吸管

4.容量瓶

5.烧杯

6.电子分析天平

7.722型分光光度计

四、实验试剂

A、

1.0.100mol/L KOH标准溶液

2.1%酚酞指示剂：用70%~90%乙醇配置

3.中性醇醚混合液

B、

1.胆固醇标准溶液

2.硫脲显色剂

五、实验步骤

A、

1.配置中性醇醚混合液

         取95%乙醇和乙醚按1:1等体积混合，混合液加入酚酞指示剂数滴，用0.100mol/L KOH溶液滴定中和至红色。

2.准确称取油脂1~2.000g于100ml三角瓶中，加入醇醚混合液50ml，振摇溶解（固体脂肪需水浴熔化再加入混合液）或40℃水浴中熔化至透明，溶液由红色变为无色，继续用0.100mol/L KOH标准液滴定至淡红色，1 min不褪色为终点，记录KOH的用量V（ml）。

B、醋酸酐法测胆固醇含量：

         取干燥试管3支，分别标明“空白管”、“测定管”及“标准管”，按下表进行操作：

         快速加入显色剂，立即混匀，于37℃水浴中保温10min，取出后，立即以显色剂作为空白调零点，在620nm波长处进行比色。

六、数据与处理

A、

脂肪的酸价=

M_油1=4.50g      V₁=2.72ml        酸价=3.39

M_油2=4.33g      V₂=2.58ml        酸价=3.34

B、

第一次实验

第二次实验

七、实验讨论

1.在测定脂肪酸酸价试验中滴定中性醇醚混合液的过程时变色点较难把握，容易滴过量，这会导致最终实验结果偏低；

2.滴定油脂的过程中可能因脂肪酸未完全溶解混合不充分导致终点判断失误，即在未滴定完全时判断终点，这会导致结果偏小；

3.醋酸酐法测定时操作必须迅速，否则显色后光照会使溶液褪色影响测定结果。