血清胆固醇的定量测定

（磷硫铁法）

实验目的

掌握磷硫铁法测定血清胆固醇的原理和方法。

实验原理

（一）胆固醇的生理功能：

–参与血浆蛋白的组成；

–细胞膜的结构成分；

–胆汁酸盐、肾上腺皮质激素和维生素D等的前体。

(二)测定原理：

总胆固醇的测定有化学比色法(磷硫铁法和邻苯二甲醛法)和酶学方法(试剂盒)两类。本实验采用磷硫铁法测定血清胆固醇含量。

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯溶解在无水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫铁试剂，胆固醇及其酯与试剂形成比较稳定的紫红色化合物，此物质在560nm波长处有特征吸收峰，可用比色法作胆固醇的定量测定。正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值在110～220mg/100ml。

胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系。

试剂

（一）10％三氯化铁溶液：10gFeCl3.6H2O(A.R)溶于磷酸(A.R)，定容至100ml。储于棕色瓶，冷藏。

（二）磷硫铁试剂：取10％FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶内，加浓硫酸 (A.R)至刻度。

（三）胆固醇标准储液：准确称取胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml。

（四）胆固醇标准溶液：将储液用无水乙醇准确稀释10倍即得。每毫升含0.08mg胆固醇。

操作

（一）吸取血清0.1ml于干燥离心管，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇2.0ml，摇匀，10分钟后离心（3000rpm5分钟），上清夜备用。（分两次加入乙醇的目的是使作用完全）

（二）取干燥试管3支，编号，分别加入 无水乙醇1.0ml（空白管）、胆固醇标准溶液1.0ml（标准管）、上述乙醇提取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂1.0ml，摇匀，10分钟后，分别转移至0.50cm光径的比色杯内，用分光光度计560nm比色。 计算

（一）通过制作标准曲线来求得血清胆固醇的含量。

（二）因胆固醇含量在400mg/100ml内，与A（或OD）值呈良好线性关系，可由吸光值A的比值求其含量A2C2，本实验即用此法。 ?A1C1

（三）如按方法一使用血清为样品，亦可根据线性关系计算

血清胆固醇mg%=血清胆固醇mg/100ml?

A2=标准液吸光值

A1=样品液吸光值

A2100A2?0.08?＝?200 A10.04A1

 

第二篇：脂肪酸酸价测定与血清胆固醇的测定

脂肪酸酸价测定与血清胆固醇的测定

一、实验目的

1.了解脂肪酸价测定的原理和方法；

2.了解并掌握胆固醇测定的醋酸酐法。

二、实验原理

A、  天然油脂长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败。酸败是由于油脂水解释放出的游离脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味。酸败的程度用酸价来表示。酸价是中和1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的毫克数。

         油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应式如下：

         RCOOH + KOH               RCOOK + H₂O

B、  血清意胆固醇测定对高脂血症的诊断、冠心病和动脉粥样硬化和防治均有意义。血清总胆固醇升高常见原发性高胆固醇血症、肾病综合症、甲状腺机能减退、糖尿病等疾病。

胆固醇的测定临床常用的比色法有两类：

1、固醇化的氯仿式醋酸溶液中加入醋酸酐-硫酸试剂，产生蓝绿色。

2、固醇的醋酸、乙醇式异丙醇溶液中加入高铁-硫酸试剂产生紫红色。

         由于胆固醇颜色反应特异性差，直接测定往往受血液中其倔因素干扰，所以精细的方法是先经抽提，分离及纯化等步骤，然后显色定量。

         本实验采用醋酐-硫酸单一试剂显色法。本法测定100ml血清总胆固醇的正常值为125~200mg。

         醋酐能使胆固醇脱水，再与硫酸结合生成绿色化合物。反应如下：

三、实验器材

A、

1.油脂

2.天平

3.碱式滴定管

4.三角烧瓶

5.量筒

6.水浴锅

B、

1.血清

2.试管

3.吸管

4.容量瓶

5.烧杯

6.电子分析天平

7.722型分光光度计

四、实验试剂

A、

1.0.100mol/L KOH标准溶液

2.1%酚酞指示剂：用70%~90%乙醇配置

3.中性醇醚混合液

B、

1.胆固醇标准溶液

2.硫脲显色剂

五、实验步骤

A、

1.配置中性醇醚混合液

         取95%乙醇和乙醚按1:1等体积混合，混合液加入酚酞指示剂数滴，用0.100mol/L KOH溶液滴定中和至红色。

2.准确称取油脂1~2.000g于100ml三角瓶中，加入醇醚混合液50ml，振摇溶解（固体脂肪需水浴熔化再加入混合液）或40℃水浴中熔化至透明，溶液由红色变为无色，继续用0.100mol/L KOH标准液滴定至淡红色，1 min不褪色为终点，记录KOH的用量V（ml）。

B、醋酸酐法测胆固醇含量：

         取干燥试管3支，分别标明“空白管”、“测定管”及“标准管”，按下表进行操作：

         快速加入显色剂，立即混匀，于37℃水浴中保温10min，取出后，立即以显色剂作为空白调零点，在620nm波长处进行比色。

六、数据与处理

A、

脂肪的酸价=

M_油1=4.50g      V₁=2.72ml        酸价=3.39

M_油2=4.33g      V₂=2.58ml        酸价=3.34

B、

第一次实验

第二次实验

七、实验讨论

1.在测定脂肪酸酸价试验中滴定中性醇醚混合液的过程时变色点较难把握，容易滴过量，这会导致最终实验结果偏低；

2.滴定油脂的过程中可能因脂肪酸未完全溶解混合不充分导致终点判断失误，即在未滴定完全时判断终点，这会导致结果偏小；

3.醋酸酐法测定时操作必须迅速，否则显色后光照会使溶液褪色影响测定结果。