实验报告：

淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌

（amp+）中的表达

学生：***

学号：***

班级：生物技术***

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目录：

? 相关背景

? 目前研究情况

? 简略研究步骤

? 相关实验详细介绍? 实验结果与讨论 ? 参考文献

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1、相关背景

1、1淀粉酶

1、1、1 淀粉酶的发现和分类

淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。19xx年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。

淀粉酶(amylase，AMY,AMS)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α－1，4-葡聚糖，水解α－1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类。

第一类α-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以钙离子为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α－1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。

按照使用条件α-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。

第二类β-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个 - 3 -

α-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α－1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

第三类葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解α-1，4糖苷键和分支的α-1,6键生成葡萄糖。

第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉α-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。

1、1、2 淀粉酶的工业应用

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

除此之外，不同性质的α-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性α-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，自19xx年问世以来，使双酶糖化发生产葡萄糖真正在工业上得到应用。耐热性α-淀粉酶也适用于棉布退浆及石油压裂液处理等。米曲霉α-淀粉酶耐热性差， - 4 -

应用面包工业，可避免应用高温α-淀粉酶而使面包过度液化，口感变差的现象，黑曲霉酸性α-粉酶适用于消化药物制造，糖化性细菌淀粉酶具有较多的麦芽糖，可以制造糖浆，α-淀粉酶在工农业生产中有许多用途，祥见表一中。

β-淀粉酶也是一种应用广泛的淀粉酶。作为一种糖化剂，β-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中，常用β-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上，β-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和α-淀粉酶一道作为消化剂使用。

1、1、3 淀粉酶的临床意义

增高：见于胰腺肿瘤引起的胰腺导管阻塞、胰腺脓肿、胰腺损伤、肠梗阻、胃溃疡穿孔、流行性腮腺炎、腹膜炎、胆道疾病、急性阑尾炎、胆囊 - 5 -

炎、消化性溃疡穿孔、肾功能衰竭或肾功能不全、输卵管炎、创伤性休克、大手术后、肺炎、肺癌、急性酒精中毒、吗啡注射后，以及口服避孕药、磺胺、噻嗪类利尿剂、鸦片类药物（可待因、吗啡）。麻醉止痛剂等。 减低：见于肝硬化、肝炎、肝癌、急性或慢性胆囊炎等。

胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道，是最重要的水解碳水化合物的酶，和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于α-淀粉酶，作用于α-1，4糖苷键，对分支上的α-1，6糖苷键无作用，故又称淀粉内切酶，其作用的最适pH为6.9，可通过肾小球滤过，是唯一能在正常时于尿中出现的血浆酶。

人体的其他组织如卵巢、输卵管、肺、睾丸、精液、乳腺等的提取物中都发现有淀粉酶活性;血液、尿液、乳液中也含淀粉酶。血液淀粉酶中主要来自胰腺、唾液腺，尿液中淀粉酶则来自于血液。

测定血清淀粉酶同工酶时，发现有两个主要的同工酶区带及数个次要区带。两个主要区带中的一个和胰腺的提纯物或分泌物电泳的位置相同，因此命名为P-同工酶;另一个和唾液腺提纯物或唾液电泳在同一位置，因此命名为S-同工酶。测定淀粉酶同工酶有助于对胰腺疾病的鉴别诊断。

参考值：限定性底物法：

血清淀粉酶 220U/L(37℃)

尿淀粉酶 1200U/L(37℃)

P同工酶 血清115U/L

尿800U/L

新生儿血清淀粉酶约为成年人的18%，主要为S-型，到5岁时达成人水平;在一岁内测不出血清P-型淀粉酶，以后缓慢上升，在10～15岁时达 - 6 -

成人水平。

血清淀粉酶和尿淀粉酶测定是胰腺疾病最常用的实验室诊断方法，当罹患胰腺疾病，或有胰腺外分泌功能障碍时都可引起其活性升高或降低，有助于胰腺疾病的诊断。尿淀粉酶水平波动较大，所以用血清淀粉酶检测为好，或两者同时测定。淀粉酶活性变化亦可见于某些非胰腺疾患，因此在必要时测定淀粉酶同工酶具有其鉴别诊断意义。

