琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白

【目的】

1. 掌握琼脂糖凝胶电泳法分离预染血清脂蛋白的实验原理和操作方法。

2. 熟悉血清脂蛋白改变在临床上的重要意义。

【原理】

电泳是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其自身所带电荷相反的电极移动的现象。根据电泳支持物的不同，血清脂蛋白电泳可分为滤纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳四类。由于各种脂蛋白所含载脂蛋白和脂类的种类及数量不同，分子量大小相差较大，并且在一定 pH 值溶液中所带电荷量不同，电泳移动的速度必然有差别，因此，通过电泳可以将不同种类的血清脂蛋白彼此分离。

血清脂蛋白经苏丹黑 B 预染后，以琼脂糖为载体，在 pH 8.6 巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带（图 3-9 ）。正常人空腹状态下，血清脂蛋白电泳后可出现三条区带，从阳极到阴极依次为 α- 脂蛋白带、前 β- 脂蛋白带及 β- 脂蛋白带。点样槽处不会出现乳糜微粒，有时前 β- 脂蛋白也显示不出来。区带的宽窄及颜色的深浅粗略地反应了各种脂蛋白的量。

另外，可以将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。或者，将电泳后凝胶板上各区带切下，比色定量分析出各种脂蛋白的百分比含量。

图 3-9 预染血清脂蛋白电泳图谱

【器材】

1 ．电泳仪

2 ．恒温水浴箱

3 ．离心机

4 ．微量加样器

5 ．烫槽器

6 ．载玻片

7 ．扫描仪

8 ．分光光度计

9 ．小号试管

10 ．吸管

11 ．纱布

12 ．烘箱

【试剂】

1 ．电泳缓冲液（ pH8.6 ，离子强度 0.075 的巴比妥缓冲液）

称取巴比妥钠 15.458g ，巴比妥 2.768g ，乙二胺四乙酸（ EDTA ） 0.29g ，加适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。

2 ．凝胶缓冲液（ pH8.6 三羟甲基氨基甲烷缓冲液）

称取三羟甲基氨基甲烷 1.212g ， EDTA 0.29g ， NaCl 5.85g ，用适量蒸馏水溶解后加至 1000ml 。

3 ．琼脂糖凝胶（ 1% ）

称取琼脂糖 1g ，溶于 50ml 凝胶缓冲液中，再加蒸馏水 50ml ，然后在水浴中加热至沸腾，待琼脂糖完全溶解后立即停止加热并分装于试管中，冰箱 4℃ 保存，备用。

4 ．苏丹黑 B 染色液

将适量苏丹黑 B 加到无水乙醇中至饱和，震荡使之乙酰化，用前过滤。

5 ．固定液

取冰醋酸 5ml 加 75% 乙醇 95ml 。

6 ．预染血清

取空腹血清 0.18ml ，加苏丹黑 B 染色液 0.02ml ，混合后置于 37℃ 水浴中染色 30min ， 2000r/min 离心约 5min 以除去悬浮于血清中的染料沉渣，取其上清液即为预染血清。

【操作】

1 ．制备琼脂糖凝胶板

将已配制好的 0.9~1% 琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在水平放置的载玻片上，每片约 3ml 。静置约 5~10min 即能凝固（天热时需延长时间，也可放入冰箱中数分钟加速凝固）。在即时凝固的凝胶板一端约 2cm 处用烫槽器加热后稍用力下压使之下陷接近玻片，切忌勿透，用滤纸片吸干槽中水分。

2 ．加样

用微量加样器取预染血清约 15μl 注入凝胶板加样槽中。

3 ．电泳

将已加入预染血清的凝胶板水平移至电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用电泳槽缓冲液把四层纱布浸湿做成 “ 引桥 ” ，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约 1cm 左右， “ 引桥 ” 的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中，使血清样品扩散进入凝胶， 5min 后接通电源，电压 120~130V ，电流约为 3~4mA/ 凝胶板，电泳 40~50min ，待最前端区带电泳至玻片 2 ／ 3 处时即可终止电泳。

