本 科 生 毕 业 论 文（设计）

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其题目： 特性研究

作 者 姓 名：

专 业 班 级：

刘辉塔 生物工程2005级02班

郑永良 讲师

指 导 教 师：

黄冈师范学院生命科学与工程学院

二00九年五月

郑 重 声 明

本人的毕业论文（设计）是在指导老师 郑永良（讲师）的指导下独立撰写并完成的。毕业论文（设计）没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此产生的各种后果；直至法律责任，并可以通过网络接受公众的查询。特此声明。

毕业论文作者（签名）：

年 月 日

目 录

中文摘要 …………………………………………………………………………………..1 英文摘要（Abstract） …………………………………………………………………….2

1选题背景 ………………………………………………………………………………...3

1.1 生物脱氮研究意义…………………………………………………………………….3

1.2 生物脱氮研究新进展………………………………………………………………….3

1.3与脱氮有关的微生物…………………………………………………………………..4

1.4 我国一些学者对于脱氮菌的研究...…………………………………………….…….5 2 方案论证…………………………………………………………………………………6

2.1生物脱氮作用机制……………………………………………………………………..6

2.2好氧反硝化细菌的筛选方法…………………………………………………………..6

2.2.1选择性培养基………………………………………………………………………...6

2.2.2 间歇曝气驯化法……………………………………………………………………..7

2.2.3 间歇曝气驯化与选择性培养基联合法……………………………………………..7

2.2.4 梯度富集培养法……………………………………………………………………..7

2.3 生物脱氮能力测定方法……………………………………………………………….8

2.3.1 酚二磺酸法………………………………………………………………………......8

2.3.2浓硫酸-水杨酸比色法测定…………………………………………………………..8

2.3.3 Brucine法……………………………………………………………………………..8 3过程论述………………………………………………………………………………….8

3.1 好氧反硝化细菌的筛选与分离……………………………………………………….8

3.1.1实验材料….…………………………………………………………………………..8

3.1.2实验仪器……………………………………………………………………………...9

3.2 实验过程……………………………………………………………………………….9

3.2.1主体结构的设计……………………………………………………………………...9

3.2.2生物量的测定………………………………………………………………………...9

3.2.3 脱氮菌反硝化能力测定方法……….……………………………………………...10

3.2.4 FA1好氧反硝化能力测定过程…………………………………………………….10

3.2.5 好氧条件下FA1反硝化作用能力的研究………………………………………….10

4结果与讨论………………………………………………………………………………11

4.1 脱氮菌的分离筛选…………………………………………………………………...11

4.2 FA1革兰氏染色观察……….……………………………………………………….11

4.3 用Brucine法制得的NO3―标准曲线……………………………………………….11

4.4温度对菌FA1株的反硝化效能影响…………………………………………………12

4.5 pH值对FA1反硝化作用的影响…………………………………………………….12

4.6 不同溶解氧对反硝化能力的影响………….………………………………………..13

4.7 碳源对FA1反硝化速率的影响 …..………………………………………………..14

5总结……………………………………………………………………………………...15 参考文献 …………………………………………………………………………………16 致谢 ………………………………………………………………………………………17

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

刘辉塔

（生命科学与工程学院 生物工程专业 200502班）

摘 要：本文主要进行了脱氮相关细菌的分离培养、脱氮性能研究，为进一步进行脱氮菌群的构效研究打下了基础。首先，从赤壁生活小区污水沟取污泥样品，进行硝化细菌的富集，采用硝化细菌分离培养基分离筛选。用涂平板法获得了8株具硝化能力的细菌，对它们测OD值选出最佳菌株，通过单因素多水平实验考察了培养基组分(包括碳源)以及培养条件(包括溶氧、pH、温度)对该菌的生长和硝化能力的影响，结果表明：32 ℃为菌株反硝化作用较优的温度；pH在7.0-8.0之间，该菌株在此pH条件的除氮效率是较高的；在淀粉与酒石酸钾钠中反硝化速率最好；当摇床转速为150 rpm时，其反硝化能力最强。

关键词：脱氮菌；反硝化；污水处理

第1页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

An Aerobic Denitrification Bacteria Identification

and Characteristic Study

Liu Hui-ta

(Class 200502 Biological Engineering College of Life science and Engineering HNU) Abstract: This thesis relates to isolation and incubation of bacteria and performance studies about denification.It lays the foundation for further structure-activity studies of denitrification bacteria. First of all, get sludge samples from the limber in the Red Cliff biotope and enrich the nitrobacteria by odopting nitrobacteria isolation media to sperate and filter nitrobacteria .Throughof single-eiement and multi-level experiments, acquire 8 bacteria with nitrifying capacity,measure their OD value measured for the best strains

