Abstract

According to the national reading investigation of Chinese Institute of Publishing Science, every year we read only 4.5 books per capita, much lower than that in South Korea, France, Japan and Israel. It occurs not only because we do not have the time to read but because we do not have enough libraries. Based on the study of American Library Association, in America, every 10,000 people own a public library. However, the figure is 46times than that in China. Moreover, in Yantai more than 6.4 million people shares only one public library. Having conducted 20 personal interviews and researched many comprehensive secondary sources in both the library and on the Internet, it is found that more public libraries should be built in Yantai.

Outline

Thesis: In Yantai more than 6.4 million people share only one public library. It can not meet Yantai citizens’ need for knowledge and information. Therefore, more public libraries should be built in Yantai.

Ⅰ. The description of the phenomenon that Yantai citizens share one public library Ⅱ. Reasons

A. Financial

B. Cultural

Ⅲ. Influence: It is inconvenient can not meet Yantai citizens’ need

Ⅳ. Suggestions

A. more public libraries for Yantai

B. more fiscal expenditure for public libraries

Ⅴ. Conclusion and Recommendations

A. Conclusion

B. Recommendations

 

第二篇：Abstract

Abstract：Objective To observe the effect of a combination of pyrrolidine dithiocarbonate (PDTC), a specific inhibitor of NF-κB and tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on the apoptosis of gastric cancer cells and their effect on the expression of NF-κB, and to search for the approaches to reversing resistance to TRAIL in human stomach cancer cells. Methods Various concentrations of TRAIL and PDTC were added in exponential growth SGC-7901 gastric cancer cells. MTT assays were used to measure the growth

inhibitory effect of combined use of TRAIL and PDTC or alone. Apoptosis of gastric cancer cell SGC-7901 was analyzed with PI staining method and flow cytometry (FCM). The expression of NF-κB was observed using

immunohistochemical staining method. Results After the SGC-7901 gastric cancer cells were exposed to TRAIL at a dose of 50 μg/L to 500 μg/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rate increased (P< 0.05), but there was no linearity for this dose-effect relationship. Following TRAIL treatment in combination with 0.05 μmol/L and 0.1 μmol/L PDTC, the growth inhibitory rate of and apoptosis rate significantly decreased compared with treatment with TRAIL or PDTC alone (P<0.05), while following TRAIL treatment in combination with PDTC 1 μmol/L and 10 μmol/L, the growth inhibitory rate and apoptosis rates increased compared with treatment with TRAIL or

PDTC alone (P<0.05). The two drugs presented synergistic or added effect on SGC-7901 cells. The expression of NF-κB decreased subsequent to the treatment of PDTC(P< 0.05). Conclusion TRAIL has the effect of growth inhibition and apoptosis induction on SGC-7901 gastric cells to some degree. The NF-κB signal pathway might have a bidirectional effect in apoptosis regulation, and large dose of PDTC could reduce the resistance of TRAIL in SGC-7901 gastric cells.

Key words: tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; pyrrolidine dithiocarbonate; gastric cancer; apoptosis; nuclear transcript factor-κB

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand , TRAIL) 是肿瘤坏死因子家族的成员之一 ,又名Apo2L[1 ]。TRAIL共有5种受体[2]：死亡受体DR4、DR5，诱骗受体DcR1、DcR2，一种调节骨密度的受体(OPG)。核因子-κB(NF-κB)是一种重要的核转录因子 ,参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等多种生理和病理过程。研究表明 ,NF-κ B 在肿瘤的抗凋亡机制中起关键性作用 ,抑制肿瘤细胞 NF-κB的活性将引起肿瘤细胞凋亡 ,从而抑制肿瘤细胞的生长[3]。细胞凋亡的抑制与恶性肿瘤的发生发展以及化疗不敏感有密切关系 ,因此研究胃癌细胞对TRAIL敏感性与NF-κB表达的关系 ,对揭示胃癌细胞对TRAIL的耐药机制可能有重要作用。为此,本研究观察了TRAIL及TRAIL联合NF-κB活性特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)对胃癌细胞株SGC-7901细胞的生长抑制和凋亡诱导,并分析了胃癌细胞对 TRAIL的不同敏感性与NF- κB表达的关系，以期寻找逆转其耐药的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

