分离土壤中分解尿素的细菌和计数

                          制作：邹霖

1.实验目的：从土壤中分离出能够分解尿素的细菌，计数

2.实验原理：A.培养基中加入唯一氮源--尿素，能分解尿素的细菌自身能够合成脲酶，能够分解利用尿素中的氮元素，从而能够生存繁殖；不能分解尿素的细菌的繁殖受到抑制，从而达到分离出土壤中能分解尿素的细菌的作用。B.使用酚红鉴定尿素是否被分解.CO(NH2)2分解产生NH3使溶液显碱性.如果尿素被分解，则酚红会显红色，C.分解原理.

CO(NH2)2+H2O==脲酶==CO2+NH3 D.稀释涂布平板法. 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释浓度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。E.计数菌落，一个或几个细菌可以繁殖为一个肉眼可见的菌落（计数结果低于实际细菌数）

3.提出问题：尿素分解后NH3的产生是否会影响实验？

4.做出假设：尿素分解后NH3的产生会影响实验。

5.实验材料用具：超净工作台、取样铲、试管、锥形瓶、恒温培养箱、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、酒精、无菌水、地面以下3-8CM处的土壤、培养基A（磷酸二氢化钾 1.4g 磷酸氢化二钠 2.1g   七水合硫酸镁 0.2g  葡萄糖10g   尿素1g  琼脂 15g）培养基B（牛肉膏蛋白胨培养基） 涂布器、干热灭菌箱、烧杯、胶头滴管

6.实验步骤：

          1.对实验用具消毒灭菌；按配方称取上述物质，将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000ml。

          2.配置好培养基后，将培养基A.B倒置都放入恒温培养箱中培养1d，取出后观察是否产生了菌落，若无，则继续下一步实验。若有，重做~~~~(>_<)~~~~

          3.系列稀释：将分别盛有9ml水的5只试管和90ml水的1个锥形瓶灭菌，并按10~10的顺序编号 锥形瓶编号10。将10g符合条件的土壤放入锥形瓶中，震荡锥形瓶，用移液管吸取1ml菌液，注入标有10的试管中，用手轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。以此类推，直到完成最后一只试管的稀释。（注意：移液管需要经过灭菌，操作时，试管口和移液管应在离火焰1~2cm处）

          4.涂布平板：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中，分别取10.  10 .  10中的少量菌液，分别各滴加到3个培养基A（总计9个）的表面，注明培养基种类，培养日期以及平板上培养样品的稀释程度，取少量无菌水滴加到1个培养基中作为空白对照组，取少量菌液滴加到培养基B中（判断选择培养基是否起到了选择作用），将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8-10S。用涂布器将菌液均匀的涂布在每个培养基表面（每次涂布前都必须用酒精灯灼烧）涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。

          5.将培养基倒置并放入恒温培养箱中培养1-2d

          6.相同稀释程度的3个培养基统计其菌落数（30-300） 取平均值。

         

7.实验结果：1.空白对照组无菌落。

           2.培养基B上的菌落数目多且种类多。

           3.培养基A

8.实验结论：

 

第二篇：生物实验报告

清华大学实验报告

系别：机械工程系 班号：机11 姓名：潘霖 （同组姓名：肖鹤翀胡志鹏）

实验日期： 20##年9月25日

微生物实验

第一部分环境中微生物的检测和分离纯化

一、实验目的

1．学习并掌握无菌操作技术原理和方法。

2．学习用稀释涂布法分离微生物。

3．认识微生物存在的普遍性。

二、实验原理

（一）微生物的分离与纯化：土壤是微生物生活的大本营，微生物数量和种类都极其丰富，因此可以从土壤中分离、纯化得到许多有价值的菌株。微生物常用的分离纯化方法是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般根据不同微生物对营养、酸碱度、温度好、氧等的条件要求的不同，供给它适宜的培养条件，或者加入某种抑制剂造成抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰杂菌，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，得到纯菌株。

（二）平板菌落计数法：将待测样品经过适当稀释之后，使其中微生物尽量分散成单个细胞，接种到平板上，使之形成单菌落。通过统计菌落数，根据稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含菌个数。

