动物肝脏DNA的提取
点击次数: 414 发表于:2008-07-08 17:32 转载请注明来自丁香园
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一、目的:
了解分离提取DNA的一般原理,掌握从动物肝脏中提取DNA的方法。
二、原理:
在浓氯化钠(1—2mol·L-1)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠(0.14mol·L-1 )溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的核蛋白用SDS(十二烷基磺酸钠)处理,DNA(或RNA)即与蛋白质分开,可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇,DNA即析出。
为了防止DNA(或RNA)酶解,提取时加EDTA(ethy-lenediamine tetracetic acid,乙二胺四乙酸)。
三、器材及试剂:
1.器材:
①新鲜猪肝(一次用不完一定要冷冻保存)
②匀浆器
③离心机5000r·min-1
④量筒50ml(×1)、10ml(×1)
⑤水浴锅
⑥纱布
⑦真空干燥器
2.试剂:
①5mol·L-1 NaCl溶液:将292.3gNaCl溶于水,稀释至1000ml。
②0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA-Na溶液:溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸馏水,稀释至1000ml。
四、操作步骤:
1.取猪肝20~30g,用适量0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗去血液,剪碎,加入约30~50ml0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液,置匀浆器或研钵中研磨,研磨一定要充分,待研成糊状后,用单层纱布滤去残渣,将滤液离心10分钟(4000r·min-1)弃去上清液,沉淀用0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
2.向上述沉淀物加入0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液,使总体积为37ml,然后滴加25%SDS溶液3ml,边加边搅拌。加毕,置60℃水浴保温10分钟(不停搅拌)溶液变得粘稠并略透明,取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。
3.加入5mol·L-1 NaCl溶液10ml,使NaCl最终浓度达到1mol·L-1 ,搅拌10分钟,加入约一倍体积的氯仿-异戊(丙)醇混合液,振摇10分钟,静置分层,取上、中两层液离心10分钟(4000r·min-1)。去掉沉淀,上层清液徐徐加入1.5—2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动,则DNA丝状物即缠在玻棒上。
4.将DNA粗品置于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1柠檬酸三钠溶液中,再加入3ml1.5mol·L-1 NaCl-0.15mol·L-1 柠檬酸三钠溶液,搅匀,加入一倍体积氯仿—异戊(丙)醇混合液,振摇10分钟,离心(4000r·min-1 ,10分钟),倾出上层液(沉淀弃去),加入1.5倍体积95%乙醇,DNA即沉淀析出。离心,弃去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步骤重复一次。
5.将上步所得沉淀溶于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1 柠檬酸三钠溶液中,然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇,边加边搅,取出丝状DNA,依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次,真空干燥。保存待用。
五、结果与讨论:
1.所提取的DNA是否是纯品?如何进一步提高其纯度?
2.DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
实验六:动物肝脏中DNA的提取及定量测定
一、实验目的
1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。
2、了解常见生化组分提取技术。
3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。
二、实验原理
核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在,其中DNA主要存在于细胞核中,RNA主要存在于核仁及胞质中,在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行,必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性,皂土可抑制RNA酶活性,同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。
动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl),但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低,而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA即与蛋白质分开,可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇,DNA即呈纤维状沉淀出来。
DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛,与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。
DNA(脱氧戊糖基) [H+] HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺 蓝色化合物
在DNA浓度为20~200μg/ml范围内,吸光度与DNA浓度成正比,可用比色法测定。
三、实验器材
猪肝,分光光度计(595nm),比色杯,匀浆器,量筒(50ml、10ml),离心机(5000r/min),离心管,试管及试管架,移液管(1.0ml、2.0ml、5.0ml),恒温水浴锅
四、实验试剂
氯化钠,柠檬酸钠,95%乙醇,SDS,氯仿,异戊醇,二苯胺试剂,DNA标准溶液(200μg/m1),二苯胺试剂等。
五、实验操作
1、配制溶液:
0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液(2.925g氯化钠,20.85g柠檬酸钠,溶解于500mL蒸馏水)。
氯仿-异戊醇混合液:按照体积比20:1配制500mL。
5%SDS溶液:10g SDS溶于200ml水中。
二苯胺试剂:称取纯二苯胺(如不纯,需在70%乙醇中重结晶2次)5克溶于500ml分析纯的冰醋酸中,再加入50ml过氯酸(A.R,60%以上),混匀待用。当所用药品纯净时,配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6%乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中,一周内可使用),贮于棕色瓶。
2、称取猪肝2g,用匀浆器磨碎(冰浴),加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液,研磨三次,然后倒出匀浆物,匀浆物在4000r/min下离心10min,弃上清;沉淀中再加入6ml缓冲液,于4000r/min离心10min;取沉淀。
3、在上述沉淀中加入10ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、5ml CHCl3-异戊醇混合液、1ml 5%SDS,振摇15min,然后缓慢加固体NaCl,使其终浓度为1mol/L(约0.9g)。将上述混合液在3500r/min离心15-20min,取上清水相。
4、在上述水相溶液中加入等体积冷95%乙醇,边加边用玻璃棒慢慢搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品。将DNA粗品溶于10ml蒸馏水,待测。
5、标准曲线的绘制
按下表加入各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴保温45min,冷却后,在595nm波长下,于722型分光光度计上比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制定标准曲线。
6、样品的测定吸取DNA样液1.0ml,加入蒸馏水1.0ml,混匀。然后准确加入二苯胺试剂4.0ml,混匀,于60℃恒温水浴保温45min,冷却后,选595nm波长,于722型分光光度计上比色测定,根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量(μg)。
7、计算猪肝中DNA含量:
w= m1/m2×100%
式中w:DNA的质量分数(%);m1:样液中测得的DNA的质量(μg);m2:样液中所含样品的质量(μg)。
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