佛 山 科 学 技 术 学 院

《食品微生物学》课程实习报告

1、每位学生需要交一份手写《食品微生物学》报告（不收打印稿，检验程序图、结果可手写或者打印粘贴）。

2、注意水电安全。不允许单人进入实验室操作实验。未经允许，不可使用高压容器。

4、每位学生以本人学号（不需密码）根据自己实验的实际进度登陆学校设备处““实验室综合管理系统”http://shebei./lms，登记可预约实验项目：1、酒曲中酵母菌的分离；2、GB4789.2-2010微生物学检验菌落总数测定；3、GB 4789.3-2010大肠菌群的检测方法。成绩评定时根据登记预约开放实验次数与总量分5档评分，从高至低每档递减1分。

3、希望同学读懂、理解与创新完成食品微生物学课程实习内容！通过本课程实习后，如果每一位同学能亲自分离出来酵母菌、如果每一位同学都学会食品微生物学检验国标法、如果每一位同学都都有成就感，则本课程才算成功！

希望各组至少开展一项或者多项实验设计，通过实验设计锻炼自己的初步科研设计、组织与实施能力，同时进一步锻炼自己的动手与实践能力、培养自己的创新精神和创新能力，使本人的综合素质得到进一步的提高。

《食品微生物学》课程实习与实验八、九同步进行。

课程实习每班分6组，每2人1小组。

《食品微生物学》课程实习评分细则：

1、出勤20分，成绩评定根据登记预约开放实验次数与总量分5档评分，从高至低每档递减2分。（由网络自动统计）

2、第五部分结果分析和第六部分课程实习评价与建议，每雷同或者照抄一处扣2分。

2、实习报告：50分（实习报告无创新者、不得高分）

Edit：Prof Wu Guoming

TEL：139xxxxxxxx QQ：916664536

电子邮件：fswuguoming@

个人主页：http://202.192.168.54/caiwsw/spwswzdkc/zdkc/content/grjs/grjs.htm

课程主页：http://202.192.168.54/caiwsw/

编写：伍国明 生命科学学院 食品系

20xx年12月7日

专 业 食品科学与工程 姓 名 成 绩_______

班 级 2009食品科学与工程（n）班 学 号 日 期_______

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佛山科学技术学院《食品微生物学》课程实习 报告

一、目的

《食品微生物学》课程实习是食品科学与工程专业的一门实践性极强、与生产联系非常紧密的重要的专业课程，其内容包括食品发酵原理、发酵与酿造工程学基础以及发酵生产工艺的实践，对培养学生的食品发酵与酿造的科学原理、操作技能、科学研究能力起重要作用。

系统与完整学习微生物学分离、接种与培养技术和食品卫生的检验技术，培养独立操作和动手能力，提高分析问题和解决问题的能力。

1、了解微生物分离、接种与培养（酒曲中酵母菌的分离）

2、掌握食品微生物学检验——菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法（GB 4789.2-2010）

3、熟练掌握食品微生物学检验——大肠菌群的检测方法（GB 4789.3-2010第一法：大肠菌群MPN 计数法）。

4、在微生物分离、接种与培养和食品卫生的微生物检测的不同环节中开展一项或多项既有探索性、又有以培养学生的综合分析能力的实验设计。

二、原理与方案

1、酒曲中酵母菌的分离原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。

2、食品微生物学检验——菌落总数检测原理（稀释平板活菌测数）

PCA平板分离法基本原理：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母膏粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。培养条件：恒温36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h（水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h），可有效分离与进行菌落总数计数。该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。

3、食品微生物学检验——大肠菌群的检测方法（GB 4789.3-2010第一法——大肠菌群MPN 计数法） 检测原理

大肠菌群系一群以大肠埃希氏(Escherichiacoli)为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃生长时，能于48小时内发酵乳糖并产酸产气。主要包括埃希氏菌属(Escherichia)、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）、克雷伯氏菌属(klebsiella)等。

3.1 初发酵实验

选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管杜汉氏发酵管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h。若24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

3.2 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。杜汉氏发酵管产气者，计为大肠菌群阳性管。

三、步骤

3.1、酒曲中酵母菌的分离（划线分离法和稀释涂布平板法）

3.1.1 倒平板

右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入PDA培养基约10 ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2