三、实验材料和仪器用具

实验材料：

（1）菌源：10g土壤

（2）事先配置好的土壤稀释液（稀释倍数10^5）1ml

（3）液态牛肉膏蛋白胨培养基（足够倒满 12个）

实验仪器：

取液器（100μl，若干），100μl无菌吸头若干，培养皿（12个） ，无菌涂棒，培养箱，酒精灯，打火机，记号笔

四、实验步骤

（一）制作无菌平板

将已经准备好的热的液态牛肉膏蛋白胨培养基用叠皿法均匀倒入灭菌处理过的12个培养皿中，使每个培养皿都有足够的培养基且内部培养基均匀分布，并且尽量不要让培养基有剩余。操作需在酒精灯火焰边的无菌环境下进行，动作要快，以免杂菌进入。倒完后待培养皿冷却凝固，然后倒置待用。

（二）从土壤中分离微生物

1.涂布：在酒精灯火焰边的无菌环境中，用100μl的取液器吸取100μl的土壤稀释液在平板上进行涂布分离。注意每涂一次要转动一下培养皿换一个角度继续涂，并使用灭过菌的无菌涂棒将加入的土壤稀释液涂抹均匀，尽量使之分布均匀。

2.培养：将涂布后的培养皿放入35℃的培养箱中培养24h，然后取出并观察统计菌落个数。

3.计数：同组同学分别观察并统计菌落数，相互对照后舍去离群值，计算出平均值。舍去有较大片菌苔生长的培养皿。若成片的菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，则将分布均匀的一半计数后乘以2作为菌落数。

（计数公式：土壤中的细菌含量（个/g）=菌落平均数*10*10^5）

（三）周围环境中微生物的检测

在牛肉膏蛋白胨平板上作如下实验：

1·取一个平板，分成6个区域，做好标记。同一个同学（潘霖）用同一指头按如下要求用力一致均匀进行实验：分别用未洗过的手指头；用自来水打湿的手指头；自来水认真洗过的手指头；用肥皂或洗手液洗过并冲洗干净1遍的手指头；用肥皂或洗手液洗过并冲洗干净2遍的手指头；肥皂洗后冲洗干净并用75%酒精棉球擦过消毒后的手指头。分别将以上手指在分好的六个区上涂抹（所有实验都不用毛巾擦）。

2·取一个平板，分成4个区域，做好标记。分别用未使用过的餐巾纸，旧纸币，硬币，学生卡在培养基上拖动2~3次，确保物品均与培养基充分接触。

3·取一个平板，分区，用100μl取液器分别取100μl的自来水和河水分别涂布在平板上，并分别用灭菌过的涂棒涂抹均匀。

4·取两个平板，一个打开皿盖，置实验台上（空气中）10min，另一个按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖1min。

5·取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽（必须使口腔中喷出的气流和飞沫落到培养基上）。

6·取一个平板，将稍稍打开的嘴唇在培养基上压一下，检查嘴唇上的细菌。

上述实验操作完成后，将培养皿放在35℃培养箱里培养24小时后观察结果。

五、实验结果

（一）从土壤中分离微生物实验的结果

实验结果如图所示，为培养24h后的结果。

1 培养基边缘有白色菌落生长，有白色斑点状菌落分布于培养基中

 2

培养基边缘有几块白色菌落，中央菌落呈白色，较集中分布。

3培养基边缘有大片白色菌落生长，有少数斑点状白色菌落分布于培养基中，还有一块较大白色的菌落群。

事实上，三个平板的计数都有困难，最后计数结果是大概有40个左右菌落，换算后得土壤中微生物含量约为4*10^7个/g。

（二）周围环境中微生物检测的实验结果

实验1

没洗过的手指头涂抹过的区域有较多淡黄色菌落带状集中分布，自来水打湿过的手指头涂抹过的区域有淡黄色斑点状菌落分布，用自来水认真洗过的手指头涂抹过的区域有较多白色和淡黄色的菌落均匀分布，肥皂冲洗过一次的手指头涂抹过的区域有白色菌落均匀分布，肥皂冲洗过两次的手指头涂抹过的区域有少量白色菌落均匀分布，用酒精棉擦拭过的手指头涂抹过的区域有淡白色菌落带状分布。

六、实验讨论

n  你所取的土壤中细菌数量级为多少？

约为4*10^7个/g。（不知道准不准）

n  从你周围环境中微生物的观察,你认为无菌操作应注意什么?