And abserve the influence that medium components (including carbon sources), as well as culture conditions (including dissolved oxygen, pH, temperature) have on the growth and nitrifying capacity of those bacteria.The above result shows that 32℃ is a better temperature for denitrification; 7.0-8.0 is a better pH, the strains in those pH conditions are much more efficient in denitrogenating ;the rate of denitrification is the best in starch and sodium;the denitrification is the most powerful when the shaker is at the speed of 150 rpm. Key words：Denitrification bacteria; Denitrification; Sewage treatment

第2页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

1 选题背景

1.1 生物脱氮研究意义

随着工农业的飞速发展，工业排放的含氮废水，农业施用氮肥的冲淋流失以及城市生活污水的排放，氮污染对生存环境的影响逐渐引起人们的高度重视。据国家环保总局20xx年中国环境状况公报，我国湖库型水源主要污染指标为总氮，由总氮引起的富营养化问题非常突出。水体富营养化是当今我国水环境面临的重大问题，严重地阻碍着我国国民经济的发展[1]。同时化合态氮对人体及动物的毒害作用尤其是致癌作用早为人们所认识，而亚硝酸盐早己是美国规定的优先监测污染物（当饮用水中硝态氮NO3 含量高于l0 mg/L,时就可能导致6个月以下的婴幼儿死亡）。当血中高铁血红蛋－

白的含量达70%，即发生窒息现象。亚硝酸盐与胺作用生成的亚硝胺有致癌、致畸作用。各种水溶解态氮对生态系统的污染及危害目前相当严峻，防治较为困难，如无公害蔬菜基地中硝态氮的控制就比较困难。水体中氮的超标引起的水体富营养化，无论是内陆湖或是沿海都极为严重，对水生生态系统的干扰和危害尤其令人关注。在彻底消除地下水中硝酸盐污染和降低脱硝成本的两个方面，生物反硝化方法是目前己投入实用的最好方法[2]。

脱氮处理在废水处理过程中越来越显示其重要地位。目前生物脱氮己经成为废水中去除氮素污染的最有效的方法之一。但是传统的生物脱氮是通过硝化和反硝化两个过程来完成的，首先氨氮由自养的硝化细菌在好氧条件下转化为硝态氮，然后再通过异养的反硝化细菌在缺氧条件下将硝态氮还原为氮气，排出水体。因此，脱氮过程工艺环节较多，处理成本高，操作控制条件复杂等不足。本研究从土壤中分离好氧反硝化微生物群，并对好氧反硝化菌在不同条件下的脱氮能力进行探究，充分发挥这一新型生物脱氮技术的优势，因而具有很大的研究意义[3]。

1.2 生物脱氮研究新进展

传统的生物脱氮是通过硝化和反硝化两个过程实现的。硝化作用通常被定义为由氨到硝酸的生物氧化过程，硝化是化能自养过程，一般分为两步进行，第一步由亚硝酸细菌将氨氮转化为亚硝酸盐( NO2— )，这一过程称为氨化作用。第二步由硝酸细菌进一步将亚硝酸盐氧化成硝酸盐( NO3— ) 。反硝化菌是异养型兼性厌氧菌。在缺氧的条件下，以硝酸盐氮为电子受体，以有机物为电子供体进行厌氧呼吸。将硝酸盐氮还

第3页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

原为N2或N20,同时降解有机物。污水处理中生物脱氮过程的实现，根据微生物在处理工艺中的存在状态，一般可分为悬浮生长型和附着生长型[4]。相应的反应器为活性淤泥反应器和生物膜反应器。虽然传统的硝化一反硝化工艺在废水脱氮方面起到了一定的作用，仍存在硝化菌群增殖速度慢，水处理过程是N2O的重要排放源之一等问题。最近的研究表明：生物脱氮工艺技术随生物工程、代谢工程、酶工程及相关技术的迅猛发展，得到了较大的发展生物脱氮过程出现了一些超出人们传统认识的新发现。某些微生物在好氧条件下也可以进行反硝化作用。氨氧化也可以在厌氧条件下发生。与传统的细菌厌氧反硝化相比，细菌好氧反硝化有以下几点优势：（l）细菌能在有氧条件下进行反硝化，使得硝化和反硝化能够同时进行。硝化的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸、亚硝酸的积累对硝化反应的抑制，加速硝化一反硝化进程。同时，反硝化释放出的OH— 可部分补偿硝化反应新消耗的碱，能使系统中pH值相对稳定。（2）与传统的化学自养硝化菌不同。这些好氧反硝化菌（同时也是异养硝化菌）可将氨在好氧条件下直接转化成气态产物，且反应可由单一反应器一步完成。这降低了操作难度，大大降低了投资费用和运行成本。（3）大部分好氧反硝化菌同时也是异养硝化菌，这使它们能够很好的适应厌氧(或缺氧)周期变化。在有氧/缺氧交错时具有生态的生长优势。其生长速率快，细菌产量高，要求的溶解氧浓度较低，能够在偏酸性的环境中生长。（4）与真菌好氧反硝化相比，培养反硝化细菌的投资少，细菌比较廉价。因而适合治理大面积氮污染水，且具有反应速度快，反硝化彻底的优点。好氧反硝化和厌氧氨氧化为水处理工作者设计处理工艺提供新的理论和思路[5]。

