实验四  凝胶过滤法分离蛋白质

课程名称：生物化学与分子生物学实验课            年级：2005 

专业、层次：临床医学本科         　　　　　　   授课教师：符伟玉

职称：讲师                      　　　　　　    学时：4学时

基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》

教学目的与要求：

1、熟悉凝胶过滤法分离蛋白质的基本原理。

2、掌握凝胶过滤法分离蛋白质的实验操作。

3、掌握凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别。

大体内容与时间安排：

1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理                    10min

2、凝胶过滤法的操作示范及注意事项                10min

3、学生做实验                                    140min

教学方法：讲授式+启发式

教学重点、难点：

重点：1、凝胶过滤法分离蛋白质的原理

2、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

3、实验操作中的装柱

难点：1、凝胶过滤与PAGE中分子筛效应的区别

      2、实验操作中的装柱

一、实验原理

凝胶过滤又叫分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，待其与柱充分接触后随洗脱液往下渗，小分子蛋白质进入小孔内，因而在柱内停留的时间长，大分子蛋白质不能进入小孔径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。本实验高铁血红蛋白分子量大，不易渗入颗粒小孔，被排阻在凝胶颗粒之外，先流出层析柱。高铁氰化钾【K₃Fe(CN)₆】分子量小，渗透到颗粒小孔的内部，洗脱时间长，后流出。这样就可以达到分级分离的目的。

在血红蛋白(Mw＝64 500)中加入过量的高铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。

二、操作步骤

1、凝胶准备  称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。

2、装柱  取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。

3、样品处理

（1）血红蛋白溶液的制备：取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3 000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl₄，用力振摇3min，3 000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃暂存，一周用完)。

（2）样品：血红蛋白液3滴加K₃Fe(CN)₆ 8滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。

4、上样、洗脱：打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。

5、分部收集：用自动部分收集器，以5滴/min，10滴/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K₃Fe(CN)₆色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。

6、测定：将每管收集液加入蒸馏水至4ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管编号为横坐标，绘出洗脱图谱。

三、注意事项

1、装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。

2、上样时一定要靠近凝胶柱表面、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。

3、收集要及时，不能等红褐色物质流出之后再收集。

4、流速不可太快。

5、尽量保持各管收集的液量一致。

6、洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干。

7、洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。

小     结

凝胶过滤（又名：分子筛层析）是分离蛋白质、酶、核酸等生物大分子的常用手段。葡聚糖凝胶（商品名：Sephadex）是最常用的一种具有分子筛作用的物质。

凝胶过滤主要用于分子量有明显差异的不同物质的分离。不同型号（交联度、孔径不同）的Sephadex应用于不同分子量范围。本实验应用Sephadex G-25分离高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)和高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品。

 

第二篇：凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质

实验六凝胶过滤层析法分离纯化蛋白质

一、实验目的

1. 了解凝胶层析的原理及其应用。

2. 掌握利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验技能

二、实验原理

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

Ve（洗脱体积）为某一成分从加入样品算起，到组分的最大浓度（峰）出现时所流出的体积。Ve随溶质的相对分子质量的大小和对凝胶的吸附等因素而不同。一般相对分子质量较小的溶质，它的Ve值比相对分子量较大的溶质要大。通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。Vo为层析柱内凝胶颗粒之间隙的总容积，称外水体积。Vi为层析柱内凝胶内部微孔的总容积，称内水体积，Vi=Vt-Vo。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

Kav是判断分离效果的一个重要参数。当某种成分的Kav=0时，意味着这一成分完全被排阻于凝胶颗粒的微孔之外而最先被洗脱出来，即Ve=Vo。当某种成分的Kav=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，而最后被洗脱出来，即Ve=Vt。介于两者分子量之间的物质，其0﹤Kav﹤1，在中间位置被洗脱。可见，Kav的大小顺序决定了被分离物质流出层析柱的顺序。

本实验采用葡聚糖凝胶G－75作固相载体，可分离分子量范围在2000～70000之间的多肽与蛋白质。上样样品为牛血清蛋白（M.W.=67000）和溶菌酶(M.W.=14300)的混合溶液。当混合液流经层析柱时，两种物质因Kav值不同而被分离。

三、仪器与试剂

1.器材：层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测器、记录仪、量筒、烧杯、试管、吸管、玻璃棒等。

2.试剂

  （1）标准蛋白

      a.牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）

      b.溶菌酶：Mw =14,300

  （2）洗脱液：0.9% NaCl溶液

  （3）蓝色葡聚糖－20##、葡聚糖凝胶Sephadex G-75。

四、实验内容

（一）凝胶的前处理（已做好）

将Sephadex G-75置烧杯中，加入洗脱液于室温溶胀2～3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2～3小时（可去除颗粒内部的空气及灭菌）。在凝胶溶胀时避免剧烈搅拌，以防凝胶交联结构的破坏。

（二）装柱（已做好）

取洁净的的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在柱中注入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆液缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1～2cm 高度后打开出水口，使凝胶沉降，并不断加入凝胶浓浆。注意装柱过程中注意凝胶不能分层。

（三）平衡

装柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化钠为流动相，以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度开始洗脱，用1～2倍床体积的洗脱液平衡，使柱床稳定。（实验中平衡1hr）

（四）凝胶柱总体积（Vt）的测定。

平衡完毕后，测定凝胶柱床的高度，计算柱床总体积Vt（凝胶柱直径为1 cm或1.6cm）。

（五）V₀的测定

打开出水口，使残余液体降至 与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取0.2ml（4mg/ml）蓝色葡聚糖-2000，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集！），等溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液冲洗2次，待渗入胶床后，再在柱上端加满洗脱液，开始洗脱，作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点（肉眼观察）的洗脱液体积即为V₀。

蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液继续平衡１～２倍床体积（实验中平衡1hr），以备下步实验使用。

（六）上样、洗脱

将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口。用移液管吸取0.5mL蛋白质混合液小心地加到凝胶床上，打开出水口，待样品完全进入凝胶后，加少量洗脱液冲洗柱内壁2次，待液体完全流进床内后，关闭出水口。在柱上端加满洗脱液，打开恒流泵，开始洗脱收集，6min一管。用紫外分光光度计测定各管收集液的OD₂₈₀值，以洗脱体积为横坐标，OD值为纵坐标绘出洗脱曲线。

（七）凝胶柱的处理（不做）

一般凝胶柱用过后，反复用蒸馏水（2～3倍床体积）通过柱即可。如若凝胶有颜色或比较脏，需用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗涤，再用蒸馏水洗。冬季一般放2个月无长霉情况，但在夏季如果不用，需要加0.02%的叠氮化钠防腐。

五、结果与讨论

1.       绘制洗脱曲线。

以洗脱体积为横坐标、OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出洗脱曲线。并标出各成分的Ve值。

2.       计算各成分的Kav值。

六、思考题

1.       某样品中含有1 mg A蛋白（Mr 10,000Da），1 mg B蛋白（Mr 30,000Da），4 mg C蛋白（Mr 60,000Da），1 mg D蛋白（Mr 90,000Da），1 mg E蛋白（Mr 120,000Da），采用Sephadex G75（排阻上下限为2,000 －70,000Da）凝胶柱层析，请指出各蛋白的洗脱顺序。

2.       利用凝胶层析法分离混合样品时，怎样才能得到较好的分离效果？

3.       怎样计算各种蛋白质的相对含量？