    从结果来看

n  说明饭前洗手,饭后刷牙的重要性;

    从实验的结果来看，无论是洗过还是没洗过手接种后都会有菌落存在，但是很明显，洗过手和用肥皂洗过手后细菌会少很多。因此从这个角度而言饭前洗手可以大大减少细菌的潜在的危害，是十分重要的。而饭后刷牙这一点，虽然我没做过关于牙垢的实验，但可想而知，既然是牙垢，牙垢是残留的食物，必然已经有很多细菌在上面繁殖。如果饭后刷牙的话可以减少大多数牙垢，从这个角度将自然也大大减少了细菌的潜在危害。

n  在日常生活中如何讲究饮食卫生?

    首先自然要吃东西前洗手，吃东西后漱口或者刷牙，然后还要注意不要去不卫生的地方吃东西，还有不要随便把东西往嘴里面塞，因为细菌无处不在。

第二部分固定化酵母细胞发酵啤酒实验与酸奶制作

一、实验目的

1.       了解固定化细胞技术的方法和意义。

2.       了解酵母发酵产生啤酒的过程。

3.       学习酸奶制作方法。

4.       了解纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别。

二、实验原理

（一）啤酒发酵实验

1.       固定化技术

固定化技术将生物酶或细胞固定在一定的基质上，可以重复利用，从而提供酶或细胞的利用效率。本实验中采用包埋法把酵母细胞固定起来。酵母细胞在载体中能迅速增殖，单位体检中的酵母数目比通常的液体高，并且增殖酵母都凝集在凝胶表面形成浓厚的菌体层，能迅速与基质接触，从而缩短周期提高啤酒产量。

2．固定化技术生产啤酒

固定化细胞能重复使用；发酵后菌体与发酵液易于分离；后处理工艺简单，成本低；连续发酵,过程自动化。

（二）酸奶的制作实验

    1.常见酸乳产品：

?    凝固型酸奶
发酵过程在包装容器中进行，从而使成品因发酵而保留了凝乳状态。
我国传统的玻璃瓶和瓷瓶装的酸奶即属于此类型。

?    搅拌型酸奶
   将发酵后的凝乳在灌装前或灌装过程中搅碎，添加或不添加果料、果酱等制成具有一定黏度的奶油样制品。

?    酸性乳饮料

?    发酵型酸乳饮料
以鲜乳或乳制品为原料经发酵，添加水和增稠剂等辅料，经加工制成的产品。其中由于杀菌方式不同，可分为活性乳酸菌饮料和非活性乳酸菌饮料。

?    调配型酸乳饮料
以鲜乳或乳制品为原料加入水、糖液、酸味剂等调制而成的制品，经过灭菌处理，保质期比乳酸菌饮料长。

2.       本实验中制作酸奶的原理：

本实验制作的酸奶为凝固型酸奶。由于市售酸奶（搅拌型酸奶）是已经发酵完成的酸奶，富含活性的乳酸菌，故可以直接取用作为发酵的菌种来源。实验中选取市售鲜牛奶作为材料，加入市售酸奶，经过一段时间的发酵即可制作出凝固型酸奶。

三、实验材料和仪器用具

（一）   啤酒发酵实验的材料用具

1.       啤酒酵母；

2.       发酵培养基：含100ml麦芽汁（8%~10%）的250ml三角瓶；

3.       灭菌后的2.5%海藻酸钠溶液5ml；

4.       1.5% CaCl₂ 50ml,灭菌；

5.       0.9% 无菌生理盐水, 50ml;

6.       无菌滴管;

7.       无菌封口膜封好的100ml三角瓶;

（二）   酸奶的制作实验的材料用具

8.       袋装三元鲜牛奶

9.       酸奶菌种：市售光明酸奶

10.   煮沸和搅拌酸奶的锅等设备

11.   一次性杯子（用于盛装酸奶）若干，和封口用的白纸

四、实验步骤

（一）   固定化酵母细胞发酵啤酒

1.       制备固定化酵母细胞凝胶：在5mL海藻酸钠溶液中,加入2ml 预热至35^oC的酵母培养液,混合均匀,以无菌滴管吸取混合液,滴管口离液面5cm以上,缓慢而稳定滴加到CaCl₂ 溶液中, 即可得到直径约3mm左右的凝胶珠;全部滴入.钙化30min;

