免疫学实验指导

生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用

 冯玉萍

[分组]：4人/组，实验用动物、器材以每组需要量设计

[班级]  2006生物工程、生物技术     [学生人数]：65人/58人。分16组/15组

[时间]  2008年3月—20##年7月     两周一次4学时。

                        目    录

实验一、免疫学实验动物的一般操作

实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察

实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法

实验四、淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成试验

实验五、IgG的分离和纯化

实验六、玻片凝集试验(ABO血型鉴定)

实验七、环状沉淀试验

实验八、琼脂扩散试验（单向）

实验九、巨噬细胞吞噬功能试验

实验十、白细胞吞噬试验

实验一、免疫学实验动物的一般操作

[实验原理]

实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果，通过实验动物进行验证，因此必须掌握实验动物的一般操作技术。

[目的要求]

1、实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）

2、了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。[自学]

3、学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。

4、练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。

5、练习小白鼠的取血方法。

6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。

 [实验动物]  小白鼠，2只/组，共需18 ~ 20只。

[试剂] 

⑴ 3%来苏儿或3%石炭酸 100~150 ml/组；

⑵ 无菌生理盐水100~150ml/组；磷酸盐缓冲液20~50ml/组（带滴管、染色用）。

⑶ 3 ~ 5% 苦味酸20~50ml/组（带滴管,编号用）；

⑷ 5%品红20ml~50ml/组（带滴管，编号用）；

⑸ 瑞特氏（wright‘s）染色液50ml/组（带滴管，染色用）；

*抗凝剂一支

[器材]

⑴ 1ml注射器及针头2支/组；

⑵ 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；

⑶ 手术剪刀2把/组；镊子2把/组；载玻片、盖玻片各6片/组；

⑷ 毛细吸管2支、50—100ml烧杯1个/组

⑸ 显微镜6台/组

[6] 鼠笼1个/组

[操作步骤]

1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、皮内注射、腹腔注射的方法。（见《免疫学实验》P9-13。

2、练习小白鼠尾静脉取血法。（P15）

实验报告要求：

1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。

2、实验原理、目的要求

3、实验操作记录（实验步骤、结果）

4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？为什么？

5、对实验动物编号有何实际意义，你对书中关于小白鼠的编号方法有何想法？有无更简便、实用的方法？

6、若给动物注射传染性材料应注意些什么？

实验二、免疫器官与免疫细胞观察

[实验原理]

免疫器官、免疫细胞是动物免疫系统的主体。在胸腺、脾脏中有大量淋巴细胞存在，在外周血液中有大量淋巴细胞和白细胞等免疫细胞存在，发挥着免疫监视作用。

[ 目的要求 ]

1、练习血涂片的制作

2、学习小鼠颈椎脱臼致死的方法，观察小白鼠的解剖结构；

3、学习脾脏、胸腺的触片制备与染色方法；观察小鼠脾脏触片、血液涂片中的免疫细胞，并画图。

[方法与步骤]

1、练习血涂片的制作（3张/组）

1）准备一张洁净玻片，取血1滴于玻片右侧,另取一光边玻片的一端,放在血滴前方,并逐渐后移接触血滴,血液立即沿推片散开,然后将推片与载片保持30一45度角,平稳地向前推动,至玻片另一端,载玻片上便留下一层血膜。良好的血膜象舌头,头、体、尾鲜明,厚薄适宜、分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。

2）染色：

A、瑞特氏(WrightFs)染色法：

①.血涂片制成后可在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。选择良好的血片，用特种玻璃铅笔画出两边界限(注意保留尾部，因体积大的细胞往往在此出现)，以防染液外溢。

②在血膜上滴加几滴瑞氏染色液,左右晃动，使染液完全覆盖血膜，注意染液不宜过多而溢出界限，亦不能过少而干燥。

③1—2min后，滴加等量磷酸盐缓冲液或生理盐水，2—3min后，可见表面有金属光泽，即可用清水轻轻冲去染液，待血片自然干燥或用滤纸轻轻吸干。在正常的情况下，血膜外观染成粉红色。

3）镜检：先在低倍镜下检查血片，染色是否合格，血细胞分布是否均匀等,然后换高倍镜或油镜观察，并绘图，指出淋巴细胞与白细胞、红细胞。如自己图片不成功，则对教学片进行观察和绘图。

