实验四 植物材料的准备与无菌操作技术

一、实验目的

1.通过实验掌握选择合适的外植体，并进行科学的体表灭菌，获得无菌植物材料的方法。2.通过在超净工作台上进行无菌操作训练，掌握植物组织培养的无菌操作技术。

二、实验药品与用具

超净工作台、75%酒精、次氯酸钠、MS培养基、接种器械（接种盘、解剖刀、镊子）、酒精灯、植物材料、小型喷雾器。

三、实验方法

（一）外植体消毒

1、外植体处理后在自来水流水下冲洗。（以下的步骤都在超净工作台上进行）

2、放到75%酒精中浸泡30 s，倒掉后用无菌水冲洗。

3、用2%次氯酸钠处理10min后，无菌水清洗数次，备用。

（二）无菌操作技术

1．操作人员进入接种室前必须用水和肥皂洗净双手，换上已消毒的工作服、帽子、口罩、鞋子后方可进入接种室。

2．接种前用70-75%酒精喷雾或擦洗工作台台面，开紫外灯照射20~30min；，在送风15~30min，让过滤空气吹拂工作台面和台壁四周。

3．用75%酒精消毒双手，并用酒精将装有培养基的培养瓶进行消毒后放进工作台上。

4．接种工具用95%酒精浸泡后在酒精灯上灼烧灭菌。，

5．接种时，腰带口罩，不准讲话或对着实验材料或培养容器呼吸。打开瓶塞或瓶盖时注意不要污染瓶口。瓶口在拔塞前灼烧灭菌。手不能接触接种器械的前半部分（及直接切割植物材料的部分），接种操作时（包括拧开或拧上培养瓶盖时），培养瓶、试管或三角瓶应水平放置或倾斜一定角度（45。以下），避免直立放置而增大污染机会。手和手臂应避免在培养基、植物材料、接种器械上方经过。在接种过程中，接种器械要重新灼烧灭菌。

6．切割外植体时，应在预先经灭菌的接种盘或培养皿、牛皮纸上进行。

7．在每次操作之前尽量把操作过程中必须使用器械盒药品先放入台内，不要中

途拿进。同时，台面上放置的东西也不宜太多，特别注意不要把东西迎面堆得太高，以致挡住气流。

四、实验作业

1.将本次的实验内容整理成实验报告。

2.接种一周后，观察接种材料的污染情况，说明污染的类型并分析污染的原因。

 

第二篇：实验一 植物组培无菌操作

实验一 植物组培无菌操作技术

实验目的

1 了解植物组织培养技术原理

2、熟悉外植体预处理方法，掌握消毒和接种方法

实验原理

1、植物组织培养的过程：将外植体（ explant ）植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。

2、植物组织培养的理论基础：

植物细胞具有全能性（totipotency ）；是将外植体（ explant ）植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。

细胞分化(cell differentiation)：一个成熟的种子都含有一个胚胎。构成胚胎的所有细胞几乎都保持着未分化状态和旺盛的细胞分裂能力，这种细胞叫做胚性细胞，或叫做分生性细胞。 随着种子的萌发，胚胎细胞开始分裂，细胞也随之发生形态及功能的变化，并分別发育成植物的根、茎、叶等组织、器官。细胞在形态及结构上所发生的永久性变化过程称之为细胞分化。

脱分化或逆分化(dedifferentiation)：由失去分裂能力的细胞回复到分生状态，并进行分裂形成没有分化的细胞团的过程称细胞的脱分化(dedifferentiation) ；这种没有分化的细胞团称之为愈伤组织 (callus) 。

再分化(redifferentiation)：由无分化的愈伤组织细胞再转变为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，并构成一个完整的植物奇怪或植物体的过程称细胞的再分化。一个已分化细胞要表的出其全能性，就要经过脱分化和再分化的过程，这就是植物组培和细胞培养所要达到的目的。

3、无菌操作

由于组织培养用的植物材料，大多数由幼嫩组织组成，这些组织离开母体后，生存能力弱，很容易受细菌的感染而死亡。因此要使这些离体的材料能够生存和繁殖，必须防止细菌感染，做到无菌培养。组织培养的培养基营养丰富，真菌和细菌一旦繁殖起来，比植物细胞生长快得多，很快就会将养分耗尽，使植物得不到营养，同时还要浸染植株，使之受到损害。所以，培养基、培养用具都必须灭菌。在组织培养过程中，涉及培养瓶、培养基、器皿、材料、接种工具、操作环境、培养室和工作台面等的灭菌，都要保证无菌，才能达到无菌的目的。

实验步骤

1 外植体预处理：当年生萌动状态的饱满嫩枝作为外植体，剪去所取杉木茎段的叶片，用自来水冲洗干净。

2、消毒：a 5%洗衣粉浸泡5分钟，自来水以流水冲洗干净1h；b 蒸馏水冲洗3-5次，置超净工作台备用；c 用75%酒精浸泡30秒后；d 0.1%升汞溶液消毒10min；无菌水冲洗6遍。

3、接种：

a 培养瓶灭菌：将培养瓶拿成斜角，使瓶口在酒精灯火焰上方灼烧数秒。

b用灼烧过的冷却的镊子取外植体材料转接到培养瓶中，轻轻插入培养基；

c 接种完毕，将瓶口在火焰上转动灼烧，封口。

d 操作期间，经常用70%酒精擦拭工作台和双手，镊子反复在95%酒精中浸泡和火焰上灼烧灭菌。

注意事项

1接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中

2整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速

3防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求

4接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口

5 瓶盖朝上放置，接种完毕立即盖好瓶口

6 接种完一瓶用火灼烧镊子或接种针防止交叉污染

7 种子或分生组织培养，贴放培养基表面，不是插到内部，防止供氧不足

8 接种茎段，注意形态学下端插入培养基内，形态学上端露于空气中

实验小结

本次实验讲解了植物组织培养的原理，要求学生理解组培的理论基础，以及通过实验，熟练掌握外植体处理和消毒接种技术。