实验七 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳

一、实验目的

1、进一步掌握电泳的基本原理及凝胶电泳的原理。

2、熟悉琼脂糖凝胶电泳的特点和操作要点。

3、掌握正常人血浆脂蛋白的分类。

二、实验原理

琼脂糖凝胶是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖的残基通过氢键交替排列组成的直链多糖。电泳时，因为凝胶中含水量大（98%-99%），固体支持物的影响较少，故电泳速度快、区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很小，是一种良好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质均与载脂蛋白结合成水溶性脂蛋白形式存在，各种脂蛋白所含载脂蛋白的种类及数量不同，因而不同脂蛋白颗粒大小相差很大。因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分开。

将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行分离，通电后，可以看到脂蛋白被分成三条区带，从负极到正极依次为β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最浅）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原点处应无乳糜微粒。

此法应用于高脂蛋白血症的分型。

三、器材和试剂

1、器材：电泳仪、电泳槽、离心机、水浴锅、染色盘、微量注射器、滤纸、镊子剪刀、2cm*8cm玻璃片

2、试剂

⑴巴比妥缓冲液（PH8.6）：称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及

EDTA0.29g,加水溶解后，再加蒸馏水定容至1000ml（PH为8.6，离子强度0.075），作为电极缓冲液。

⑵苏丹黑染色液：将苏丹黑0.5g溶于无水乙醇5ml中至饱和。

⑶凝胶缓冲液：称取三羟甲基甲烷（Tris）1.212g，EDTA0.29g及Nacl5.85g,用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml。调PH至8.6.

⑷琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.50g溶于50ml凝胶缓冲液中，再加水50ml，在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。

⑸新鲜血清（无溶血现象）

四、操作步骤

1、预染血清 血清0.2ml加苏丹黑染色液0.02ml与试管中，在混合后置于37℃水浴染色30分，然后离心（2000r/min）约5分。

2、制备琼脂糖凝胶板 已配制的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴（或微波炉）中加热融化，用10ml吸管吸取约3ml凝胶溶液浇注在载玻片上，静置约半小时后凝固（天热时需延长，可放冰箱数分钟加速凝固）。

3、点加预染血清 在已凝固的琼脂糖凝胶板距一端2cm处，用自制打孔器（在小玻璃片的两面固定两片小胶片）垂直打入凝胶后立即取出，然后用胶片剥出长方小条凝胶。用小片滤纸吸干小槽中的水分，注意不要损坏槽边缘的凝胶。最后，再用微量注射器吸取经过预染的血清约20ul注入凝胶板上的小槽内。

4、电泳 将加过血清的凝胶板平行放于电泳槽中，样品放于负极一端。用两层滤纸或纱布于巴比妥缓冲液浸湿，然后轻轻紧密贴在凝胶板两端，纱布的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，接通电源，电压为100-120V，每片电流为3-4mA，约经电泳40-60分，可见分离脂蛋白色带。

 

第二篇：琼脂糖凝胶电泳实验技巧

琼脂糖凝胶电泳实验技巧

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

操作过程中要注意以下一些问题。

1 凝胶制作

1.1 凝胶浓度

  凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0.8％～2.0％之间，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定。补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值，以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0.5t*g／ml；也可在电泳结束后染色。

1.2 梳板的选用  

一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。

2 点样

    在样品中加入上样缓冲液，上样缓冲液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使样品沉入孔底；上样缓冲液中一般还含有两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)，用于指示样品的迁移过程。上样缓冲液储存液一般为6×(10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直对准点样孔，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将Tip尖插至孔底。同时点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。

3 电泳

    将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连。核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时所加电压一般不超过5v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实验需要也可作适当调整。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。

4 结果分析

较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰。

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