3.1.2 稀释酒曲

分别称取酒曲1g，放入盛49ml无菌水，考虑成本，本实验采用定性方法，在实际检测中应以5g，放入盛45ml无菌水）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使酒曲与水充分混合，将细胞分散。用一支1 ml无菌吸管从中吸取1ml酒曲悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 ml(无菌操作)加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的酒曲溶液(注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管)。

3.1.2.1涂布

将上述每种培养基的3个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-63种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管酒曲稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。用无菌玻璃涂棒（或者棉签）平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～10min，使菌液浸入培养基。

3.1.2.1平板划线分离法

将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。

3.1.3 培养

将培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5 d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d。

3.1.4挑取菌落

将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到PDA培养基斜面上，分别置于28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

3.2食品微生物学检验——菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法（GB 4789.2-2010)

（检验程序图可打印粘贴）

样品：水、调味品、酱卤肉、蛋制品、饮料、糕点、面包、糖果、乳制品、水产食品、冷食菜、豆制品、罐头食品、酒、果蔬、粮谷制品、干果、膨化食品、保健食品、食用螺旋藻粉、婴幼儿食品等）（材料不限于此，报告中需要写明具体的检测样品）

3

3.3食品微生物学检验——大肠菌群的检测方法（GB 4789.3-2010第一法：大肠菌群MPN 计数法） （检验程序图可手绘或打印粘贴）

四、数据记录与处理

4.1 酒曲中酵母菌分离结果

4

4.2 食品微生物学检验——菌落总数检测结果

4.3 食品微生物学检验——大肠菌群检测结果

五、结果分析

1、简述你本课程实习中酒曲中酵母菌分离的结果，划线分离法和稀释涂布平板法有什么区别？

采用稀释涂布平板法和划线分离法分离酒曲中酵母菌的结果分别是：??

稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以形成标准菌落。

划线分离法是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

2、简述你本课程实习中菌落总数检测项目的结果，菌落总数的意义是什么？ 菌落总数检测结果是：??

菌落总数的意义：菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。同时，可以预测食品存用的

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期限长短以及了解细菌在食品中的繁殖动态。

3、简述你本课程实习中大肠菌群检测项目的结果，大肠菌群检测有何卫生学意义？

菌落总数检测结果是：??

大肠菌群是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌。正常栖居条件下不致病，但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。……

4、为什么本试验要以选择培养基来检测大肠杆菌群？

本试验所用的培养基系选择培养基，许多细菌都不能利用培养基中的乳糖来发酵产气产酸，而大肠菌群细菌及少数其它种类的细菌可发酵乳糖产气产酸。培养基中的月桂基硫酸钠是表面活性剂，它不会抑制大肠菌群细菌的生长，但能抑制其它革兰氏阳性细菌，如芽孢形成菌的生长。

煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤，其中煌绿，又名亮绿，金黄色闪光结晶，可溶水和乙醇，为三苯甲烷染料，其抗菌防腐作用与甲紫类似。添加有煌绿的培养基，可用于食品、水中大肠菌群的证实试验。胆盐亦是抑制革兰氏阳性菌的生长的防腐剂。

六、课程实习评价与建议（≥300字）??

食品081周杞萍：通过参加这次《食品微生物学》的课程实习，我学识了很多内容，最要的是改变了我们以前做实验的一些坏习惯。以前每次做实验都是老师为我们准备好各种材料和仪器，并且对实验的每一个步骤都进行讲解，我们慢慢地在实验时就对老师形成依赖。但经过这次课程实习，让我学会自我思考和分析的能力，还提高了我们在做实验时的主动性和积极性。虽然在做实验时没有了老师的指导和帮助，甚至实验需要到哪些仪器和材料都需要我们自己准备好，但我们能讲难题一一解开。开始时，我们虽然有一些不知所措，做起实验时有一些混乱，不过后来经过几次尝试，我们总结了经验和反复的讨论，思考，最好把实验做完。看到自己经过思考并且独立做出来的实验结果，真的很有成功感。开设《食品微生物学》这门课程实习，可以充分调动起我们参与实验的主动性和积极性，并且使我们更好的学习和掌握这门课程，因为它既可以让我们从理论知识应用到实际操作，又可以从实际操作回到理论知识，这样深刻的体验可以让我们留下深刻的记忆，而且这个课程实习的操作性很高，需要我们要做到很强的动手能力，还要有综合分析能力，慢慢地可以培养我们的思考和解决问题的能力。总之，参加这门课程可以提高我们各方面的水平。建议：希望《食品微生物学》这门课程实习的时间可以延长一些，短短的一周时间并不能使我们学好这门课程，还有很多知识我们都还没有了解，我相信通过自己亲手做过实验才会有深刻的印象，这样可以让我们更容易学习这门可能课程。还有这门课程可以多改变它的形式，不一定只做规定好和设计好的实验，还可以让我们自由发挥，各自设计出一个实验，看能不能达到实验的最终目的。