结果：

血液涂片瑞特氏染色法染色的结果：

中性粒细胞：是白细胞中数量最多的细胞，胞体大于红细胞，细胞核蓝紫色，呈分叶形，可分2—5叶。叶间有细丝相连；细胞浆为粉红色，其中充满褐灰色的小颗粒。

嗜酸性粒细胞：数量少，占白细胞总数的0.5—3%。胞体较中性粒细胞大，胞核蓝色，颗粒粉红色。

嗜碱性粒细胞：细胞核蓝紫色，颗粒蓝色。

红细胞数量最大，边缘厚（浓染），中央薄（淡）。

淋巴细胞细胞质天蓝色，细胞核几乎占据整个细胞。

B、姬姆萨染色法：

⑴ 用甲醇固定标本10分钟，或醋酸：甲醇=1：3的混合液固定30分钟。

⑵ 用滴管吸取姬姆萨染色工作液布满材料面，注意不要有气泡。

⑶ 染色10——15分钟后，用自来水冲洗，空气干燥，二甲苯透明5分钟。

⑷ 用光学树脂封片后观察。

结果：

血液涂片姬姆萨染色法染色的结果：有核细胞的细胞核染成紫红色或蓝紫色，细胞浆染成粉红色。无核细胞染成：

C、血液标本片观察结果：

2、练习小白鼠脊椎脱臼处死法。或用乙醚麻醉致死。

3、仔细解剖小鼠，观察小鼠的内脏器官，找出脾脏、胸腺，分别做触片（3张/组）并用瑞特氏(WrightFs)染色法或姬姆萨染色法染色、观察。

4、观察标本片，绘图描述人、小鼠血液中的几种有形成分。

[结果]

1、脾脏触片瑞特氏染色法染色的结果：

2、脾脏触片姬姆萨染色法染色的结果：

3、标本片观察结果：

实验报告要求：

1、时间、地点、操作人、同组人、指导老师。

2、实验原理、目的要求

3、实验操作记录（实验步骤、结果）

4、分析总结：依据实验原理、目的要求，分析总结实验是否成功，是否达到实验目的？为什么？

5、绘图描述：人、鼠血液涂片中的淋巴细胞、粒细胞、红细胞

实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法

[实验原理]

    抗原免疫动物后，其相应的抗体就会产生并存在于动物的体液中。血清是体液的重要组成部分，存在大量抗体。学会了制备血清的方法，就学会了制备抗血清的方法。

    红细胞是免疫学反应中常用的颗粒性抗原，也是可溶性抗原的载体及补体结合反应中指示系统的组成成员。在许多免疫学检测中都要用到红细胞，因此，血清与红细胞的制备技术，是免疫学实验的基本技术。

[目的要求]

1、学习鸡、兔的动脉、静脉及心脏等部位的无菌采血方法；

2、学习动物血清、红细胞的制备方法；

3、掌握离心机的使用方法。

4、解剖鸡、兔，观察免疫器官。

[实验动物] 鸡、兔各1只/2组，共需鸡5只、兔5只。

[试剂] 

⑴ 3%来苏儿或3%石炭酸 50 ~100 ml/组；

⑵ 无菌生理盐水150ml/组；分两瓶（100ml/瓶、50ml/瓶）

⑶ 500单位/ml的肝素溶液2~5ml/班。

[器材]

⑴ 10ml注射器及针头2支/组；

⑵ 碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；50-100ml烧杯1个/组；

⑶ 手术刀、剪、镊子各1把/组；

⑷ 50~100ml、带玻璃珠的无菌三角烧瓶1个/组（可用20ml链霉素瓶代替）；

⑸ 无菌试管及试管塞6套/组；离心管2支/组；

（6）离心机1台/6组，共3台；

⑺ 试管架1个/组、恒温培养箱一个/班、冰箱一个/班。

 [操作步骤]

1、兔耳静脉采血（P19）

2、兔耳中央动脉采血（P19）

3、兔心脏采血：（P18）

4、鸡翼根静脉取血（P19）

5、鸡心脏取血（P18）。

6、离心法制备血清：

取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌的离心管中，平衡离心管，离心10——20分钟/20##—3000rpm。用毛细滴管吸出血清，将获取的血清分装于已灭菌的小瓶内，加盖并用封口胶将瓶口封住，贴上标签注明血清的名称及制备日期，置低温冰箱中保存备用。

7、沉淀法制备血清：

取下注射器针头将抽得的血液以无菌操作注入无菌试管（或平皿）内，加盖置37℃温室内2小时，凝固后用无菌滴管沿试管（或平皿）边缘将血块与皿壁脱离，然后放入4~8℃冰箱中过夜，使血清充分析出。吸取血清分装于已灭菌的小瓶内备用。

8、动物血红细胞制备：

(1) 无菌操作取静脉血，将血注入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振摇数分钟以脱纤维抗凝。

(2)取适量的脱纤维血，用2—5倍无菌生理盐水洗2次，每次2000rpm，离心10分钟，弃上清后用无菌生理盐水配成20%的红细胞悬液，置4℃冰箱保存备用。

作业：

实验报告

1、  简述无菌采血应注意哪些事项？ 

2、  离心机操作中应注意哪些问题？

3、血清制备中应注意哪些问题？   

4、红细胞制备中应注意哪些问题？

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉！

   