1.3 与脱氮有关的微生物

脱氮细菌在自然界中广泛存在，据报道，约有23个属的细菌具有脱氮作用的能力，包括了13个已经确证的或有广泛记录的细菌属[7]。已报告在棒状杆菌属、黄单胞菌属、不动细菌属和葡萄菌属中存在着反硝化细菌的菌株，其中大部分还没有肯定的分类归属。Jeter和Ingraham（1981）编辑了更为完整的目录，并包括了对色杆菌属、噬细胞菌属、奈瑟氏菌属、西蒙斯氏菌属、硫小螺菌属和热丝状菌属的反硝化细菌种的讨论。与Ha11所编撰的能把N03— 异化还原为NO2— 的73个细菌属的目录相比较，反硝化作用则似乎只有相对有限的代谢能力。对Payne（1976）以及Focht和Verstraete（1977）以前所编辑的材料最明显的增补是根瘤菌属、黄杆菌属和农杆菌属（Zablotowicz等，1978；Pichinoty等，1976，1977）。一种表观上具有微需氧反硝化能力的磁性螺菌的

第4页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

原始报道也是令人感到有兴趣的[8]。

1.4 我国一些学者对于脱氮菌的研究

进入21世纪，人们在研究任何问题时，不再只是把其中的理论知识弄透彻，知道其所以然，更重要的是如何将这一理论知识运用于实践，给人们的生活、工作生产和学习带来益处、增加价值，从而推动人类的不断进步。国内一些专家学者在研究微生物脱氮时，多是想如何将这一脱氮技术运用于工业如污水处理过程中。但是如此的前提是寻找一种或几种脱氮菌并使其在最适合的条件下达到最高的脱氮效率，这样才能带来最大的工业效益，发挥其最高价值[9]。

刘晶晶、汪苹、王欢在《一株异养硝化一好氧反硝化茵的脱氮性能研究》中就是选用四因素三水平k(3/4)正交试验表设计实验，通过测定对硝酸盐氮和TIN的去除能力，研究碳源、碳氮比(P(COD)/p(N)、溶解氧含量(p(DO))以及pH4种不同因素对一株恶臭假单胞菌好氧反硝化性能的影响。同时又对该菌株的异养硝化能力进行了测定发现。该菌株自身可实现同步硝化反硝化，其对氨氮的去除率可达60.9l%，即该菌株可以独立完成生物脱氮的全部过程。

真菌和细菌反硝化具有一定的协同作用。李平、张山、郑永良等在《反硝化真菌—细菌优化组合及其脱氮能力研究》就是从多种真菌中筛选到3株脱氮活性较高的真菌，并将其与新筛选分离到的另一株具有较强脱氮能力的细菌进行混和培养，通过正交实验确立其最佳培养条件。正交实验方差分析表明：碳源、pH 值和温度3个因素对脱氮率的影响都非常显著，菌种因素对脱氮率有一定影响。细菌和真菌的组合优于单菌。在最佳培养条件下，该组合能在21h内去除10 mmol NO3—。优于相同条件下细菌或真菌的反硝化能力，且对NO3— 去除达95%以上，并且在反应过程中几乎没有 NO2— 的积累。

但这些学者甚至是一些研究机构能够做的或已经做的是寻求到了一种或几种菌当其在实验室条件或者小规模培养条件下能高效的去除水中的硝酸根离子。然而任何一种技术如果只是这样是远远不够的，那样就达不到为人类造福的目的，我们所追求的是如何将其运用于生产实践，如何帮我们解决现实中的问题，真正的为我们所用。而这也是我们研究脱氮菌所遇到的问题，优秀的菌种已经找到了，但是如何将其用到工业中的污水处理之中呢？因为实验室条件或者小规模培养条件我们很容易创造，但是大规模的污水处理厂要想达到这种条件有时是根本不可能或者是即使是达到了却