4 ．固定

将电泳后的凝胶板浸入固定液中固定约 20min ，以增强区带的不溶性和加强与染料的结合力。

5 ．漂洗与烘干

将固定后的凝胶板用自来水漂洗数次，然后置于 80℃ 烘箱中烘干成薄片状保存或进行扫描定量。

6 ．定量测定

（ 1 ）扫描定量：将已烘干的凝胶片直接放到吸光度扫描仪上，通过扫描得出各种脂蛋白的百分比含量。

（ 2 ）比色定量：将电泳后凝胶板上各区带切下，另外取相当于区带宽窄的无色凝胶作为空白对照，分别移入盛有 3ml 蒸馏水的试管内，将各管同时置于沸水浴中 5min 溶解为透明澄清的溶液，稍冷却，用分光光度计，选波长 600nm ，分别记录各管吸光度值。

【计算】

血清某种脂蛋白占血清总脂蛋白的百分比，按以下公式计算：

【注意事项】

1 ．电泳样品应为新鲜的空腹血清。

2 ．加热溶化琼脂糖时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。

3 ．点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。

4 ．琼脂糖凝胶的浓度如果大于 1% ， β- 脂蛋白和前 β- 脂蛋白不易分开；浓度过低，则凝胶的机械强度太低，不易操作。

5 ．浇注琼脂糖凝胶板要尽量使厚薄均一，否则会影响脂蛋白的分离效果。

6 ．将凝胶板放入电泳槽中，应切记与电力线平行、样品端置阴极、引桥纱布不能搭在样品上。

7 ．如果用一形状大小和小槽一样的有机玻璃片，在琼脂糖凝胶凝固前固定于适当位置上，当凝固后取出有机玻璃片，凝胶板上即留下小槽可直接加样。

8 ．正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量参考值见表 3-11 。

表 3-11 正常人空腹血清各种脂蛋白百分比含量

【思考题】

1 ．琼脂糖凝胶电泳的原理的优缺点是什么？

2 ．试比较血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳与预染血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。

3 ．试分析前 β- 脂蛋白与 α- 脂蛋白含量改变分别对人体健康的影响。

 

第二篇：04 生物化学实验--醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白

【目的】

1 ．掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的操作技术与原理。

2 ． 熟悉醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的临床意义。

【原理】

带电粒子在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象称为电泳 (Electrophoresis) 。蛋白质为两性电解质。在不同 PH 下，其带电情况不同。在等电点时，蛋白质为兼性离子，其实效电荷为零，不发生泳动。蛋白分子在 pH 小于其等电点的溶液中，呈碱式解离带正电向负极泳动。在 pH 大于其等电点溶液中， 呈酸式解离带负电，泳向正极。带电粒子在电场中的泳动速度常用迁移率 (Mobility) 来表示。它除与电场强度、溶液的性质等有关外，主要决定于分子颗粒的电荷量以及其分子的大小与形状等。电荷较多，分子较小的球状蛋白质泳动较快。

血清中的各种蛋白质的等电点均低于 7 ，故在 PH8.6 缓冲液中，均带负电荷。由于各种蛋白质的等电点不同，带电荷量不等，加之分子量不同，导致在电场中泳动速度不同，从而加以分离。清蛋白泳动最快，其次为 α 1 、α 2 、β及γ 球蛋白。将蛋白质固定染色后，洗去多余染料，可看到清晰的色带（图 3-3 ）。将各色带剪开，分别溶于碱性液中，可进行比色分析，计算出各种蛋白质的百分含量，或用吸光度计进行扫描定量。

图 3-3 正常人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳示意图谱

【器材】

1 ．电泳仪 ( 稳压器、电泳槽 )

2 ．分光光度计

3 ．点样器 (1.4× 1.8cm 的 X 光片 )

4 ．血清 ( 放置于载玻片上 )

5 ．醋酸纤维薄膜 (2× 8cm )

【试剂】

1 ． pH8.6 0.06M 巴比妥缓冲液

取巴比妥 1.62g ，巴比妥钠 12.38g ，用蒸馏水加热溶解冷却后加至 1000ml 。测试 pH 值，若 pH 偏离 8.6 ，可用 1mol/LHCl 或 NaOH 校正。

2 ．染色液 ( 任选其一 )