               实验四  血球凝集反应和交叉配血试验

[实验原理]

 红细胞等颗粒性抗原与血清中相应的抗体，在适量电解质存在的条件下，经一定时间后，凝集成肉眼可见的凝集物。抗原抗体的这种反应，称为凝集反应。

在人的ABO血型中，A型血的红细胞上有A抗原，血清中有抗B抗原的抗体；在B型血的红细胞上有B抗原，血清中有抗A抗原的抗体；故A型血的红细胞与B型血的血清混合时，在有电解质存在的条件下就可能发生凝集；同样，B型血的红细胞与A型血的血清混合，在有电解质存在的条件下也可能发生凝集；AB型血的红细胞上，既有A抗原，也有B抗原，而其血清中既无抗A抗原的抗体，也无抗B抗原的抗体；而O型血的红细胞上既无A抗原，也无B抗原，而其血清中既有抗A抗原的抗体，也有抗B抗原的抗体，故AB型血的血清与A型、B型、O型血的红细胞混合，均不会发生凝集，也就是说，AB型血的人能接受A型、B型、O型血液的输血；而O型血的血清与A型、B型、AB型血的红细胞混合，均可能发生凝集；既O型血的人不能接受A型、B型、AB型血液的输血，但他却是万能输血者，其红细胞可以输给任何血型的人。

兔、鸡是否也有相应的血型？尚不清楚。本实验可自行设计，在有生理盐水存在的条件下，利用不同组的兔与兔、鸡与鸡、鸡与兔的红细胞和血清的混合，观察凝集现象和溶血现象，并分析、总结实验结果。

[目的要求]

    1、将实验三所制备的鸡、兔血清、红细胞分别进行交叉，自行设计，观察鸡与鸡、兔与兔、鸡与兔之间血清与红细胞交互混合，产生的凝集现象和溶血现象。

    2、尝试着利用抗原抗体反应的特异性对实验结果进行解释。

[试剂]  0.85%生理盐水，100ml/组；5ml注射器2支/组。

[器材]  载玻片每人1张、小试管4支/组，毛细滴管2支/每组。

[操作步骤]

    1、将制备好的鸡、兔红细胞用生理盐水稀释成0.5%的混悬液。

2、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象：

 取1#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入2#、3#兔（鸡）红细胞，用火柴棒混匀，

过10~15分钟，观察，血球凝集现象。

3、兔与鸡（鸡与兔）配血，观察血球凝集现象

 取1#、2#兔（鸡）血清1滴于载玻片上，加入1#、2#鸡（兔）红细胞，用火柴棒混匀，过10~15分钟，观察，血球凝集现象。

4、兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象：

取1#、2#兔（鸡）血清0.5~1ml，加入0.5%的1#、2#鸡（兔）红细胞，混匀，静止过15~20分钟，观察上清液是否溶血（变红），血球是否凝集？（沉淀物边缘是否整齐）。

5、记录结果

如：兔与兔（鸡与鸡）配血，观察血球凝集现象

如：兔与兔（鸡与鸡）配血，观察溶血现象

6、总结、分析、讨论。

实验报告

附、玻片凝集反应试验

（ABO血型鉴定试验）

[目的要求]

1、掌握玻片凝集试验的操作方法，了解其特点和用途；

2、学习玻片凝集试验结果的观察方法

3、了解ABO血型鉴定的原理，掌握其鉴定方法

 [试剂]

1、诊断用人血型抗A血清；

2、诊断用人血型抗B血清；

3、无菌生理盐水

4、消毒液

[器材]

1、凹玻片或载玻片6片/组，

2、无菌刺血针、小试管、尖嘴滴管、毛细吸管、牙签、酒精棉球、无菌干棉球、显微镜各1个/人，每组6人；

3、试管架、记号笔各1个/组。

[操作步骤]

(1)用酒精棉球消毒被检者的指尖或耳垂,用无菌刺血针刺破皮肤,取血1~2滴放入盛有0.5~1ml生理盐水的小试管中,摇匀即成为1%~2%的红细胞悬液。取血后,用无菌干棉球压迫针眼止血。

  (2)取双孔凹玻片一张或载玻片一张,在二孔(或二端)处标明A、B。用尖嘴滴管分别吸取诊断用人血型抗A和抗B血清,各加一滴于相应的孔内(注意两滴管切勿混用)。

(3)用尖嘴滴管吸取待检红细胞悬液于A、B血清中各加1滴。(注意勿使滴管尖端和血清接触)。

(4)分别用牙签将抗血清与红细胞悬液混匀(也可前后左右轻轻晃动载玻片使其混匀，用牙签混匀时应分别用两端搅拌,切不可用同一端在A、B两抗血清中搅拌)。

(5)充分混匀后,置室温于实验台上静置10~15分钟后观察有无凝集发生。

如混合液由均匀混浊的红色逐渐变为透明,并出现大小不等的红色凝集块,即为红细胞凝集;若混合液呈均匀分散混浊状,边缘整齐,则为不凝集。如观察不够清楚,可置显微镜下用低倍镜观察。