最后，要多谢伍老师和林老师一直对我们的指导和帮助，如果没有的他们的耐心的教导，我们也不会有今天的成绩，谢谢他们。

食品081梁晓君实习评价：开放的实验室管理，初步调动了我们参加实验的主动性与积极性，也有利于我们个人素质的提高，再者能使得我们对这门课程所教授的知识有了更深一层次的掌握，提高我们的专门业知识水平。使我们系统与完整学习到微生物学分离、接种与培养技术和食品卫生的检验技术，并使我们认识到与食品有关的微生物的种类，形态结构，生理生化，遗传变异，分类以及在食品环境中生长繁殖等生命规律。

在《食品微生物学》这门课程实习中，我受益颇深。首先，实体操作，提高思维的积极性。在这个过程的学习当中，让我们实地体验微生物分离与检测过程，并在观看整个操作过程产生的疑问能得到及时有效的解答，这样更能培养我们思维的主动性和积极性。另外，实验操作联系课本。从观看他人的操作过程和自己的实践过程回到课本的理论知识，深刻的体验令到自己能够十分深刻地记住课本的每一章，每一节。其次，实验严谨，注重细节。本实验可操作性强，且有一定创新，在此前多次试验过程中没有注意到的细节操作，经过实习的查缺补漏，技术操作有了一定的专业性与 6

严谨性。再者，独立操作，培养独立思考能力。老师在整个实习过程中让我们独立操作，没有给予我们过多的技术指导，使我们始终保持积极、主动的状态思考问题和解决问题，从而大大地调动我们思维的主动性和积极性。最后，实验培养了我们的 独创性想象。在实习的准备中，我们运用网络计算机网络课件的资料，可以使我们从多角度，多方面进行思考问题，想出多种解决问题的方法，有时还可以得到新颖的方法、结论，这样的教学方法，也可引导和鼓励我们进行猜想、估计和大胆假设，从而达到培养创造性思维能力的目的，诱发到我们独创性的想象力。总之，通过《食品微微生物学》这门课程实习，我个人的独立操作能力，思维的主动性，课程的 专业性都有很大的提高。

实习建议：在实习的三个试验中，检测方法有多种，可相应地运用多种方法，比较一下各种方法的优点与缺点。另外，同有些实验设备配置不足，影响了实验进程，是否可以提供更多的实验设备；最后，希望以后试验材料更多的是现实生活中没有经过老师的特别处理的材料，这样的试验更有真实性与实践性。

食品081杨俊娜

这次实习，主要是采用开放性实验。老师让我们独立思考，独立操作。在一定程度上，既锻炼了我们的思维能力，而且调动了我们做实验的主动性和积极性以及有助于个人素质的提高。由于这次实习的内容是对我们所学知识的总结，因此经过这次实习让我对以往还没掌握到位的知识点有了更进一步的认识。老师的分组也让我们全体同学都投入到了实验当中，避免了一些同学偷懒，这是一个不错的管理方法。通过这次课程实习，激发了我对《食品微生物学》的兴趣，也进一步激发了我对未知领域知识的探索。在这次实习我令我受益匪浅：首先，由于两个实验一起操作，时间安排的比较紧，做实验前没能做好准备工作，结果操作过程中比较乱，经过和搭档的认真思考以及在同学的指点下，实验还是顺利的完成了。对于这一点我还是要好好的反省的，以后不管做什么实验，一定要先熟悉整个实验远原理、整个实验流程，这样成才可以避免不必要的错误，让实验顺利的进行。在这次实习课程中，我的错误在于缺乏实验的科学性，态度不够严谨，行为不够细致，在操作过程中打烂了一些仪器，其实这些损失只要我注意一点都可以避免的。在这件事当中让我深深的感受到实验的科学性与严谨性。无论做什么事，我们都要秉承一个认真的态度，戒骄戒躁，做好每件事，做好每个实验步骤。在这此时实习中，我不禁掌握了课本上的知识，同时在素质上衣也有了相应的提高。在做实验当中，我学会了对于自己解决不了的事要虚心请教他人，要与自己的搭档协调好各方面的事，合理安排好工作，要彼此体谅对方，共同渡过难关。在整个过程中，锻炼了我的承受能力，我的忍受能力。在此要感谢老师的指导以及同学们的帮助与体谅。希望以后还会有这样的机会，来锻炼我们的各个方面的能力。

