实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法

目的要求

学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。 实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5?L/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100?g蛋白质，微量测定法测定范围是1－10?g蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

试剂与器材

一、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。

二、标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。

2．未知蛋白质溶液。

三、器材

试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计。

操作方法

一、标准法制定标准曲线

取14支试管，分两组按下表a平行操作。

绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、微量法制定标准曲线

取12支试管，分两组按下表b平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

表b

三、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色

注意事项

（1） （1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。

（2） （2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

思考题：

根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度：

（1） （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） （2） 要求在半天内测定60个样品。 （3） （3） 要求很迅速地测定一系列试管（30支）中溶液的蛋白质浓度。

 

第二篇：考马斯亮蓝法测蛋白

考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量

一、目的

蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

二、原理

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法是19xx年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、仪器、试剂和材料

1．仪器

（1）分析天平

（2）具塞刻度试管 10ml× 8

（3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I

（4）研钵

（5）漏斗

（6）离心管 10ml

（7）容量瓶 10ml

（8）离心机

（9）721型分光光度计

2．试剂

（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。

（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。

3．材料

绿豆芽

四、操作步骤

1

盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

2．样品中蛋白质含量的测定

（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。

（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理

根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：

样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml））

六、注意事项

1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。

2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

参考文献

鲁子贤。蛋白质化学。北京：科学出版社，1981

文树基。基础生物化学实验指导。西安：陕西科学技术出版社，1994

张龙翔．生物化学实验技术。北京：人民教育出版社，1981