血型判定可参照下图及表。红细胞凝成大块或有数个红细胞凝集在一起为凝集。

 用抗血清鉴定血型的结果与判定

＋表示凝集，－表示不凝集。

[作业与思考题]

1.你的血型是何型?你是如何判断的?…

2.你能接受何种血型的血液?能输血给何种血型的人?为什么？

3.根据下表中提供的凝集反应的结果,请将血型检查结果填入表中：

4.完成下表：

5、如果要检测血清中血型抗体的效价，请你写出主要的操作过程。

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P77-109

   

  

实验五、淋巴细胞的分离与E玫瑰花环形成试验

[目的要求]

1、学习血液中免疫细胞的分离方法。

2、学习E花环试验的操作方法。

3、观察显微镜下E花环的形态。

4、掌握花环计数的方法及其形成原理。

5、了解检测Ea、Et花环的意义。

[材料与试剂]

⑴ 人外周血：静脉采血2~4ml，注入盛有2~3滴肝素（500单位/ml）的青霉素瓶中，摇匀。应在4小时内进行实验。

⑵ Alsever＇s保存液

⑶ 绵羊红细胞（2周内）。

⑷ 无菌及吸收过的小牛血清：将小牛血清置56℃水浴经30分钟灭活后，按每毫升小牛血清加入已洗涤过的压积绵羊红细胞0.1ml混匀，置37℃水浴中1小时，然后置4℃冰箱过夜。以2000rpm离心沉淀10分钟，取上清过滤除菌，分装小瓶，低温保存备用。

⑸ 无钙、镁Hank′s液；

⑹ 淋巴细胞分离液，比重为1.077~1.080。（上海试剂二厂生产，密度P（g/ml）为1.077±0.002，避光低温（4℃）保存，有效期2~3年。）

⑺ 0.8%戊二醛，用0.43%NaCl溶液临用前配制。

⑻ 瑞氏染色液或1%美蓝水溶液。

[器具]

水平式离心机、水浴箱、冰箱、离心管、吸管、试管、内放玻璃珠的三角烧瓶、显微镜等。

[操作步骤]

1. 制备淋巴细胞悬液

(1)取1m1淋巴细胞分离液加1ml肝素抗凝血,使血液轻轻覆盖在分离液上面,并使血液与分离液之间保持清晰的界面。

(2)立即置水平式离心机中以2000rpm离心20分钟。离心后分为四层,最上层为血浆,中间一层为分离液。上层和中层之间有一乳白色层含有大量淋巴细胞,小量大单核细胞。最下层为红细胞。(见图)

(3)用尖嘴滴管小心地吸取淋巴细胞于一试管中,加入无Ca ²⁺、Mg ²⁺的Hank,s液洗涤3次,每次以2000rpm离心10分钟沉淀淋巴细胞,末次洗涤后弃上清,仅留约0.1ml液体,制成淋巴细胞悬液。细胞计数,用Hank,s液配成5×10 ⁶/m!的细胞悬液。               淋巴细胞分离过程           

2.绵羊红细胞悬液的制备

取一定量阿氏液保存的绵羊血于离心管中,用无Ca²⁺、、Mg²⁺的Harlk′s液洗3次,末次洗涤后取压积的血球用上述Hank,s液配成1%悬液,细胞浓度约为2×10⁸细胞/ml。

3.活性T花环(Ea花环)的形成

(1)取淋巴细胞悬液0.1ml，加入小牛血清0.1ml和0.2ml1%的绵羊红细胞悬液混匀。

(2)于水平式离心机内以500~800rpm离心5分钟,小心吸去上清液,留下约0.1ml液体,立即沿管壁加入一滴0.8%戊二醛溶液固定2~3分钟,轻轻转动试管小心混匀。

(3)加入1~2滴1%美蓝水溶液混匀,取一滴于载玻片上、置油镜下汁数200个淋巴细胞中形成花环的淋巴细胞百分数。一般以淋巴细胞吸附三个以上绵羊红细胞者为一个花环。

4.总T花环(Et花环)的形成

(1) 取淋巴细胞悬液0.1ml加入小牛血清0.1ml及0.2m11%的绵羊红细胞悬液,混匀,置37℃水浴5分钟,其间摇动2次。

 (2) 500~800rpm离心5分钟,置4℃冰箱2~4小时,吸去少许上清液,约留0.1ml液体,沿管壁加入0.8%戊二醛溶液一滴,固定2~3分钟,轻旋试管以混匀,其余同Ea花环步骤。

