实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六:动物肝脏中DNA的提取及定量测定

一、实验目的

1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。

2、了解常见生化组分提取技术。

3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。

二、实验原理

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在,其中DNA主要存在于细胞核中,RNA主要存在于核仁及胞质中,在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行,必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性,皂土可抑制RNA酶活性,同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。

动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl),但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低,而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA即与蛋白质分开,可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇,DNA即呈纤维状沉淀出来。

DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛,与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。

DNA(脱氧戊糖基)   [H+]    HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO  二苯胺    蓝色化合物

在DNA浓度为20~200μg/ml范围内,吸光度与DNA浓度成正比,可用比色法测定。

三、实验器材

猪肝,分光光度计(595nm),比色杯,匀浆器,量筒(50ml、10ml),离心机(5000r/min),离心管,试管及试管架,移液管(1.0ml、2.0ml、5.0ml),恒温水浴锅

四、实验试剂

氯化钠,柠檬酸钠,95%乙醇,SDS,氯仿,异戊醇,二苯胺试剂,DNA标准溶液(200μg/m1),二苯胺试剂等。

五、实验操作

1、配制溶液:

0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液(2.925g氯化钠,20.85g柠檬酸钠,溶解于500mL蒸馏水)。

氯仿-异戊醇混合液:按照体积比20:1配制500mL。

5%SDS溶液:10g SDS溶于200ml水中。

二苯胺试剂:称取纯二苯胺(如不纯,需在70%乙醇中重结晶2次)5克溶于500ml分析纯的冰醋酸中,再加入50ml过氯酸(A.R,60%以上),混匀待用。当所用药品纯净时,配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6%乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中,一周内可使用),贮于棕色瓶。

2、称取猪肝2g,用匀浆器磨碎(冰浴),加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液,研磨三次,然后倒出匀浆物,匀浆物在4000r/min下离心10min,弃上清;沉淀中再加入6ml缓冲液,于4000r/min离心10min;取沉淀。

3、在上述沉淀中加入10ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、5ml CHCl3-异戊醇混合液、1ml 5%SDS,振摇15min,然后缓慢加固体NaCl,使其终浓度为1mol/L(约0.9g)。将上述混合液在3500r/min离心15-20min,取上清水相。

4、在上述水相溶液中加入等体积冷95%乙醇,边加边用玻璃棒慢慢搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品。将DNA粗品溶于10ml蒸馏水,待测。

5、标准曲线的绘制

按下表加入各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴保温45min,冷却后,在595nm波长下,于722型分光光度计上比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制定标准曲线。

6、样品的测定吸取DNA样液1.0ml,加入蒸馏水1.0ml,混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml,混匀,于60℃恒温水浴保温45min,冷却后,选595nm波长,于722型分光光度计上比色测定,根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量(μg)。

7、计算猪肝中DNA含量:

w= m1/m2×100%

式中w:DNA的质量分数(%);m1:样液中测得的DNA的质量(μg);m2:样液中所含样品的质量(μg)。

 

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动物肝脏中DNA的提取

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