SGC-7901胃癌细胞引自中国人民解放军第九七医院肿瘤实验室,TRAIL蛋白购自Peprotech公司，PDTC购自Sigma公司, MTT购自 Duchefa公司,二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司,碘化丙啶(PI) 购自Sigma公司,RNA酶购自Faizyme公司,鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体购自Santa Cruz公司,PV-6002 二步法检测试剂盒和DAB显色液购自北京中杉金桥生物有限公司,SEAC全自动酶免系列分析仪购自北京希亚克技术有限公司,流式细胞仪(FCM)购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测肿瘤细胞的生长抑制率

1.2.1.1 TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒作用

细胞以每孔200 μl (2×105个/ml)接种于96孔板，培养24 h后，分别加入TRAIL，使其最终浓度达到0、50、100、200、500 μg/L,每组复设6孔，同时设立不接种细胞的空白对照组。作用48 h后,每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl,继续培养 4 h,弃上清,每孔加入150 μl DMSO,振荡10 h后,酶标仪波长540 nm测其光密度(D)。抑制率=〔1-(D实验组-D空白对照组)/(DTRAIL0-D空白对照组)〕×100%。实验重复3次,取其平均值。

1.2.1.2 应用PDTC后TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901的细胞毒作用

根据所加药物的不同实验分为3组：空白对照组、PDTC组、TRAIL+PDTC组。PDTC组：PDTC按0、0.05、0.1、1、10、50、100 μmol/L给予。TRAIL+PDTC组:PDTC浓度分别取0、0.05、0.1、1、10、100 μmol/L，PDTC每一浓度均分别与TRAIL的浓度0、50、100、200、500 μg/L进行组合，共计30组。实验步骤及抑制率计算同上。

1.2.2 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。

1.2.2.1 应用TRAIL后胃癌细胞的凋亡

细胞以每孔2×105个/ml接种于24孔板中，分别加入0、50、100、200、500 μg/L TRAIL，每组设3个复孔。按试剂盒说明书操作，用FCM检测,记录激发波长488 nm处的红色荧光。

1.2.2.2 应用PDTC后细胞的凋亡

根据所加药物的不同实验分为3组,依次为空白对照组、PDTC组、TRAIL+PDTC组。PDTC组：PDTC按0、0.1、10 μmol/L给予。TRAIL+PDTC组:PDTC浓度分别取0、0.1、10 μmol/L，每一浓度均分别与TRAIL的浓度0、50、100、200、500 μg/L进行组合。实验步骤同上。

1.2.3 免疫细胞化学染色检测NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

1.2.3.1 TRAIL作用后NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

细胞培养后制成细胞密度为1×104/ml的细胞悬液，每孔1 ml接种于24孔培养板中，24 h后换液，分别加入对照液(培养液)、TRAIL(50、100、200、500 μg/L)，继续培养1 h，取出细胞爬片，严格按照PV-6002二步法检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.3.2 PDTC作用后NF-κB p65蛋白在SGC-7901胃癌细胞中的表达

对照组、200 μg/L TRAIL+PDTC 0.1 μmol/L组、200 μg/L TRAIL+ PDTC 10 μmol/L组进行免疫细胞化学染色检测。实验步骤同上。

1.3 统计学处理

用SPSS 13.0软件包进行数据处理，计量资料采用±s表示，多组均数两两比较采用SNK检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌细胞生长抑制率

2.1.1 TRAIL对胃癌细胞生长的影响

TRAIL可抑制SGC-7901胃癌细胞增殖,并随药物浓度增加，细胞杀伤作用也有缓慢提升。100、200、500 μg/L组较对照组有统计意义。但当TRAIL浓度大于200 μg/L时，随浓度增加，细胞抑制率增加不明显。见图1。