1.血清淀粉酶升高：最多见于急性胰腺炎，是急性胰腺炎的重要诊断指标之一，在发病后2～12h活性开始升高，12～72h达峰值，3～4天后恢复正常。淀粉酶活性升高的程度虽然并不一定和胰腺损伤程度相关，但其升高的程度越大，患急性胰腺炎的可能性也越大，因此虽然目前还都用淀粉酶作为急性胰腺炎诊断的首选指标，但其特异性和灵敏度都还不够高。当怀疑急性胰腺炎时，应对患者血清和尿淀粉酶活性连续作动态观察，还可结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定共同分析，作出诊断。

淀粉酶测定对监测急性胰腺炎的并发症如胰腺假性囊肿，胰腺脓肿亦有价值，此种时候血淀粉酶活性多持续升高。重症急性胰腺炎时可以引起胸腔积液或/和腹腔积液，积液中的淀粉酶活性甚至可高于血清淀粉酶活性100倍以上。

急性胰腺炎的诊断有一定的困难，因为其他急腹症也可以引起淀粉酶活性升高。所以当怀疑急胰腺炎时，除应连续监测淀粉酶外，还应结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定结果共同分析，作出诊断。

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慢性胰腺炎淀粉酶活性可轻度升高或降低，但没有很大的诊断意义。胰腺癌早期淀粉酶活性可见升高。

淀粉酶活性中度或轻度升高还可见于一些非胰腺疾病，如腮腺炎、急性腹部疾病(消化性溃疡穿孔、上腹部手术后、机械性肠梗阻、肠系膜血管病变、胆道梗阻及急性胆囊炎等)、服用镇痛剂、酒精中毒、肾功能不良及巨淀粉酶血症等情况，应加以注意。

血液中淀粉酶能被肾小球滤过，所以任何原因引起的血清淀粉酶升高时，都会使尿中淀粉酶排出量增加，尤以急性胰腺炎时为多见，急性胰腺炎时肾清除淀粉酶的能力加强，其升高可早于血淀粉酶，而下降晚于血淀粉酶。

2.淀粉酶同工酶：血清淀粉酶除来源于胰腺外，还来源于唾液腺及许多其他组织，所以在淀粉酶活性升高时，同工酶的测定有助于疾病的鉴别诊断。P-同工酶升高或降低时，说明可能有胰腺疾患;S-同工酶的变化可能是源于唾液腺或其他组织。当血清淀粉酶活性升高而又诊断不清时，应进一步测定同工酶以助鉴别诊断。有许多方法可以测定同工酶，琼酯糖和醋纤膜电泳法都是比较常用的方法。

淀粉酶的测定结果受方法的影响较大，不同方法参考值亦有所不同，临床所用方法也较多，因此必须了解所用测定方法和其参考值，才能作出正确的诊断。

1.2 基因克隆

1.2.1 PCR 技术

PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 - 8 -

端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。

PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物

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片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

1.2.2 基因克隆方法

1.2..2.1 据已知序列克隆基因

这是基因克隆方法中最简便的一种，即从文献中查取别人报道过的基因序列，并将它直接作为自己克隆的依据。首先根据整个基因序列设计特异的引物，通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。

根据蛋白质的氨基酸序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如果蛋白质序列是自己测定的，那么需要设计至少1对简并引物，从DNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。此外，还可以序列己知的探针来克隆基因，这也是一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交，最后将所识别的片段从胶中切下来，回收克隆到特 - 10 -

定的载体（质粒、噬菌体或病毒）中做序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出

来，还能同时大体获知该基因在基因组中的拷贝数。

1.2.2.2未知序列的基因克隆

根据己知序列进行基因克隆，基本上是重复别人的工作，因而不存在新基因的克隆过程，对于未知序列的基因克隆才是真正的创造性研究。主要有以下方法：

（1）鸟枪法（shotgun）构建基因组文库

就是将某一物种的基因组进行酶切或者机械剪切至合适的大小，然后与载体相连建立基因组文库，在进行一系列筛选，最终筛选到自己感兴趣的克隆，对其中的外源DNA片段进行序列测定分析。