[注意事项]

1.必须采用新鲜抗凝血来分离淋巴细胞,从取血到试验最多不超过4小时。否则,形成E花环的百分数会显著下降。

    2.绵羊红细胞的质和量对花环形成有较大的影响。不新鲜的绵羊红细胞可使花环形成显著减少。绵羊红细胞与淋巴细胞的比例以100:1为宜,比例过低,花环形成明显降低,反之则升高。

    3.pH值对花环的形成有影响。最适pH为7.2~7.40。过高、过低的pH值可使花环值下降。

 4.在制片时需混匀花环悬液,悬浮时一定要轻旋试管,不可用滴管用力吹打或摇动试管,以免形成的花环脱落。

5.镜检时有干片和湿片二种方法。湿片不能长期保存。干片是推片法,标本片可长期保存,但推片时花环易脱落,花环形成细胞分布不均匀,推片尾部常高于头部一倍以上。

6.花环形成时,加入蛋白成分可提高花环的稳定性,常用胎牛血清(或小牛血清),但需先经56℃30J分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收,以除去嗜异性抗体,否则此抗体可和绵羊红细胞起反应并吸附于B细胞膜Fc受体上,产生B细胞花环,从而影响试验的准确性。

[作业与思考题]

1.用简明扼要的方式表明Ea和Et花环形成的操作流程。

2.你的实验结果怎样?请分析试验成败的原因。

3.Ea和Et花环形成时的主要区别是什么?

4.作E花环试验时,为何加入小牛血清?不用小牛血清用人血清行吗?加入的小牛血清为什么要经56℃30分钟灭活,并用绵羊红细胞吸收?

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P179-183

实验六、IgG的分离和纯化

[目的要求]

1、学习动物血清中IgG的分离纯化方法；

2、比较成年牛血清、新生牛血清IgG的含量；

3、了解分离、纯化抗体的原理；

4、熟练掌握离心机的使用方法。

[试剂] 

⑴ 成年牛血清20ml、新生牛血清20ml；

⑵ pH7.4 、0.01mol/L磷酸盐缓冲液250ml。

⑶ pH8.0、0.005mol/L磷酸缓冲液250ml；

⑷ 饱和硫酸铵溶液500ml；

⑸ 1%氯化钡250ml。

[器材]

⑴ 无菌1ml、2ml、5ml、10ml吸管各2支/组；

⑵ 酒精棉球适量；

⑶ 离心管2支/组

⑷ 离心机1台/5组；2-3台/班

⑺ 试管架1个/组、记号笔1支/组、4℃冰箱1个/班。

[操作步骤]

1.分别取成年牛血清、新生牛血清各2ml（X）于离心管中，加等量的pH7.4、0.01mol/L,磷酸盐缓冲盐水或生理盐水,将血清稀释一倍,慢慢摇动避免形成泡沫。

2.在冰浴中逐滴加入4ml（2X）饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,以防止形成团块,减少沉淀。此时即有大量的Y-球蛋白沉淀(主要是IgG)。

3.置冰箱静置30分钟或更长时间后,冷冻离心(3000~4000rpm,15分钟),弃上清。沉淀用2ml（X）  0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐水溶解。

4.逐滴加入1ml（1/2 X）饱和硫酸铵边加边搅拌,使饱和度为33%,置4℃冰箱30~60分钟,离心收集沉淀。同法重复3、4步骤3次,可得到较纯的IgG。

 [作业与思考题]

实验报告

1.分离纯化免疫球蛋白为什么尽可能在低温条件下进行?所用溶液为何要先冷却?

2.常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要有哪几种?各自得到的纯度如何?

3.五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗?

4.如果用血浆来分离纯化IgG,需不需要去除纤维蛋白原?

5.分离纯化IgG时,为什么硫酸皱的饱和度先调至50%,然后调至33%?加入硫酸铵溶液时,为什么要一滴滴地加?

6.如果要提取IgA,从初乳中提取是否比从血清中提取合算?为什么?

    7.比较成年牛血清与新生牛血清中IgG含量并分析之。

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P44-48。

实验七、单向琼脂扩散试验

[目的要求]

1、通过本试验，学习一种抗原定量的测定方法。       

2、了解沉淀环的直径与抗原或抗体浓度的关系。

[材料与试剂]

1、3%生理盐水琼脂；

2、正常人血清、已知IgG含量的人血清；

3、羊抗人IgG抗血清；

4、生理盐水；

5、待测羊血清。

[器具]

1、载玻片6张/组；

2、打孔器、微量加样器、湿盒（盒内铺二层湿纱布）、

[操作步骤]

1、溶化3%生理盐水琼脂,并置56℃水浴中保温。

2、 稀释抗血清:将羊抗人IgG抗血清按1/2效价用生理盐水稀释(如效价为1:60,则稀释成1:30),分装于小试管,每管1.5ml，置56℃水浴保温(温度不能高于56℃,且时间不能过长)。

3、.取上述56℃水浴保温的琼脂和抗血清等量混合,小心倾注于置水平台上的载玻片上(勿倒出玻片外!)。(板上的抗血清终浓度是多少?)

