一、目的基因的定义：把需要研究的基因称为目的基因。（一般把需要分析的基因

称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。）

二、目的基因的制备： （一）从细胞核中直接分离 简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。 直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。 （二）染色体DNA的限制性内切酶酶解 II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入的DNA片段用同一

种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。

（三）人工体外合成 简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构

氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。 （四）用逆转录酶制备cDNA 大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA（反转录DNA）得到。从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12－18个dT的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条 图10-39 目的 （五）从基因文库中获取 依据：基因的

核苷酸序列，功能，在染色体中的位置，转录产物mRNA，翻译产物蛋白质性质。

（六）PCR技术扩增 基因的制备 cDNA链。用碱或RNA酶水解除去mRNA，再用DNA聚合酶，最好是Klenow片段合成第二条DNA链。双链合成后，用S1核酸酶切去发夹结构，即可获得双链cDNA。cDNA用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料，反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。