（2）随机引物PCR（arbitrarily primed PCR，AP-PCR）克隆未知序列基因

该方法的理论依据是：表型受基因支配，在一个生物体发生了表型变化后，其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关闭等；另一方面不同发育阶段生物所表达的基因不尽相同，可将不同发育阶段的mRNA提取出来，用单一引物（随机引物，长度不超过16nt）对其进行扩增比较。AP-PCR扩增后的产物必须99％是一致的，只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。

（3）Differential Display PCR（DD－PCR）

这是在AP-PCR的基础上发明的一种RT-PCR方法，主要用于2种或多种类似生物个体在基因表达上的差异分析。基本原理是：所有真核生物 - 11 -

的成熟mRNA都含有不同长度的poly（A）尾部序列，根据poly（A）内部的2个核苷酸排列的不同，将所有mRNA分为12类，据次设计合成12种相应的反转录引物，进行反转录后再用随机引物进行PCR扩增，那么与表型相关的的mRNA就很容易被发现并克隆出来。

（4）Representative difference analysis PCR（RDA－PCR）

这是一种差减杂交与PCR相结合的技术。基本原理是：用一个在种源上相近的基因组将靶基因组中所有共同的基因掩盖起来，而只暴露出特异的基因，在整个反应中只要特异基因能被扩增。

（5）特异抗体克隆基因

用抗体克隆基因的关键是抗体的特异性，一般以单克隆抗体最为理想。获取特异抗体的方法主要有：制备识别功能抗原的单克隆抗体；将

SDS-PAGE分离的蛋白质特异带切下分离纯化后免疫动物，其抗体只识别特异蛋白质；用Western-blot法将识别某一蛋白质带的抗体从膜上洗脱下来。在获取理想的抗体后，便可以用这些抗体筛选表达型基因组文库或cDNA文库，从文库中将编码某一特异蛋白质的基因克隆出来。

1.2.2.3特异基因的功能克隆方法

它是借助于基因产物即基因所编码的蛋白质的功能将该基因克隆出来的一种方法。具体有两种方法，一种是噬菌体展示，另一个是肽展示法。两者原理基本相同，目前噬菌体展示方法应用的最为广泛。任何一种病原体，包括细菌、病毒和寄生虫，在其对宿主侵入或致病过程中，病原体本身的蛋白质成分需要首先与宿主细胞上的受体相互识别连接。噬菌体展示的基本操作过程为：提取某一病原体基因组DNA，用超声波将DNA切割 - 12 -

成500-l500bp的片段；将片段末端用T4DNA聚合酶处理后与载体DNA连接形成噬菌体质粒，用这些质粒与辅助噬菌体同时转染大肠杆菌，外源基因片段的表达产物主要集中在噬菌体颗粒的表面；将特定的受体固定于载体上（多为ELISA板），把噬菌体悬液作适当稀释后，加入平板孔内，感作一段时间，然后漂洗，只有表达特异功能蛋白的噬菌体才能与包被在平板上的受体相互结合；用高强度NaCL溶液将结合在受体上的噬菌体分离下来，再感染大肠杆菌，便可将编码特异功能蛋白质的基因克隆出来。

1.2.3 重组体的筛选

无论利用上述何种方法,我们得到了许多重组子,但哪一个或几个重组子含有我们所需要的目的基因,还是未知,需要通过筛选来确定。常用的筛选方法如下：

1.2.3.1 遗传检测法

遗传检测法可以从两方面选择：根据载体表型特征选择重组体分子，如pBR322的tet抗性基因插入失活及pUC18质粒的蓝-白斑筛选。另一个根据插入序列的表型特征选择重组分子，如α–淀粉酶基因在DH5α的克隆:α–淀粉酶基因在DH5α中表达，可以用I2–KI检测水解圈，或用锥虫蓝显色平板检测。

其中pUC18质粒的蓝-白斑筛选的原理如下：

E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代 - 13 -

谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

X–Gal也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。分子式为C14分子式为H15BrClNO6，分子量为408.63，CAS Number 7240-90-6。X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。