第5页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

也是相当困难而毫无实际价值可言的。如何解决这些问题有待于我们以后的研究[6]。 2 方案论证

2.1 生物的脱氮作用机制

脱氮作用是通过微生物的活动，将硝酸盐或亚硝酸盐还原为气态分子氮或气态氮氧化物的过程。大多数微生物学家认为，脱氮作用是存在于有限的一些微生物属中的一个呼吸过程。在该过程中N的氧化物可作为呼吸作用电子传递的末端电子受体，这种电子传递将底物提供的一个“还原”电子通过许多电子载体传递到一个氧化性更强的N氧化物上[10]。在电子传递到至少几种N氧化物的过程中，能量就通过电子传递的磷酸化作用而被保存下来。在脱氮细菌把NO3— 或NO2— 还原为N2和（或）N2O时，它可以在缺乏分子态氧的条件下生长。只能还原为气体产物（主要是N2和N2O）的阴离子的还原作用和产生的气体的数量都具有一些使脱氮作用有别于其它类型的微生物N代谢的特点[11]。参与这一过程的脱氮菌按营养类型可分为两大类。即异养菌(heterotrop hiciacteria)和自养菌(autotrop hic bacteria) 异养型脱氮菌需要添加甲醇、乙醇、葡萄糖、聚一羟丁酸甚至甲烷等有机质并达到合适的碳氮比(C/N)才能正常生长和发挥脱氮功能。合适的C/N可通过化学反应平衡式求出。但在实际操作过程中，C/N一般都要求大于理论计算值。如以甲烷为碳源的C/N不是2.47 而是3.0。自养菌的生长不需要外界提供有机碳源，而是通过氧化氢气、还原性硫化物等取得能量。并利用这些能量将环境中的一氧化碳、重碳酸盐等转化为细胞物质，与此同时进行反硝化起到脱氮的效果[12]。

2.2 好氧反硝化细菌的筛选方法

因为好氧反硝化菌生长条件没有特殊要求，相同环境中许多菌可与它竞争，故筛选效率不高，再加上自然界中好氧反硝化细菌很少，故采用一般筛菌方法不易将其筛选出来[13]，己报道的一些筛选思路和方法主要有以下几种：

2.2.1 选择性培养基

于爱茸，李尤等利用溴麝香草酚蓝(Bromothymol blue，BTB)培养基从鱼塘中筛选获得一株高效的有氧反硝化菌，经初步鉴定为芽孢杆菌，除氮率达97%。张玉芹等利用Grimy培养基筛选获得45株好氧反硝化菌。项慕飞等利用BTB培养基从序批式活性污泥法反应器活性污泥中筛选获得两株好氧反硝化菌，在4d内，它们的总氮(Total

第6页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

nitrogen，TN)去除率都在70%以上。龙雯等利用BTB培养基筛选获得一株高效的有氧反硝化茵，初步鉴定为丛毛单胞菌属(Comamonas sp)的睾丸酮假单胞菌(Comamonas testosteroni)。

2.2.2 间歇曝气驯化法

Robetson等根据养泛养球硫小菌(Thiosphaerapantotropha)既能自养又能异养，既可以在好氧条件下又能在缺氧条件下生长，缺氧时可利用硫化物作供能物质，也可利用有机质这一性质。通过好氧、缺氧环境频繁转换，缺氧环境下有机质和硫化物共存等条件的转换，而使得该菌在与其他菌的竞争中成为优势菌。周丹丹等采用间歇曝气对污泥进行驯化[15]，筛选获得好氧反硝化细菌。

2.2.3 间歇曝气驯化与选择性培养基联合法

首先利用间歇曝气驯化法使反硝化菌由劣势菌成为优势菌，再利用选择培养基进一步筛选，从而获得好氧反硝化菌，该方法有利于分离与纯化。孔庆鑫等采用间歇曝气富集，氰化钾选择培养基筛选获得一株好氧反硝化菌[9]，该菌株在5 d内可将硝态氮由282.0 mg/L降解至149.2 mg/L，经初步鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp)。

2.2.4 梯度富集培养法

在一定溶氧条件下，利用硝酸盐为唯一氮源的培养基进行梯度富集培养好氧反硝化菌，从而将劣势菌成为优势菌，且该方法简单，易操作。李平等从武汉市郊稻田土壤中分离获得一株好氧反硝化细菌，初步鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。周立祥，黄峰源，王世梅以硝酸钾为唯一氮源的硝酸柠檬酸反硝化液体培养基，在28℃、180 rpm条件下，培养1周，获得两株好氧反硝化菌，初步鉴定为假单胞菌属(Pseu lomonas sp.)。张光亚等也利用该方法从土壤中分离出一株好氧反硝化菌，该菌株与鲑色诺卡氏菌桔橙变种(Rhodococcus ruber)的16 SrDNA序列具有99％相似性。马放刚等利用该方法从驯化污泥中筛选出在好氧条件下具有良好的反硝化作用的细菌，该菌初步命名为球形假单胞菌变种(Pseudomonas chloritidismutans)。