食品081林凯这次的实验实习我觉得非常成功。首先老师让我们两人一组自主独立的完成。这是一个非常成功的措施。起初我们懵懵懂懂的，不知道从何下手。以前习惯了老师的一手包办，实验前老师都教我们怎么做，遇到问题问老师就可以得到解决，可是现在老师在我们做实验的时候走开了，我们只靠自己。实验的所需器具样品需要一一算好，实验步骤需要我们一一弄清楚，实验方法也是如此。刚开始是不知道怎么做，只能按照步骤一步一步做下去，遇到问题时习惯的等着问老师，可是进度慢了。后来意识到问题的严重性，两人商量两人思考甚至和别的组商量怎么做，遇到问题也独立思考而且和组员商量，不在依赖老师了，很不错。第一次自己独立操作显然经验不足，比如说培养基的培养没有一起做完拿去培养，而是分开来，不仅浪费了资源而且使实验不紧凑。又比如说实验用品没事先准备好齐全，做着的时候突然缺了几个试管几个培养皿，使效率大大降低。这次实验调动了我们参加实验的主动性与积极性，有利于我们个人素质的提高，再者能使得我们对这门课程所教授的知识有了更深一层次的掌握，提高我们的专门业知识水平。教学内容的理论指导，大大地激发了我们的兴趣和产生疑问，使我们始终保持积极、主动的状态思考问题和解决问题，培养思维的主动性和积极性，从而大大地调动我们思维的主动性和积极性。使我们始终保持积极、主动的状态思考问题和解决问题，培养思维的主动性和积极性，从而大大地调动学生思维的主动积极性；使学生从多角度，多方面进行思考问题，想出多种解法，得到新颖的方法、结论，既有利于学生掌握知识，又有利于培养创造性思维，从而训练学生思维的发散性，也可引导鼓励学生进行猜想、估计和大胆假设，从而达到培养创造性思维能力的目的，诱发学生独创性的想象力。通过这次实验，我进一步掌握了在无菌条件下分离酵母菌的方法，并成功分离出了单个酵母菌；同时我学习并掌握了细菌的分离和活菌记数的基本方法和原理，了解了菌落总数测定在对被检样品进行卫生学评价中 7

的意义；了解了大肠杆菌群在食品卫生检验中的意义，学习并掌握了大肠杆菌群的检验方法。食微实验课程教学实习结合教学内容，激发了我的兴趣和使我产生疑问，使我始终保持积极、主动的状态来思考问题和解决问题。我觉得实验课能够使学生分享更多的学习成果，并能够提高学生的自我效能感，增强自信心。实验课我觉得可能要改的是有些实验设备配置不足，影响了实验进程，是否可以提供更多的实验设备；实验时有些实验材料出现短缺，希望以后实验材料可以准备充分一点。我们希望学校可以提供多一些这样的开放实验，让我们学生在实验的过程中学习、思考，从而结合课本的知识，这样更能够可以提高我们学生的素质。