1.2.3.2菌落或噬菌斑杂交筛选

从基因文库中筛选带有目的基因插入序列的克隆，最广泛使用的一种方法是应用放射性标记的特定的DNA或RNA作探针，进行DNA/DNA或 - 14 -

DNA/RNA杂交的核酸杂交检测法。

1.2.3.3免疫化学检测法

直接的免疫化学检测法，同菌落杂交技术在程序上是十分类似的，但它不是使用放射性标记的核酸作探针，而是用抗体鉴定那些产生外源DNA编码的抗原的菌落或噬菌斑。只要有一个克隆的目的基因能在E.coli寄主细胞中表达，合成外源的蛋白质，就可以采用免疫化学法检测重组体克隆。

1.2.3.4 用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆

2、目前研究情况

2.1 国内外研究机构

由于 α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶，国内外很多课题组对它进行了研究。国内有代表性的研究单位有：四川大学，主要研究 α-淀粉酶的生产菌株及其培养条件；江南大学，主要研究 α-淀粉酶的结构以及应用性能，如耐热性、耐酸性；西北大学，主要研究一淀粉酶的变性机理以及环境对 α-淀粉酶的影响；华南理工大学，主要研究一淀粉酶的固定化和动力性质；还有华中农业大学，中国科学院沈阳应用生态研究所，天津科技大学，南开大学生命科学学院，中国农业科学院，中国科学院微生物研究所等多家研究机构对多种 α-淀粉酶生产菌的一淀粉酶基因进行了克隆以及表达研究。

国外有代表性的研究单位有：加拿大的University of British Columbia，他们对人胰腺的 α-淀粉酶结构和作用机理进行了深入的研究；丹麦的Carlsberg实验室主要研究大麦 α-淀粉酶结构域与结合位点；美国的Westenr Regional Research Center主要研究大麦的 α-淀粉酶与抗菌 - 15 -

素的作用以及大麦一淀粉酶的活性位点。

2.2国内外α-淀粉酶研究方向

2.2.1 利用传统育种技术对生产菌进行改良

国内外许多研究者通过筛选和育种工作，改变菌种特性，提高a一淀粉酶活力．利用传统诱变方法如热处理，x-射线、γ-射线、111，以及NTG等物理和化学诱变剂反复和复合诱交，或是原生质体融合筛选新的耐酸、耐碱、耐高温酶生产菌，对生产工艺进行优化或对酶进行固定化等。Outtrupt等以ATCC9789为出发菌株，经γ-射线，NTG以及UV反复7次诱变，结果得到了α-淀粉酶产量为原菌株25倍的突变株。Kazumasa在用NTG处理最B.subtilis 6160时得到抗环丝氨酸突变株c108和抗氨卞青霉素突变株A2，α-淀粉酶产量分别是原685297菌株的5倍和6倍。

2.2.2对不同来源的α-淀粉酶的基因进行克隆．表达及酶学性质研究

随着基因重组技术的发展，国内外学者先后对多种不同来源的α-淀粉酶的基因进行了克隆、表达、酶学性质研究等，以加深对α-淀粉酶的认识，拓宽α-淀粉酶的资源库，并为可能的应用打下基础。台湾Hung kuang研究院对嗜热芽孢杆菌α-淀粉酶进行了克隆并对其酶学特性进行了研究，分析表明与芽孢杆菌属、大肠杆菌的α-淀粉酶基因有一定的同源性．日本的Kohji0hdan和Takashi Kuriki对枯草芽孢杆菌的两种α-淀粉酶形式(即完整的α-淀粉酶基因和C末端截短了186个氨基酸的α-淀粉酶基因)进行了研究，结果表明C末端缺失186个氨基酸的α-淀粉酶基因，比完整的α-淀粉酶基因短了28％，除了酶的热稳定性比完整的α-淀粉酶基因高之外，其α-淀粉酶学特性包括催化活性、分解淀粉的模式、转糖基能力、特定pH下的 - 16 -

酶的活性及其稳定性、酶的最适温度、结合淀粉的能力和其空问结构与完整的α-淀粉酶基因没有变化，其三级结构预测表明截短的α-淀粉酶基因可能包括α-淀粉酶基因的全部功能区域。波兰Gdansk大学在大肠杆菌中克隆了Pyrococcus woesei的热稳定性α-淀粉酶基因。南非的一家葡萄酒生物技术研究所从Lipommyces kononenkoae中克隆了高效α-淀粉酶基因LKA2，并在啤酒酵母中作了表达，我国学者牛丹丹对地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因进行了克隆并对其启动子功能进行了鉴定。廖昱泓对西方许旺酵母α-淀粉酶基因进行了克隆并对其在大肠杆菌中的分泌表达进行了研究，实验证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外。并且表现出明显酶活性．涂向东对人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达进行了初步研究。