4.稀释参考血清:取参考血清一支,加入蒸馆水0.5时,完全溶解后用生理盐水倍比稀释成1:10~1:160五种浓度,并算出IgG的相应含量(严g/ml)。如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。参考血清稀释度为1:10、1:20、1:40,则IgG相应含量为1166μg/ml、583μg/ml、291.5μg/ml。

5.将待测血清用生理盐水稀释成1:40的浓度。

6.待琼脂凝固后按模板用打孔器打孔,孔径3mm,孔距10mm。孔中的琼脂如未吸出,则用注射器针头将其挑出,务必将孔中的琼脂挑净且不可损坏孔缘。

7.加样:用微量加样器吸取各浓度的参考血清,按顺序加入各孔中,每孔加入10μl。每一浓度加二个孔。已稀释好的待测血清,每份标本也加二个孔,每孔10μl。

8.扩散: 将加好样的琼脂板平放于湿盒内，置30℃温箱或室温扩散24~48小时。

9.取出琼脂板,即可见清晰的乳白色沉淀环。测量各浓度沉淀环的直径。以两相同稀释度孔沉淀环直径的平均值为横坐标,相应孔中IgG的含量为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线。

10.待测血清标本中IgG的含量是根据标本孔中沉淀环直径,在标准曲线上查得IgG含量乘以标本的稀释倍数,即为标本IgG含量。

[作业与思考题]           备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P123-126  !

1.在单向琼脂扩散试验中,为什么一定要把板铺平?如何才能使板铺平呢?

2.在本试验中,加样后进行扩散时,为什么一定要把板放平?为什么要保持潮湿环境?

3.为什么水浴温度要控制在56℃?超过60℃行不行?抗血清在56℃水浴中放置过长时间对实验有无影响?

4.为什么抗体板中抗体浓度越小,沉淀环越大,灵敏度越高？

实验八  双向琼脂免疫扩散试验

[实验原理]  将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔内，使两者互相扩散，当扩散到两者浓度、比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀。呈现乳白色沉淀线。如果抗原抗体不相对应，则无沉淀线出现。故此试验可用已知抗原检测未知抗体；也可用已知抗体检测未知抗原。

如果加于琼脂孔中的抗原、抗体，含有两种以上抗原、抗体系统时，由于各种抗原的浓度、分子量及扩散系数不同以及各对抗原抗体形成沉淀时所需的最适比例不同，扩散后变可形成多条沉淀线。每一条沉淀线代表一对抗原、抗体系统。所以本实验可以用于分析、鉴定复杂的抗原物质成分，以及测定抗原或抗体的纯度。

根据沉淀线的形态和位置，可了解抗原、抗体的相对浓度和扩散速度。而扩散速度与分子量成反比。因此也可间接了解抗原抗体的分子量大小。

[操作步骤]

1）溶解琼脂培养基，练习抗原、抗体双向扩散试验的载玻片铺板、打孔的方法。每组选出一块两边均打好梅花孔的载玻片。梅花孔孔径3mm，孔距4mm。

2）加样：

A测定抗原效价：在一组梅花孔中，以上方为第一孔，顺时针方向分别为2、3、4、5、6孔。加入1：4、1：8、1：16、1：32、1：64稀释的抗原10ul；在中间孔加入抗体（1：4稀释）10ul。

B、样品血清抗原检测：

在另一组梅花孔中，以上方为第一孔，顺时针方向分别为2、3、4、5、6孔。在1、4孔中加入生理盐水，作为阴性对照；2、5孔中加入1：4稀释的抗

原做阳性对照；3、6孔中加入1：20稀释的待检血清各10ul；在中间孔加入抗体（1：4稀释）10ul。

3）扩散：将加好样的琼脂板平放于湿盒内，置30℃温箱或室温扩散24～48小时，观察、分析实验结果。

作业：

实验报告 

附：环状沉淀试验

 [目的要求]

1、了解环状沉淀试验的原理及用途

2、通过沉淀素的效价测定，学习环状沉淀试验的操作方法及观察结果的方法。

[材料和试剂]

1、人血清；

2、兔抗人血清

3、生理盐水。

[器具]