2.3 生物脱氮能力测定方法

2.3.1 酚二磺酸法

采用酚二磺酸显色法[14]，并做适当改良，具体如下：样品离心除菌(5000 r/min,5 min)，取l mL上清于瓷蒸发皿，1000℃加热蒸干样品(切勿使样品炭化)，加l mL的酚二磺酸于蒸发皿，玻棒研磨150次(1~2 min)，加蒸馏水10 mL，加3~5 mL新鲜氨水，

第7页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

玻棒搅拌显色：加水定容至50 mL，用721型分光光度计测定410 nm处的OD值，再换算成为在一定时间所消耗掉NO3— 的浓度（mM），来判定所测单个或组合菌的反硝化能力。

2.3.2 浓硫酸-水杨酸比色法

浓硫酸-水杨酸比色法[15]基本原理：在浓酸条件下，NO3— 与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨酸在碱性条件下(pH>12)呈黄色，最大吸收峰的波长为410 nm，在一定范围内，其颜色的深浅与含量成正比，可直接比色测定。具体方法为:确吸取1 mL 培养液于1.5 mL离心管中，在6000 r/min、10 min条件下离心，准确吸取0.1 mL上清液于25 mL试管中，再加入0.4 mL显色剂并摇匀，室温放置20 min，缓慢加入2 M NaOH 9.5 mL冷却至室温，于410 nm下测定吸光值，空白样含100 μL去离子水，NO3— 的浓度根据标准曲线进行计算，并计算样品中实际NO3— 的含量，同时可测定反硝化能力。

2.3.3 Brucine法

用Brucine法检测剩余液体中的NO3— 浓度，并根据标准曲线推算其NO3— 的浓度，计算样品中实际( NO3— )的含量，从而判断该菌的脱氮能力。

3 过程论述

3.1 实验材料与仪器

3.1.1 实验材料

（1）样品：赤壁生活小区污水沟

（2）无机盐培养基（D培养基）：KH2PO4 0.5g，K2HPO4 1.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5g，1.5 mL痕量元素溶液（CaSO4·5H2O 0.4 g，FeSO4·7H2O 0.7 g，FeCl3·6H2O 7.0 g，CoCl3·6H2O 0.2 g，NaMO4·2H2O 3.4 g，CaCl2·2H2O 2.0 g，加自来水至1L,调pH为7.0），加水至1 L，调 pH为7.2。

（3）LB培养基（活化培养基、菌种保藏培养基）：酵母膏5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g加水至1 L，pH为7.0 。根据实验要求在LB培养基中添加一定量NaNO3，以制成富含硝态氮的培养基。

（4）甘油、无水乙醇、甲醇等药品。

第8页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

3.1.2 实验仪器

HWY-1102C型恒温振荡器、SPX-150B-Z型生化培养箱、722型分光光度计、超净工作台、高压蒸气灭菌锅等。

3.2实验过程

3.2.1 好氧反硝化细菌的筛选与分离

从赤壁生活小区污水沟取样品，洗样后称取1克新鲜污泥，留上清。

（1）梯度富集培养 将污泥样品10g转入装有100 mL D培养基的500 mL锥形瓶中，棉塞塞口，30℃恒温静至培养3-4天，待培养基浑浊，取5 ml菌悬液于装100 mL新鲜D的100 mL锥形瓶中培养，重复操作3-4次，注意D培养基中硝酸根离子浓度从50 mg/L至300 mg/L，取最后一次富集夜涂选择性平板；将最后筛选的锥形瓶置4℃冰箱，待用。

（2）分离纯化 从最后得到的菌悬液中取20 μL 于LB培养基平板上涂布。置30℃恒温下培养2-4天，等长出明显菌落，用接种环挑取不同形态单菌落于新鲜的LB中振摇过夜（30℃）。待菌悬液浑浊后，涂布于LB培养基平板上，至长出菌落后，再挑取菌落培养，重复操作。

3.2.2 生物量的测定

（1）基本原理：采用比浊法测定[16]。基本原理为当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度同光密度成正比，同透光度成反比，而密度或透光度可以由光电池精确测出。

（2）方法的使用范围[17]：如果滤液在某个波长下的吸收值比较固定，则可以用浊度法测其生物量。对于含有固体颗粒，有色素产生，有絮凝物质产生的体系不能使用。

（3）测定过程：挑取八个形状各异的单菌落分别转入新鲜的10 mL 的LB中振摇过夜（30℃）。把上述对数生长期的菌液进行适当的稀释，在600 nm 处以去离子水为参比，分别测其吸光度。根据吸光度获得一株最佳脱氮菌株。