2.1.2 TRAIL与PDTC合用对胃癌细胞生长的影响

MTT结果显示单独使用PDTC时，随着浓度的增加，细胞的生长抑制率也增加,不同浓度组进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。联合使用TRAIL和PDTC,当PDTC浓度较低(0.05、0.1 μmol/L)时，两药显示拮抗作用，当PDTC浓度>1 μmol/L时，两药显示相加或协同作用。见表1。表1 不同浓度TRAIL和PDTC单用及联合应用对SGC-7901细胞生长抑制作用的比较(略)

2.2 胃癌细胞凋亡率

2.2.1 TRAIL对胃癌细胞凋亡的影响

TRAIL对胃癌细胞具有凋亡诱导作用，随着TRAIL浓度的增高，细胞的凋亡率也增加。见图2。

2.2.2 TRAIL与PDTC合用对胃癌细胞凋亡的影响

结果与MTT结果相似。单用PDTC时，随着药物浓度的增加，细胞的凋亡率也増加，组间差异有统计学意义(P<0.05)。PDTC浓度为0.1 μmol/L时，两药合用后凋亡率下降，显示拮抗作用;PDTC浓度为10 μmol/L时，两药合用后凋亡率上升，显示相加或协同作用。见表2、图3。表2 不同浓度TRAIL和PDTC单用及联合应用对SGC-7901细胞凋亡作用的比较(略)

2.3.1 TRAIL对SGC-7901细胞NF-κB表达的影响

正常培养条件下，NF-κB p65蛋白主要存在于细胞的胞质中，胞核呈阴性或弱阳性着色。TRAIL作用1 h后可看到p65蛋白在胞核中阳性染色的细胞数增加，且在胞核中的染色加深，而在胞质中的染色则变浅，提示TRAIL能诱导NF-κB p65蛋白向细胞核转移。见图4。

2.3.2 TRAIL联合PDTC对SGC-7901细胞NF-κB表达的影响

应用PDCT预处理30 min后，TRAIL诱导的NF-κB p65蛋白核转位效应被明显抑制，TRAIL联合PDTC组p65蛋白在胞核中染色的强度低于单纯使用TRAIL组。见图5。

3 讨 论

TRAIL可选择性地诱导肿瘤细胞发生凋亡 ,而对正常细胞无明显细胞毒性。从实验中我们观察到

TRAIL对胃癌细胞株SGC-7901具有一定程度的生长抑制和凋亡诱导作用，且这种作用呈剂量依赖性。但

这种量效关系并非线性关系，TRAIL浓度>20 μg/L后，尤其是抑制率增加不明显，当TRAIL浓度达到500 μg/L的较高浓度时,肿瘤细胞的抑制率和凋亡率也不超过30%,提示胃癌细胞对TRAIL具有一定的耐药性。 NF-κB是一种分布和作用都很广泛的核转录因子 ,多种细胞因子都可以引起NF-κB活化，其通常以 p65/p50异二聚体的形式存在 ,也是其主要活性形式[4]。研究发现NF-κB在多种恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤和多数实体肿瘤中发挥关键作用[5]。因此抑制NF-κB活化可望成为肿瘤治疗的一个途径[6]。

PDCT是NF-κB特异性的抑制剂,主要通过抑制NF-κB p65亚单位,或抑制 IκB的降解,减少NF-κB 的核移位来抑制NF-κB的活性[7]。有研究报道，抑制NF-κB活性后,可诱导抗凋亡基因 Livin表达下调,促进肿瘤细胞的凋亡[8]。本研究发现，小剂量PDTC和TRAIL联用后可抑制TRAIL的抗肿瘤作用，表现为细胞的抑制率和凋亡率明显下降，而大剂量的PDTC和TRAIL联用后，细胞的抑制率和凋亡率则明显上升，推测大剂量PDTC可能逆转了胃癌细胞对TRAIL的耐药。这进一步证实了NF-κB的双向调节性。

结合本研究结果和相关研究报道, 我们认为NF-κB有可能成为诱导肿瘤细胞凋亡的分子靶点。通过多种途径调控NF-κB的活性,诱导肿瘤细胞发生凋亡,有可能成为目前肿瘤治疗中的一个较有前景的研究方向,为肿瘤的临床治疗探索一条新的途径。