这些高效淀粉酶基因的克隆、特性优化及表达是有效的把淀粉生物转化为商业上重要商品的一种深入研究。

2.2.3 α-淀粉酶结构与功能关系的研究

八十年代以来伴随着α-淀粉酶三维结构的逐步解析，近年来随着体外进化技术的发展，α-淀粉酶再一次成为研究的热点。蛋白质工程的合理设计一定点突变技术被越来越多地应用于α-淀粉酶。通过大量的以结构为基础的定点突变，许多α-淀粉酶的催化机制、底物特异

性，功能氨基酸(如催化氨基酸、热稳定性氨基酸、决定pH活性范围的氨基酸、金属离子结合位点氨基酸)相继被阐明，促使α-淀粉酶结构与功能关系的研究更加深入，同时利用定点突变合理的改造α-淀粉酶，也得到一些性质改良的具有工业应用价值的酶，如热稳定性提高

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的酶，碱性条件活性提高的酶等。

Verlmert等对地衣芽胞杆菌α-淀粉酶的第四个β折叠的7个氨基酸进行饱和性随机诱变，将突变基因重组到噬菌体载体，进行α-淀粉酶基因的噬菌体表面展示，筛选到6个在低pH值下与淀粉结合力强的突变体。Bessler等在体外用DNA shuffling技术分别得到了耐酸、

耐碱和α-淀粉酶活性提高40倍的三株菌体。

有关α-淀粉酶结构与功能关系的研究，国内的工作还比较少．仅有α-淀粉酶家族中的麦芽四糖(形成)淀粉酶的晶体结构被阐明。另外，赵荧等采用荧光光谱和圆二色谱法，在二级结构水平上研究了地农芽胞杆菌耐高温α-淀粉酶结合钙离子前后的构象变化以及酶热稳定性与构象的关系。柯涛采用5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BdU)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，在PCR的过程中对克隆的野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变，得到了酶活性提高40倍的突变基因。周向军利用定向进化技术对α-淀粉酶基因进行了分子改性，成功地获得了较高活性的α-淀粉酶菌株。试验采用基因体外定向进化策略中PcR基因诱变技术，使用碱基类似物5一溴脱氧尿苷三磷酸为诱变剂，利用热稳定性的Taq聚合酶不具备校对功能的特点而引入突变，突变库的筛选用锥虫蓝淀粉(LBSP)鉴别培养基。经过多轮诱变，得到五个具有高酶活性的诱变基因。

突变α-淀粉酶这些性质提高了α-淀粉酶在饲料中应用的有效性，为饲料用淀粉酶的基因工程改良提供了新的思路。

3、简略研究步骤

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DNA提取——>（电泳鉴定）——> PCR扩增（引物设计） ——>（电泳鉴定）——>电泳 ——>目标带回收——>（电泳鉴定）——>连接载体（质粒）——>转化大肠杆菌——>菌体PCR检测