1、沉淀管（2.5~3.0mm的内径，约30mm长）8支/组

2、5ml小试管7支/组

3、毛细吸管2支/组、吸管2支/组

4、记号笔1支/组

5、沉淀管架1支/组，50-100ml烧杯1个/组。

[ 操作步骤]

3.取8支沉淀管于试管架上并编号。}

4.用毛细吸管吸取1:2的兔抗人血清于各沉淀管底部,每管2滴。

5.用另一毛细吸管吸取上面已稀释好的人血清,按下表加入各管。

 

加液时应从最高稀释度(第7管)加起,沿管壁徐徐加入,使两液面间形成一明显界面,切勿使之相混,如界面不清时应重做。第8管加生理盐水以作对照。

6.于室温中静置15~30分钟后观察结果,观察二液面交界处有无乳白色沉淀环出现。凡有乳白色沉淀环出现者记作(+),无沉淀环者记作(-)。最高稀释度的抗原与抗体交界面之间仍有乳白色沉淀者,该管的稀释度即为沉淀素的效价。

[作业与思考题]

1、将试验结果填入表中：

沉淀素的效价是多少？

2、 简述环状沉淀试验的用途。

3、 试比较凝集反应与沉淀反应的异同。

4、请设计一个实验用于鉴定血迹是人血还是动物血。

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P119-122

实验九、巨噬细胞的体内吞噬试验

[目的要求]

1、通过实验，了解巨噬细胞在非特异性免疫中的作用。

2、观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象。

3、掌握吞噬细胞百分数和吞噬指数的计算方法。

[实验动物] 小白鼠1只/组，共需10只/班

[试剂] 

⑴ 1%鸡红细胞50ml。

⑵ 6%可溶性淀粉肉汤50ml。

⑶ 瑞特氏染色液50ml/组。

⑷ 无钙镁Hank‘s液腹腔灌洗液。

⑸ PH7.0~7.2 磷酸盐缓冲液50ml/组；

⑹ 1%戊二醛固定液50 ml/组。

[器材]

⑴ 无菌1ml、2ml注射器及针头各2支/组；

⑵ 酒精棉球适量；

⑶ 载玻片6片/组

⑷ 计数器2个/组

[操作步骤]

*  小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验

(1)试验前三天,每只小白鼠腹腔内注射6%淀粉肉汤1m1。

(2)试验当天,给小白鼠注射1%鸡红细胞1ml。

(3)注射1%鸡红细胞后约30分钟，再于小白鼠腹腔注入灌洗液1ml轻揉腹边缘部。约20分钟后,用注射器吸取腹腔液少许,置于洁净载玻片的一边。用另一边缘光滑的载玻片将腹腔液推向另一边,制成薄推片,置室温或37℃温箱干燥。

⑷ 固定：用1%戊二醛固定液固定2—3分钟，用生理盐水冲洗，干燥。

⑸染色:用Wright氏染液染0.5~1分钟后，加双倍量pH7.0~7.2的磷酸盐缓冲液混匀,并注意不要使玻片上的染料干,1~2分钟后以pB缓冲液冲去染液,以滤纸吸干后镜检。

⑹在油镜下观察小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象,随机计数100个巨噬细胞(Mφ)及其中吞噬有鸡血球(CRBC)的巨噬细胞的个数,即为吞噬百分数:

吞噬百分率=100个Mφ中吞噬CRBC的Mφ数×100%

100(Mφ数)

再数此100个Mφ中总共吞噬了多少个CRBC,将此CRBC总数除以100,得出每个Mφ吞噬CRBC的平均数,即为吞噬指数。

[作业与思考题]

1.绘图表示所观察到的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象。

2.计算巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。

3.为什么要在小鼠腹腔内注射6%淀粉肉汤?

4.巨噬细胞除吞噬清除异物外,还有哪些功能?

5.请设计一个试验方案用以检测某一保健品对巨噬细胞吞噬功能的影响。

备注：实验前请仔细阅读〈免疫学实验〉P49-53

实验十、白细胞的体外吞噬试验

[目的要求]

     熟悉和掌握白细胞吞噬功能试验的方法和用途。

【原理】吞噬细胞主要包括血液中的中性粒细胞,巨噬细胞。当细胞或其它颗粒性异物进入机体时,吞噬细胞通过：①辨认异物; ②趋化和接触; ③胞饮或吞噬;④消化排泄等步骤将其杀灭。