食品081尉春兰本次试验是一次开放实验，也是一次实习实验，开放的实验室管理，调动了我参加实验的主动性与积极性，也有利于我个人素质的提高，而且使我对这门课程所教授的知识有了更深层次的理解和掌握，提高我们的专门业知识水平。特别感谢老师给了我们这样一个机会，通过这次的课程实习，确实激发了我学习这门课程的兴趣，让我发现实验室虽然是一个严肃的地方，但是实验过程却是一个有趣的过程，并且在整个学习过程当中，让我实地体验微生物分离与检测过程，并且在观看整个操作过程产生的疑问能及时问老师而有效的得到解答，这样更能培养我思维的主动性和积极性，在《食微》这门课程实习中，我受益颇深。在整个学习过程中，老师一再强调要自己动脑，自己动手，这样才能培养我们能独立思考的习惯和能力。确实，从观察他人的操作过程到自己的实践过程，从现实的动手过程中的经验回到课本的理论知识，能给自己深刻的记忆。这次试验操作性强，且有一定创新，技术又有一定的升华，实验既有探索性、设计性的项目，又有以培养我们的综合分析能力的内容，是我们食品学生开展开放性实验探索的有益尝试。这使我们积极、主动的思考问题和解决问题，培养思维的主动性和积极性，从而大大地调动我思维的主动性和积极性；，所以对于开放性实验，我觉得对于我们来说是很有实用价值的，它能煅炼我们的动手能力，但动手之前又心须有一定的理论为基础，故两全齐美，理论结合实践，不仅对理论知识有更深入的理解，而且也能清晰了解到微生物分离与检测理论在实践中是一个如何应用的过程，这样更能坚定我们学这门课的信心和立场！通过这次实验，我进一步掌握了在无菌条件下分离酵母菌的方法，并成功分离出了单个酵母菌；同时我学习并掌握了细菌的分离和活菌记数的基本方法和原理，了解了菌落总数测定在对被检样品进行卫生学评价中的意义；了解了大肠杆菌群在食品卫生检验中的意义，学习并掌握了大肠杆菌群的检验方法。上课时老师运用网络课件，可以促使我从多角度，多方面进行思考问题，想出多种解法，得到新颖的方法、结论，它既有利于我掌握知识，又有利于培养创造性思维，从而训练我思维的发散性，也可引导鼓励我进行猜想、估计和大胆假设。通过自己思考和动手完成的实验，更能增强我们的自信心，而且成功的实验结果让我很有成就感，对这门课更加感兴趣，我觉得实验课能够使学生分享更多的学习成果。实验课的不足之处是实验室器材有限，而且要是多人一起实验时，总是找不到该要的东西，应该分组进行实验，而且就不会太吵；同时有些实验设备配置不足，影响了实验进程，是否可以提供更多的实验设备；实验时有些实验材料出现短缺，希望以后实验材料可以准备充分一点。我希望学校可以提供多一些这样的开放实验，让我们学生在实验的过程中学习、思考，从而结合课本的知识，这样更能够可以提高我们学生的素质。

再次谢谢老师给了我们这样的机会！

附：GB 4789.2—2010，GB 4789.3—2010

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中华人民共和国国家标准

GB 4789.2—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验 菌落总数测定

National food safety standard

Food microbiological examination：Aerobic plate count

中华人民共和国卫生部 发布

2010-03-26 发布 2010-06-01 实施

GB 4789.2—2010

I

前 言

本标准代替GB/T 4789.2-2008《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》。

本标准与GB/T 4789.2-2008相比，主要修改如下：

——修改了标准的中英文名称；

——修改了菌落总数计算公式中的解释；

——修改了培养基和试剂；

——删除了第二法 菌落总数PetrifilmTM 测试片法。

本标准的附录A是规范性附录。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB 4789.2-1984、GB 4789.2-1994、GB/T 4789.2-2003、GB/T 4789.2-2008。

GB 4789.2—2010

1 范围

本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。

本标准适用于食品中菌落总数的测定。

2 术语和定义

2.1 菌落总数 aerobic plate count

食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL） 检样中形成的微生物菌落总数。

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。

3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

3.4 天平：感量为0.1 g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。

3.9 无菌培养皿：直径90 mm。

3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

3.11 放大镜或/和菌落计数器。

4 培养基和试剂

4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。

4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.2。

4.3 无菌生理盐水：见附录A 中A.3。

5 检验程序

菌落总数的检验程序见图1。

图1 菌落总数的检验程序

6 操作步骤

6.1 样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式 9

均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

6.1.3 用1 mL

1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

6.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

6.2 培养

6.2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h。

6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。

6.3 菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

6.3.1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7 结果与报告

7.1 菌落总数的计算方法

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7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：………（1） 式中：

N=ΣC／（n1+0.1 n2）d

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

12上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。

7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。

7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.2 菌落总数的报告

7.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1 平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基