3.2.3 脱氮菌反硝化能力测定方法

（1）标准曲线的绘制 将250 mg/L ( NO3— )标准液分别配制25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、125mg/L、200 mg/L、250 mg/L的( NO3— )溶液。分别取上述溶液100加入25 mL试管中，室温放置20 min，缓慢加入2 M NaOH 9.5 mL，冷却至室温，于600 nm

第9页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

下测定吸光值，空白样含100 μL去离子水。

（2）Brucine法检测 用Brucine法检测剩余液体中的NO3— 浓度，并根据标准曲线推算其NO3— 的浓度，计算样品中实际( NO3— )的含量，从而判断该菌的脱氮能力。具体过程为：

（I）取100 μL待测样品，8000 rpm室温离心5 min；

（II）取上清，加入50 μL 4%的二甲氧基马钱子碱（用氯仿溶V:M），振荡混匀，室温反应5 min；

（III）加入500 μL 80%的H2SO4，混匀避光反应10 min；

（IV）加水定容至4 mL，用721型分光光度计测OD600值；

（V）根据标准曲线推算其NO3 的浓度。并计算样品中实际( NO3)的含量。 ——

（3）硝化速率 单位时间内( NO3— )的去除率表示反硝化速率，速率大小即为反硝化能力。

3.2.4 FA1好氧反硝化能力测定过程

从纯的D培养基平板中挑取单菌落于LB中前培养，30℃培养过夜，取菌悬液于培养基中，置30℃恒温，100 rpm平板中挑取单菌落与LB中前培养，30℃培养过夜，取菌悬液于培养基中，置30℃恒温，100 rpm振荡培养，测定培养基中剩余的NO3浓度，计算其反硝化率。

3.2.5 好氧条件下FA1反硝化作用能力的研究

(1) 温度对菌FA1株的反硝化效能影响 本实验通过恒温箱设置了20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五个不同的温度条件，培养24 h之后，找出温度与好氧反硝化菌反硝化效率的关系。

(2) pH值对FA1反硝化作用的影响 实验中采用不同初始pH值的培养基该菌进行处理，24h后测定硝酸盐的去除率。

(3)不同溶氧[18]对反硝化能力的影响 菌株在一定溶氧范围内随溶氧的增加其反硝化能力也随之增强，当溶氧超过某个范同时其反硝化能力会下降。据文献报道，对于反硝化菌而言，氧气的存在之所以对反硝化过程有抑制作用，并不是由于氧气对反硝化菌本身有抑制作用，而是因为电子受体( O2、NO3— 和NO3— )之间争夺电子的能力存在差异，通常O2接受电子的能力高于NO3，在溶氧较高的件下，反硝化菌虽未受到抑制，但NO3— 不易得到电子供体(有机物)，因此也难以被还原成N2。在水产养殖中，尤其是鱼类，需要持续不断的充氧来保证鱼类氧的供给，水中的溶解氧最低应

第10页 共17页 ——

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

保持在3 mg/L，一般保持在4-8 mg/L之间。

(4) 碳源对FA1反硝化速率[19]的影响 FA1在以KNO3(质量浓度0.2%)为氮源，碳源分别为(质量浓度2%)的酒石酸钾钠、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、甘露糖、果糖的脱氮实验培养基中培养。

4 结果与讨论

4.1 脱氮菌的分离筛选

表1 筛选到的八株菌的OD值

Table 1 Screening of the eight strains of OD values

菌株名称 OD

FA1 0.39

FA2 0.35

FA3 0.28

FA4 0.27

FA5 0.19

FA6 0.36

FA7 0.21

FA8 0.33

结果表明，这8株菌对NO3— 均有不同程度的降解作用。分别命名为FA1 、FA2、FA3、FA4 、FA5 、FA6、FA7 、FA8共8株菌株，其各自OD值如表所示，选取OD值最高的FA1作为试验菌株。

4.2 FA1革兰氏染色观察

形态观察表明，FA1被染成紫色，有芽孢，呈杆状，初步鉴定为革兰氏阳性菌 （G+菌）。

图 1 FA1革兰氏染色观察 Fig.1 FA1 Gram staining

4.3 用Brucine法制得的NO3— 标准曲线

以NO3－

浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标作图，即为标准曲线，其方程为：

第11页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

y=1.0482x-0.0003，其相关系数R2=0.9963(如图2所示)。可以用于以后试验中硝酸盐浓度和硝化强度的计算。

―

图 2 NO3标准曲线 Fig.2 NO3― Standard curve

4.4 温度对菌FA1株的反硝化效能影响

从图可见，其他条件相同，温度低于32℃时，温度越高，降解速率越大；高于32℃时，降解速率反而下降。表明32℃为菌株反硝化作用较优的温度。实际上温度既是影响生物活性的重要因素，又是生态环境的重要因素。