【材料】

1.菌液：葡萄球菌菌液5×10⁹/ml，加热100℃15分钟杀死，4℃保存备用。

2.抗凝人全血(用3.8%拘橡酸纳抗凝)。

3.甲醇。

4.快速染液

甲液： 伊红Y                 1.00g

无水磷酸氢二钠         5.00g

磷酸二氢钾             6.25g

蒸馏水              500 ml

乙液:   美蓝                 0.80g

天青I                0.50g

无水磷酸氢二钠       5.00g

磷酸二氢钾           6.25g

蒸馏水              500 ml

将甲乙两液中的磷酸盐先用蒸馏水溶解, 再分别加入染料, 混合溶解后,静置24小时, 即可应用。

5.小试管、载玻片、显微镜等。

【方法】

1.取抗凝血2~3滴于小试管内,用接种环取2~3环葡萄球菌菌液与抗凝血充分混匀,置37℃水箱孵育30分钟。

2.用接种环取出涂片,自然干燥。

3.甲醇固定：滴2滴甲醇液在标本上,待自然挥发至干。

4.快速染色法: 将固定好的标本片放入甲液内染3秒钟, 水洗, 再放入乙液内染2秒钟, 水洗, 待干后镜检。

先用低倍镜找到白细胞,再用油镜观察胞浆内吞噬的细菌。

【结果】

可见中性粒细胞及大单核细胞浆中有许多葡萄球菌。中性粒细胞被染成蓝色,胞核蓝紫色,细菌呈紫色或深红色。

【注意事项】

1.人类白细胞的活动性在37℃时最好,温度过高过低均会使其吞噬能力减低。

2.个体差异、年龄、健康状况的不同,其吞噬能力亦不同。

3.涂血片时不宜太厚,否则不宜观察。

作业：

画图描述所观察到的镜下情况。

附 动物过敏性休克试验

[目的要求]

1、了解Ⅰ型变态反应中动物血清过敏性休克的发病机理。

2、实践“血清过敏性休克”，并观察过敏性休克反应的症状。

3、了解脱敏的方法。

[实验动物]

 小白鼠4只/3组；共12只。

[材料和试剂] 

马血清（1：2），卵蛋白（1：2），肾上腺素，生理盐水

[器具]

1ml无菌注射器及针头4套/3组、解剖手术刀、剪、镊1套/3组，酒精棉球适量。鼠笼1个/3组。

[操作步骤]

1.取4只健康成年小白鼠、分别编号。

2.于1、2、3号小白鼠皮下或腹腔各注射1:2的马血清0.2ml,使其致敏。第4只豚鼠皮下或腹腔注射等量的生理盐水作对照。

3.2~3周后,取1号和4号豚鼠,于心脏内注射马血清1mi。于2号豚鼠心脏内注射等量的卵清蛋白。观察有无超敏反应的发生并作记录。

4.取3号豚鼠,每隔半小时皮下注射马血清0.1ml、0.2ml、0.3m1、0.4ml,于第4次注射半小时后再于心脏内注射马血清1ml,观察有无超敏反应发生,并与1号豚鼠作比较。如有超敏反应,则表现为不安、抓鼻、竖毛、喷嚏、咳嗽, 继而出现大小便失禁、痊孪性跳跃、呼吸困难等,严重者窒息而死。解剖死亡豚鼠可见,肺脏体积明显增大,-表面苍白,呈现明显肺气肿现象。

[注意事项]

1.再次注射变应原时,应作静脉或心脏注射,使变应原直接进入血循环,才能引起明显的休克反应。如采用其他途径注射,可不发生休克反应。

2.一般在初次注射变应原后的2~3周,豚鼠即可达到高敏状态,并维持几个月,在此期间如用相同的变应原再次注射,便可引起休克反应。

[作业与思考题]

1.将结果填入下表,并加以分析:

2、许多动物均可诱发过敏性休克,但为什么常选用豚鼠来做此试验?

3.小剂量、短问隔、连续多次给已致敏的动物注射相应的变应原,可使动物脱敏。试解释其脱敏的机理。

4.如3号豚鼠未发生过敏反应,经一定时间后,再静脉或心脏注射马血清,有无可能发生过敏反应?为什么?

附、酶联免疫吸附试验（演示）

[目的要求]

1、熟悉和掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。

2、学习用酶联免疫吸附试验间接法检测乙型肝炎表面抗原（HbsAg）的方法。

3、了解HbsAg阳性的意义。

[材料和试剂]

⑴抗-HBs：包被用抗体。

⑵辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗- HBs（抗-HBs- HRP）。

⑶ HbsAg：标准阳性对照血清和阴性对照血清，待检血清。

⑷包被液：pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液；

⑸洗涤液：pH7.4、0.01mol/Ltris-HCl缓冲液；

⑹稀释液：pH7.4、0.05mol/L土温-磷酸盐缓冲液；

⑺邻苯二胺（OPD）底物溶液，即pH5.0、磷酸盐-柠檬酸缓冲液。

⑻终止液：2mol/LH₂SO_4。

[器具]

聚苯乙烯微量反应板、微量加样器、带盖搪瓷盘、37℃培养箱、酶标仪、小试管等。