4、相关实验详细介绍

4.1 DNA提取

4.1.1 SDS法提取DNA

（一）试剂及器材：

1．母液：

（1）1M Tris-HCl：称Tris-Base 12.1g，双蒸水溶解，定容至100ml，用浓HCl调pH8.0(pH8.0)。

（2）0.25M EDTA：称Na2EDTA·2H2O9.3g，双蒸水溶解，定容至100ml，用NaOH调pH8.0（pH8.0）。

（3）2M NaCl：称NaCl 11.6g，双蒸水溶解，定容至100ml。

2．SDS bulfer：

取母液中1M Tris-HCl 10ml，0.25M EDTA 20ml，2M NaCl 25ml，定容至100ml，加SDS2g混合。

3．5M醋酸钾：称醋酸钾49g，双蒸水溶解，定容至100ml，乙酸调pH4.8。

4．TE：(10m M Tris-HCl，0.1m MEDTA)1M Tris-HCl 1ml，40μlEDTA 99ml双蒸水。

5．3M 醋酸钠（pH5.2）：称醋酸钠3H2O 40.8g双蒸水溶解定容，固体NaOH调pH至5.2。

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6．Tris-饱和酚（购买）。

7．其它：离心机、研钵，7ml离心管，1.5ml离心管，大小枪头，异丙醇，75%乙醇等。

（二）步骤：

1．取湿菌体约400mg（5ml发醇液），8000rpm，离心5min，弃上清将湿菌体放入研钵中，加液N2(-180℃) 约20ml研磨3~5次，2管1.5ml离心管取粉末约0.5ml，各加700μl预热的SDSbuffer，65℃保温1h，7000rpm 离心6min取上清。

2．加上清2/3体积（约500μl）的5M KAC溶液，4℃，放置30min，12000rpm，离心10min，取上清

3．加入等体积的异丙醇，-20℃，2小时以上，或过夜，4℃，8000rpm，离心5min，收集DNA沉淀，75%乙醇洗涤2次，离心管口向下晾干，50μl双蒸水（即ddH2O）溶解。

4．Tris-饱和酚，抽提3次。

5．加1/10体积的3M NaAc (pH5.2) ,4℃，放置10min，10000rpm，离心10min，取上清。

6．2倍酒精沉淀。

7．75%酒精洗2次，凉干，50μl双蒸水溶解。

一般情况下，做前3步即可。

4.2电泳

（一）试剂及器材：

1．50×TAE Buffer pH8.5 1L(2M Tris-醋酸，100m MEDTA)

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称Tris-Base 242g，Na2 EDTA·2H2O 37.2g加800ml双蒸水，充分混匀搅拌，加57.1ml醋酸，加双蒸水定容到1L，室温保存。

2．1×TAE（取20ml 50×TAE+双蒸水定容至1L）

3．电泳仪、大小枪头、离心管，溴化乙淀，mark（d2000）等。

（二）步骤：

1．取20ml（1×TAE）液体，称0.20g琼脂糖，混合，加热溶化，，倒入插有梳子的电泳槽中，冷却、凝固，

2．取出梳子，向槽中倒入TAE溶液至淹没胶块，样品5μl与1μl溴汾兰在塑料皮上混匀后点样入胶孔内（注意不能有泡），加盖，通电，电压100V，电流45mA，40min后，关闭电源。

3．打开盖子，倒去TAE，取出胶块，在EB中染色5min，后用蒸馏水漂洗干净，紫外分析仪中（260nm），观察电泳条带。

4.3 PCR扩增

（一）试剂及器材：

DNA提取物，Taq酶，Buffer，（天根公司），双蒸无菌水（灭菌过滤），PCR仪，电泳仪，离心机等。

（二）步骤：

1．PCR扩增，先设定程序，94℃，3min。（94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min）×30。72℃，5min。及94℃，5min。（93℃，50s；46℃，30s；68℃，

1.2min）×35。68℃，7min。

2．将双蒸无菌水20μl，Buffer 3μl，引物NS1 1μl，引物NS2 1μl，dNTP 1μl，DNA（模板）3μl及Taq酶1μl依次加入，（Taq酶在冰 - 21 -

上加入），总反应时间约2.5小时，反应结束后4℃，冰箱保存。（注意：加引物，dNTP及模板时需换枪头）。

3．1%琼脂糖胶电泳作鉴定。

剩余的再作电泳（结果如图5.1-1所示）用于回收扩增产物即目标DNA（1%胶更好，大孔梳子）。

4.4 目标带回收

（一）试剂及器材：

回收试剂盒，1×TAE Buffer（pH8.5），电泳仪、大小枪头、离心管，溴化乙淀，mark（d2000）等。

（二）步骤：

1．PCR扩增产物，用大孔梳子胶做电泳，将目标带用刀片切下估称重量（先称小离心管重量，再称放有胶带的重量，两次相差，即为胶的重量），胶约0.1g加300μl S1溶液，65℃，保温10 min，融化完全。