图 3 温度对对菌FA1株的反硝化效能影响

Fig.3 FA1 temperature bacteria strains against the effects of denitrification performance

第12页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

4.5 pH值对FA1反硝化作用的影响

实验中采用不同初始pH值的人工废水，该菌进行处理，24 h后测定硝酸盐的去除率。反应时间相同，以pH为7.0-7.5 时硝酸盐的降解率最大，说明此菌的代谢是以中性和微碱性条件为好，反应液的pH值影响菌株反硝化作用。pH值可能直接影响酶的活性，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物酶的适应范围，微生物对营养物质的吸收和酶的活力都相受到影响，因此，水质生物降解过程中介质pH的控制就很重要。芽孢杆菌进行水质生物处理时，pH小于6.5或大于8.5时酶的活性显著下降，以7.0-7.5为佳。自然水质的pH一般在7.0-8.0之间，该菌株在此pH条件的除氮效率是较高的。

图 4 pH值对FA1反硝化作用的影响

Fig.4 pH values of FA1 the impact of denitrification

4.6 不同溶解氧对反硝化能力的影响

从图中可以看出，当摇床转速为150 rpm时，FA1反硝化能力最强。150 rpm摇床条件可以满足溶氧DO为5-7 mg/L。该株菌在一定溶氧范围内随溶氧的增加其反硝化能力也随之增强，当溶氧超过某个范同时其反硝化能力会下降。据文献报道，对于反硝化菌而言，氧气的存在之所以对反硝化过程有抑制作用，并不是由于氧气对反硝化菌本身有抑制作用，而是因为电子受体( O2，NO3 )之间争夺电子的能力存在差异，

—

通常O2接受电子的能力高于NO3—，在溶氧较高的件下，反硝化菌虽未受到抑制，但NO3— 不易得到电子供体(有机物)，因此也难以被还原成N2。在水产养殖中，尤其是鱼类，需要持续不断的充氧来保证鱼类氧的供给，水中的溶解氧最低应保持在3 mg/L，

第13页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

一般保持在4~8 mg/L之间。此时FA1反硝化能力最强，可以满足实际要求。

图5 不同溶解氧对反硝化能力的影响

Fig.5 different dissolved oxygen on the denitrification capacity of the

4.7 碳源对FA1反硝化速率的影响

FA1在以KN03（质量浓度0．2%）为氮源，碳源分别为（质量浓度2％）的酒石酸钾钠、乙酸钠、蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、甘露糖、果糖的脱氮实验培养基中培养。由图可知，在不同碳源底物中的反硝化速率不一样，在乙酸钠中反硝化速率最低。只有5 mg/（L·d），在蔗糖、葡萄糖、果糖中反硝化速率未见明显差异，在淀粉与酒石酸钾钠中反硝化速率最好，达到了144 mg/（L·d）左右。这可能是因为FA1在进行反硝化作用时，不同碳源本身在氧化还原中位置会对反硝化作用产生影响。如果FA1进行污水处理时，污水中含有较高的淀粉，FA1就能更好发挥除氮功能。

第14页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

图 6 不同碳源对FA1反硝化速率的影响

A.酒石酸钾钠；B.乙酸钠;C.蔗糖；D.淀粉；E.乳糖；F.甘露糖；G.果糖；H.葡萄糖

Fig.6 FA1 different carbon sources on denitrification rate

A. K-Na tartrate; B. Sodium;C. sugar; D. starch; E. lactose; F. mannose; G .fructose; H. glucose 5 总结

通过测菌株OD600值选择了一株脱氮效率最高的菌种,然后单因素实验考察了培养基组分(包括氮源、碳源)以及培养条件(包括溶氧、pH、温度)对该菌的生长和硝化能力的影响。主要的研究结果如下：

（1）本研究从生活小区污水沟污泥中分离到一株以NO3— 为唯一氮源生长的菌株FA1，形态观察表明，FA1被染成紫色，有芽孢，呈杆状，初步鉴定为革兰氏阳性菌（G+菌）。

（2）32℃为菌株反硝化作用较优的温度。

（3）该菌株在此pH为7.0-8.0的条件下除氮效率是较高的。

（4）在淀粉与酒石酸钾钠中反硝化速率最好。

（5）当摇床转速为150 rpm时，FA1反硝化能力最强。

本研究旨在分离筛选出一株或几株能高效降解NO3— 菌株，通过进一步的研究，初步了解和认识该菌株及其生长、脱氮特性，主要探究了其脱氮最优条件，在实践应用中有一定的意义。

第15页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

参考文献

[1] 王欢,汪苹,张海波.一株戴尔福特菌的异养硝化与好氧反硝化性能研究[J].北京工商大学学报(自然科学

版),2008,14(2):56-58.