A.1.1 成分

胰蛋白胨 5.0 g、酵母浸膏 2.5 g、葡萄糖 1.0 g、琼 脂 15.0 g、蒸馏水 1000 mL，pH 7.0±0.2

A.1.2 制法

将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。

A.2 磷酸盐缓冲液

A.2.1 成分

磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g、蒸馏水 500 mL、pH 7.2

A.2.2 制法

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。

A.3 无菌生理盐水

A.3.1 成分

氯化钠 8.5 g、蒸馏水 1 000 mL

A.3.2 制法

称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。

11

中华人民共和国国家标准

GB 4789.3—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

National food safety standard

Food microbiological examination: Enumeration of coliforms

中华人民共和国卫生部发布 2010-03-26 发布2010-06-01 实施

GB 4789.3—2010

I 前言

本标准代替GB／T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。

本标准与GB／T 4789.3-2008相比，主要修改如下：

——修改了标准的中英文名称；

——“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU～150 CFU”； ——删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB ／T 4789.3-2003、GB ／T 4789.3-2008。

GB 4789.3—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

1 范围

本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。

本标准适用于食品中大肠菌群的计数。

2 术语和定义

2.1 大肠菌群coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

2.2 最可能数most probable number，MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。

3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 恒温培养箱：36℃±1 ℃。

3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。

3.4 天平：感量0.1 g。

3.5 均质器。

3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。

3.9 无菌培养皿：直径90 mm。

3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

3.11 菌落计数器。

4 培养基和试剂

4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。

4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。

4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。

4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。

4.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。

4.6 无菌1 mol／L NaOH：见附录A 中A.6。

4.7 无菌1 mol／L HCl：见附录A 中A.7。

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第一法 大肠菌群MPN 计数法

5 检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序

6 操作步骤

6.1 样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品，放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r／min～10000 r／min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。

6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol／L NaOH 或1 mol／L HCl 调节。

6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。

6.2 初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

6.3 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中， 13

36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

第二法 大肠菌群平板计数法

7 检验程序

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

8 操作步骤

8.1 样品的稀释

按6.1进行。

8.2 平板计数

8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

8.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在15 CFU～150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。

8.4 证实试验

从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

8.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）

-4样品中大肠菌群数。例：10样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中

10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6／10×104／g（mL）=6.0×105CFU／g（mL）。

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

A.1.1 成分

胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g、氯化钠 5.0 g、乳糖 5.0 g、磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g、月桂基硫酸钠 0.1 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 6.8±0.2

A.1.2 制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。1.01MPa 高压灭菌15 min (121 ℃高压灭菌15 min)。

A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g、乳糖 10.0 g、牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL、0.1%煌绿水溶液 13.3 mL、蒸馏水 800 mL、pH 7.2±0.1

A.2.2 制法

将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

A.3.1 成分

蛋白胨 7.0 g、酵母膏 3.0 g、乳糖 10.0 g、氯化钠 5.0 g、胆盐或3号胆盐 1.5 g、中性红 0.03 g、结晶紫 0.002 g、琼脂 15 g～18 g、蒸馏水 1 000 mL、pH 7.4±0.1

A.3.2 制法

14

将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 ℃～50 ℃倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。

A.4 磷酸盐缓冲液

A.4.1 成分

磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0 g、蒸馏水 500 mL、pH 7.2、

A.4.2 制法

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol／L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 ℃高压灭菌15 min。

A.5 无菌生理盐水

A.5.1 成分

氯化钠 8.5 g、蒸馏水 1 000 mL

A.5.2 制法

称取8.5ｇ氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。

A.6 1 mol／L NaOH

A.6.1 成分

NaOH 40.0 g、蒸馏水 1000 mL

A.6.2 制法

称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min。

A.7 1 mol／L HCl

A.7.1 成分

HCl 90 mL、蒸馏水 1 000 mL

A.7.2 制法

移取浓盐酸90 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，121 ℃高压灭菌15 min。

附录B

（规范性附录）

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表

每g（mL）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见表B.1。

表B.1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表

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注1：本表采用3 个稀释度[0.1 g(mL)、0.01 g(mL)和0.001 g(mL)]，每个稀释度接种3 管。

注 2：表内所列检样量如改用l g （mL）、0.1 g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10 倍；如改用0.01g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10 倍，其余类推。

16