2．将300μl的DNA琼脂糖溶液加到一个回收纯化柱上，并把柱子装在一干净的2ml收集试管内，室温下12000rpm离心1.5min。

3.加500μl W1洗涤缓冲液，洗涤柱子，静置2min，室温12000rpm离心1.5分钟。

4.加500μl W1洗涤缓冲液，洗涤柱子，室温12000rpm离心1.5分钟。

5.将空柱室温12000 rpm 离心1.5分钟，甩干残余液体。

6．将柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上，加20-30μl T1洗脱液在柱子中心，12000rpm，离心1.5分钟，洗脱DNA。

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7．取3μl收集的DNA做电泳鉴定，检测是否回收到。

4.5 目的基因连接载体

（一）试剂及器材：

solution[2×buffer，T4DNA连接酶]，载体pMD18-T质粒，纯DNA目标基因片段等。

（二）步骤：

取纯化的DNA片段13μL（总量约30μL）加质粒载体pMD18-T 1.0μL（即25ng）， solution 6μL(T4DNA连接酶及buffer)，22℃过夜（连接）

4.6 转化大肠杆菌

? 感受态细胞的制备步骤：

1.将大肠杆菌接入100ml LB液体培养基中37℃培养3小时，OD600=0.4～0.6（109个/ml）。

2.将菌液转到50 ml预冷管中，冰浴10分钟。

3.4℃4000rpm离心10分钟，收集菌体。

4.管倒置1分钟使微量培养基流尽。

5.每50 ml 用30 ml 预冷的0.1M(pH7.2) CaCl2—MgCl2缓冲液（80mM MgCl2,20mM CaCl2）悬浮菌体.

6.4℃4000rpm离心10分钟，收集菌体，管倒置1分钟使微量培养基流尽。

7.每50 ml初始培养物用2 ml冰预冷的0.1M CaCl2（pH7.2）重悬菌体。

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8.加入终浓度15-20%甘油分装于小离心管中（每管100-150μl），-80℃贮存备用。

?感受态细胞的转化

? 试剂及器材：

IPTG 200mg/mL, X-gal 20mg/mL, Amp 50mg/mL

? 步骤：

感受态细胞-80℃取出1管（约 150μL），冰上液化，目标基因质粒全部加入感受态细胞，轻弹，插入冰上，冰浴30分钟，42℃热激90s，冷却3-5分钟，加LB（胰蛋白胨10g/L酵母粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0）培养其800μL，混匀，37℃培养1小时（转化），取300μL涂平板，37℃，过夜。

4.7 重组子的筛选

挑单斑，加入amp终浓度为100μg/ml的液体培养基中16h。菌体PCR检测。

5、实验结果与讨论

5.1实验结果

1、PCR的电泳检测结果

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2~6号泳道为PCR产物。

目标带大小约1.8kb，应该在1.5kb和2.0kb之间。由上图可以看出，PCR电泳结果与预期相符合，即提取的DNA是正确的，且PCR所使用的材料和方法能正确地扩增目标DNA分子。为目标DNA分子的分离奠定了基础。

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2、胶回收的电泳检测结果

5.1-2 其中第4泳道为maker，

5~9号泳道为胶回收物。

目标带大小约1.8kb，应该在1.5kb和2.0kb之间。由上图可以看出，PCR电泳结果与预期相符合，即胶回收的DNA是正确的，得到了较纯的目标DNA片段。可以进行酶切酶连了。

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3、菌体PCR检测

这一步检测的结果非常令人失望，没有看到预期的电泳条带！！

5.2 结果分析

由5.1中的三次检测结果可知：DNA的提取，目标基因的PCR，目标基因的胶回收都完成得很好，方法的应用和技术操作都是没有错误的。只是到了最后转化的步骤出了问题。简要分析可能有以下原因：

1）酶切酶连出了错误。回收的DNA中含有较多的杂质，使DNA连接酶的活性受到抑制甚至失活。例如，如果胶回收最后一布中的乙醇没有处理干尽，会大大影响酶切酶连的效率。这应该是这次试验失败的主要原因。

2）感受态细胞的有问题。由于此次试验，感受态细胞是一组制备，多组公用的，可能制备本身出了问题，也有可能是在使用过程中对感受态细胞造成了较为严重的损伤。

3）转化、挑单菌落和细胞培养也可能是问题所在，不过这些技术我们都掌握的很好，自信这些过程导致实验失败的可能性很小。

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