[2] 吴松维,孙华,吴伟祥.好氧反硝化特性的研究进展[J].科技通报,2008,18(5):34-36.

[3] 汪苹,项慕飞,翟茜.从不同反应器筛选、鉴别好氧反硝化菌[J].环境科学研究,2007,20(4):120-124.

[4] 马放,王弘宇,周丹丹,等.好氧反硝化菌株X31的反硝化特性[J].华南理工大学学报,2005,33(7):26-28.

[5] 曲秀花,叶明亮,杨明庆,等.双波长光度法测定水中硝酸盐[J].光谱实室,1999,16(4)13-15.

[6] 徐亚同.挥发性脂肪酸碳源生物反硝化研究[J].华东师范大学学报(自然科学版) ,1995 ,11(2) :33-35.

[7] 张燕,陈英旭,刘宏远.地下水硝酸盐污染的控制对策及去除技术[J].农业环境保护,2002,21(2):110-112.

[8] 刘玲花.饮用水中硝酸盐去除方法的比较[J].环境科学,1993,14(2):33-35.

[9] 徐伯兴.生物膜电极法在废水处理中的应用[J].污染防治技术,1998, 11(1):45-47.

[10] 邱凌峰.电极生物膜法反硝化作用初探[J].福建环境,1999,16(6):21-23.

[11] 李国华,吴雯卿,姜丽民.紫外光度法测定生活饮用水中硝酸盐的可行性[J].中华预防医学杂志,1996,30(1):43-44.

[12] 符艳宏.紫外吸光光度法测定水源水中硝酸盐[J].理化检验(化学分册) ,2000 ,36 (6) :27-29.

[13] 邵友元, Krzysztof W Szewczyk ,黄光斗,等.应用于序半连续式反应器工艺的硝化和反硝化动力学研究[J].化工

环保,2004,24(8):37-39.

[14] Luduing-Muller J, Vertocnik A, Town CD. Analysis of Inddes-butyic Acid-induced Adventitious Root Formation on

Arabidopsis stems segments [J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(16):2095-2105.

[15] Shimoishi Y M, Yata H. Some N - alkyl - naphthylazopyridinium salts as new reagents for the

spectrophotometricdetermination of anionic surfactants [J]. FreseniusAnalChem, 1993,345 (6):456- 461.

[16] 袁挺侠,朱健.酚二磺酸法测定水中的硝酸盐氮中有关问题的探讨[J].陕西环境,2000,7(1): 28-30.

[17] 冯叶成,王建龙.生物脱氮新工艺进展[J].微生物学通报,2001,15(4): 88-91.

[18] 范彬,黄霞.化学反硝化法脱除地下水中的硝酸盐[J].中国给水排水,2001,17(11):27-31.

[19] 吕锡武,李峰,稻森悠平.氨氮废水处理过程中的好氧反硝化研究[J].中国给水排水,2001,26(4):141-201.

第16页 共17页

一株好氧脱氮菌的筛选鉴定及其特性研究

致 谢

首先要感谢的是我的导师郑永良博士。本论文能够顺利完成，离不开郑老师的悉心指导和严格要求，郑老师在论文的选题、研究理论、框架结构、数据整理，直至撰写、修改和定稿等各个环节均严格把关，并投入了大量的时间和精力。郑老师治学严谨，学识渊博，为我营造了一种良好的研究氛围。在跟随郑老师学习的过程中，我不仅掌握了全新而实用的学术思想和研究方法，也领会了许多待人接物与为人处世的道理。郑老师严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力，令人如沐春风，倍感温馨。

也感谢黄冈师范学院生命科学与工程院提供了如此优秀的师资力量和办学条件，钟玉林、程水明等老师所提供的无私关怀和教导，他们的付出以及生科院良好的教风、学风、研究氛围是我顺利完成四年学业的保证。

同时还要感谢蔡成平、方朝东、周维等同学在毕业实验过程中给予的帮助与指导，经常一起分析、讨论、解决问题。

感谢我的大学同学，四年来共同奋斗、相互关心、帮助与鼓励的日子让我永远难忘。

总之，大学期间得到各方无尽的支持与帮助，在此难以一一言表，再一次向所有曾经关心、支持和帮助过我的人们表示最真挚的感谢！

第17页 共17页