2.       利用固定化酵母进行啤酒的发酵：（由于实验中没有提供玻璃棒，我们采取的办法是利用涂棒的另一头在酒精灯火焰下消毒后充当玻璃棒。）在“玻璃棒”的帮助下倒掉CaCl₂ 溶液,倒生理盐水于制得的固定化好的酵母细胞的瓶子中,把生理盐水分成两份，分两次洗凝胶珠（个人觉得分两次洗更干净，且已经征得助教和同组同学的同意），将100mL发酵培养基（麦芽汁）倒入制得的固定化小球的瓶子中, 25℃静止培养24小时; 4 ℃下放置于冰箱。

3.       品尝啤酒。（若发酸或其他异味，证明实验失败，请勿品尝）

（二）   酸奶的制作

1.       取足量的鲜奶，在教授和助教的安排下，分成两部分做两组实验：第一组是对鲜奶搅拌煮沸消毒，第二组只进行搅拌，并不煮沸消毒。两组都加入等量白糖搅拌溶解。然后待煮沸的鲜奶冷却后，两组实验组都加入等量的光明酸奶按5%（体积分数）的比例加入鲜牛奶中，搅拌均匀。

2.       每位同学取一个一次性杯子，按照各自喜好取用煮沸或未煮沸过的鲜牛奶一杯（当然不同组的牛奶混在一起也可以），用白纸封口。

3.       把纸杯放在42℃条件下，静置发酵培养10~12h，至变为不流动的酸奶。然后置于4℃冰箱中保存。

4.       品尝酸奶。

五、实验结果（以图片展示为主）

六、实验讨论

1.你酿制的啤酒和酸奶风味如何？

啤酒有甜味，入口有很轻微的点点涩，喝起来更像是米酒的味道

酸奶口感很好，味道和市面上出售的差不多

2.谈谈固定化细胞技术的意义？

固定化技术有以下优点：固定化细胞能重复使用;发酵后菌体与发酵液易于分离;后处理工艺简单,成本低;可连续发酵,过程自动化。固定化技术可以实现对菌体的多次利用，这样可以极大地降低生产成本。例如使用包埋法固定酵母菌，由于细胞与载体不发生反应，细胞可以处于最佳的生理状态，这样可以提高生产效率，在单位时间内生产出更多的产品，同时有载体为屏障，可以避免外界的比例浓度，提高菌种的浓度，缩短生产周期，降低生产成本，提到产品产量。该技术既不需要把酶从细胞中提取出来,又不需要加以纯化,因而酶活性损失小。有利于原料的可持续利用。研究和应用表明,固定化微生物技术有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点。固定化微生物技术可应用于环境污染治理方面的研究，如难处理的有机废水及重金属污染的废水。

3、纯种发酵和传统发酵在无菌操作方面的差别?

纯种发酵是在成分单一的发酵基质中，仅接入一种微生物，通过对该微生物的培养，得到纯度较高的单一性产物，因此对无菌要求比较高，对发酵设备和环境要求较高，要有严格的灭菌措施和空气净化系统。而传统发酵是以成分复杂的谷物为原料，有多种微生物分泌的酶系参与，水解与发酵混合进行，将原料成分转化成多种风味和营养物质的过程，多采用开放式，对无菌操作的要求比较低，因为在操作过程中必然会有杂菌混入。

4、为何有的同学无法制得凝胶珠而得到无规则的固体？

           从我们这组操作中出现的情况来看，如果滴海藻酸钠溶液太快的话会导致凝固不完全，好几滴凝聚在一起，就会得到无规则的固体。其他原因不清楚。

5、在制作酸奶时，为什么要求使用“无抗奶”作为原料？

因为无抗奶中不含抗菌素，对原味酸牛奶中的乳酸菌不会起到抑制杀灭作用，否则原味酸牛奶中的乳酸菌便不能繁殖进行发酵，酸奶的制作便会失败。

6、  谈谈你对微生物学实验的理解和感想.

微生物实验以微生物为研究主体，作为微观世界的重要研究手段，它为人类揭示了一个与宏观世界同样精彩的领域，电镜下各种菌类丰富多彩的形态、肉眼不可见区域下蕴藏的多彩世界等等无不吸引着人类对于微生物的兴趣。通过微生物实验，我了解到身边微生物无处不在，有好的有坏的，检测周边环境中的微生物实验提高了我的卫生意识，要勤做清洁工作，而固体化酵母细胞发酵啤酒与酸奶制作则展现了微生物奇妙的作用，看到了它们给我们生活带来便利的一面。