动物肝脏中DNA的提取和鉴定
一、实验目的
1.学习并掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。
2.掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。
3.学习核酸染色的方法。
二、实验原理
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及浓度不同,要选择适当的材料提取DNA。动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA。微生物中,谷氨酸菌体含7%~10%,面包酵母含4%,啤酒酵母含6%,大肠杆菌9%~10%。
从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。对于低等生物,如从病毒中提取DNA比较容易,多数病毒DNA相对分子量较小,提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA难度大些。细菌DNA相对分子质量较大,一般达2×109Da。因此易被机械张力剪短。细菌DNA,除核DNA外,还有质粒DNA等。
1.DNA的基本功能
生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板,是生命遗传繁殖的物质基础,也是个体生命活动的基础;作为DNA分子中的某一区段,有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。
2.核酸的结构与功能
核酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。天然存在的核酸有两类,一类为脱氧核苷酸(deoxyribonucleic acid,DNA),另一类为核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)。DNA存在于细胞核和线粒体中,携带遗传信息。RNA存在于细胞质和细胞核内,参与细胞内DNA遗传信息的表达。
3.DNA的存在形式
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞核中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖、RNA及无机离子等,从中分离DNA。DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中几乎不溶解,如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低,仅为在水中溶解度的1%,随着盐浓度的增加溶解度也增加,至1mol/L氯化钠中溶解度很大,比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小,在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此在提取时
常用此方法分离这两种核蛋白。
4.核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样纤维状物。除肌甘酸,鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中。DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中稳定。
5.细胞的破碎
细胞有坚硬的细胞壁,首先要破碎细胞。方法有三种:
(1)机械方法:超声波处理法、研磨法、匀浆法;
(2)化学试剂法:用SDS处理细胞;
(3)酶解法:加入溶菌酶或蜗牛酶,都可使细胞破碎。
6.DNA的提取方法(在这里只介绍浓盐法)
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将两者分离,常用的方法是用1mol/L氯化钠提取抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使之乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐分离出来。也可用0.15MNaCl液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1mol/L NaCl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。在提取过程中为抑制组织中DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。通常用1.5mol/L NaCl,0.015mol/L柠檬酸钠,并称为SSC溶液,提取DNA。
7.DNA的琼脂糖凝胶电泳
DNA分子在PH值高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动,除了荷电效应外,还有分子筛效应。由于DNA分子片段的相对分子量不同移动速度也不同,所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA片段分离。 0.6%~1.4%琼脂糖凝胶适用于3×106~11×106相对分子质量的DNA分子或片段的分离,所需DNA样品量为0.5~1.0ug。
琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。
溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间,形成一种荧光络合物。在254nm
波长紫外光照射下,呈现橙黄色的荧光。用溴化乙锭检测DNA,可检出10-9g以上的DNA浓度。
三、材料、试剂与仪器
(一)材料:动物肝脏
(二)试剂
(1)0.14mol/LNaCl-0.15mol/L EDTA-Na溶液:
(2)20%SDS溶液:
(3)氯仿一异戊醇(24:1)混合液:
(4)95%乙醇溶液。
(5)80%乙醇溶液。
(6) pH8.0TE缓冲液:10 mmol/LTris-HCI,lmmol/L EDTA,其中含RNA酶20ug/ml。
(7)电泳缓冲液:Tris-硼酸-EDTA(50×TBE)pH8.0。
(8)加样缓冲液:0.25%溴酚蓝(BPB)40%蔗糖。
(9)溴化乙啶(EB)溶液:10μg/ml。
(10)琼脂糖凝胶:浓度为0.7%。
(三)仪器
(1)稳压稳流电泳仪 (2)可调微量移液器
(3)水平电泳槽 (4)暗箱紫外透射仪等。
四、实验步骤
1.取新鲜动物肝,称取2g,切成小块,加入4ml 0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液,于研钵中研磨至匀浆,4ml清洗转入离心管中,以4000r/min的转速离心 10min。
2.在上述沉淀物中加入0.14mol/L NaCl-0.15mol/L EDTA溶液,使总体积为 4mL,然后在60℃下,滴加 20%SDS溶液2-3滴,边加边摇动,再摇动 10min,使核酸与蛋白质分离。
3. 加固体氯化钠0.4g混匀,使其最终浓度达到l.4mol/L,水浴30min。
4.加等体积的氯仿一异戊醇,混匀,摇动5min以4000r/min的转速离心10min。离心管内的物质分为三层,上层为含DNA的水相层,下层为氯仿一异成醇混合物,中间层为变性蛋白凝胶。
5.吸出上清液,加入2倍体积95%乙醇溶液(预冷),产生沉淀。
6.再以4000r/min的转速离心溶液10min,弃去上清液 (沉淀用80%乙醇溶液离心洗涤)。
7.将沉淀置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥后,加入200ul TE缓冲液,使DNA充分溶解,待用。
8.凝胶板的制备:
(1)取琼脂糖0.7 g,加1×TBE缓冲溶液100ml,于沸水浴中至熔化,制成0.7%的琼脂糖胶液。
(2)胶床两头贴上防水胶带,形成8mm高的挡墙,压紧胶带,置水平台面上。
(3)插入梳子,梳齿下端离板底0.5-1mm。
(4)在胶床上滴加2-3滴 0.5μg/mL的EB溶液。
(5)将60℃凝胶不间断倒入胶床,高3-4mm,避免气泡,摇匀,室温下凝固。
(6)完全凝固后,撕掉胶带,置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,高于胶面1-2mm,从一头轻轻斜拉出梳子,除去产生的气泡。
9.加样:
将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 :1的体积比混合,用微量移液器加样,每加完一个样品,冲洗三次。加样量15~20 ?l (加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部)。
10.电泳:
为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率,电场强度不应高于5V/cm(两电极间的距离)开始时用较高电压(80V),样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm时,电泳毕。
11. 观察
关闭电源,取出胶床,在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA(红橙色荧光)。
五、实验预期结果与分析
观察动物肝脏中DNA的提取电泳图,分析DNA的提取结果和DNA的纯度。
参考文献
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