（ 1 ）氨基黑 10 B 1g ，三氯醋酸 13.4g ，磺柳酸 13.4g ，蒸馏水加至 1000ml 。

（ 2 ）丽春红 2 R 0.8g ，溶于 6% 三氯醋酸 100ml 中。

3 ．漂洗液

（ 1 ） 3% 冰醋酸溶液 ( 用于氨基黑染色 )

（ 2 ） 2.5% 醋酸溶液 ( 用于丽春红染色 ) ；

4 ．洗脱液

0.4mol/LNaOH 溶液。

5 ．透明液

冰醋酸 30ml ，无水乙醇 70ml ，醋酸乙酯 1ml 混匀。

【操作】

? 准备

电泳槽内放适量的缓冲液于两侧。液槽间放一充满缓冲液的连通管，经过一定时间使两侧液面达到平衡后，取下连通管。

在电泳槽的两侧液槽内侧的支持板上分别用四层滤纸 ( 或纱布 ) 搭桥。即使其一端达到支持板上，另一端浸入缓冲液中。

在醋酸纤维薄膜 ( 2cm × 8cm ) 的无光泽面距一端 1.5cm 处，用铅笔画一线 ( 与此端平行 ) 。作为点样线。把膜放进缓冲液中浸泡数 h ，使膜完全浸透。

? 点样

用点样器均匀蘸取血清后，垂直将血清点在薄膜的点样线上，使血清全部渗入膜内。

? 电泳

将点样后的膜条置于电泳槽架上。放置时点样面向下，点样端置于阴极侧。槽架上四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，膜条要拉展。约平衡 5min 后通电。电压为 6V/cm 长 ( 长指膜条与缓种液面上的滤纸桥总长度 ) ，电流为 0.4~0.8mA/cm 宽，夏季通电约 45min ，冬季通电约 1h 。关闭电源。

? 染色与漂洗

通电毕，用无齿小镊子将膜取出并水平移于染色液中固定染色， 2~5min 后取出立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景无色为止。用滤纸吸干多余的漂洗液。此时可见界限清晰的五条区带 ( 氨基黑染色为蓝黑色区带，丽春红染色为红色区带 ) 。最前面的一条为清蛋白带。如右图：

? 定量分析

取试管 6 支，编号，分别用吸量管吸取 0.4mol/L NaOHml 。剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使颜色洗出。约半小时后用分光光度计进行比色。氨基黑 10B 染色者，选用 620nm 波长，丽春红染色者选 580nm 波长。用空白管调 “0” ，分别读取各管吸光度值之和作为 100% ，求出每管吸光度值占总吸光度值的百分数，即该种蛋白质占血清蛋白的百分比含量。

另外，如用吸光度计扫描，需要先使膜透明化。可把染色后干燥的薄膜放透明液中 10~20min ，取出贴到玻璃板上放干。得到透明薄膜，可用吸光度扫描计描记出电泳曲线。亦可据此算出各蛋白百分数。正常血清血清蛋白的等电点、分子量及含量见表 3-1 。

表 3-1 正常血清蛋白的等电点、分子量及含量

血清蛋白电泳结果有一定临床意义。肝硬化清蛋白明显降低。而 γ – 球蛋白可增高 2~3 倍。肾病综合症和慢性肾小球肾炎时可见到清蛋白降低， α 2 和 β 球蛋白增高。从电泳谱上亦可查出某些异常，例如多发性骨髓瘤病人血清，有时在 β 和 γ 球蛋白之间出现巨球蛋白。原发性肝癌病人血清在清蛋白与 α 1 球蛋白之间可见到甲胎蛋白。

【注意事项】

? 点样线要细窄、均匀、集中，量不宜过多，保持薄膜清洁。

? 盐桥及醋纤膜要放置平整，保证电场均匀。

? 严格控制好电流，电压与电泳时间。电压高，电流强度大，则电泳快，电泳时间虽可缩短，但其产热多，薄膜上水分蒸发也多，严重时会使图谱短而不清晰；相反，电流、电压过低，电泳所需时间延长，由于样品的扩散，也不能获得良好的图谱。一般气温低时，可用较大的电流、电压；气温高时，则宜用较低的电流、电压。

【思考题】

1 ．为什么薄膜的点样面朝下，点样端置于阴极？

2 ．用醋酸纤维薄膜作为电泳的支持物有何优点？