辽宁石油化工大学  计算机与通信工程学院 教案

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第二篇：辽宁石油化工大学环境与生物工程学院

辽宁石油化工大学环境与生物工程学院

细胞工程概论教案

2005-2006 学年第二学期

学 生 专业 及 年级：生工0301 主讲教师姓名及职称：姜虎生 必 读 参 考 书： 植物细胞工程 朱至清

动物细胞工程 徐永华

课程总学时数 16

本学期总学时数 本学期上课周数 16

平均每周学时数 1

课 程 性 质 选修课 本学期学时分配

讲课 16

实验等

测验

2

绪 论

【课时安排】

1.1 细胞工程在生物技术领域中的地位 1学时

1.2 细胞工程的发展 1学时

总计 2学时

【掌握内容】

1. 基本概念：生物技术定义、细胞工程。

2. 细胞工程的发展。

【了解内容】

1. 了解细胞工程与现代生物技术的关系；了解细胞工程的发展与相关学科的联系；了解细胞工程在现代世界经济中的潜力.

2. 生物技术的内涵。

3. 生物技术对经济社会发展的影响。

【教学难点】

1. 生物技术对经济社会发展的影响。

2.。基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程含义及相互关系。

【教学目标】

1. 掌握生物技术定义、细胞工程基本概念。

2. 能对几对重要概念进行辨析。

3. 能了解现代生物技术及细胞工程发展历史。

第一节 细胞工程在生物技术领域中的地位

生物技术被世界各国视为一项高新技术。细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，及通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。

一、生物技术概述

1.生物技术定义:是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结合进行产品加工生产的综合性技术体系。

解释先进的工程技术手段、改造生物体、生物原料、为人类生产出所需的产品、达到某种目的。

2.生物技术的内涵主要是：

1）运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品种；

2）工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品；

3）模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品；

4）发展相应的科学理论与工程技术。主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。

3.现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。

4.生物技术发展历程。

4.1传统生物技术的发展

4.2 现代生物技术的发展

5. 生物技术涉及的学科

它以包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎所有生物科学的次级学科为支撑，又结合了诸如化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学等生物学领域之外的尖端基础学科，从而形成一门多学科互相渗透的综合性学科.

概括地说，生物技术相关的行业可分为七大类型（表1-2）。

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6.生物技术对经济社会发展的影响

6．1 改善农业生产、解决食品短缺

6．1．1 提高农作物产量及其品质

（1）培育抗逆的作物优良品系

（2）植物种苗的工厂化生产

（3）提高粮食品质

（4）生物固氮，减少化肥使用量

6．1．2 发展畜牧业生产

6．2 提高生命质量，延长人类寿命

医药生物技术是生物技术领域中最活跃，产业发展最迅速，效益最显著的领域。其投资比例（图1－3）及产品市场（表1-3）均占生物技术领域的首位。

6.2．1 开发制造奇特而又贵重的新型药品

6．2．2 疾病的预防和诊断

6．2．3 基因治疗

6．2．4 人类基因组计划（HGP）

6．3．3 解决能源危机、治理环境污染

6．3．3．1 解决能源危机

6．3．3．2 环境保护

4

6．3．4 制造工业原料、生产贵重金属

6．3．4．1 制造工业原料

6．3．4．2 生产贵重金属

二、细胞工程的概念及研究范畴

1.细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法或技术，在细胞整体水平和细胞器水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的一门综合性科学技术。

2.研究范畴 根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。

3. 细胞工程的优势：避免了分离、提纯、煎切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。

第二节 细胞工程的发展

一、动物物细胞工程的发展

1．融合现象的发现

2. 动物组织细胞培养技术的建立

3. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生

4. 动物克隆技术的建立

二、植物细胞工程的发展

1．探索阶段

2．培养技术建立阶段

3．应用研究阶段

三细胞工程的基础知识与基本技术

1 基础知识

1. 1细胞的特性

1.1.1培养细胞的形态

1.1.2 培养细胞的生长方式和类型

贴壁型生长细胞

悬浮型生长细胞

2 基本操作

2．1 无菌操作技术

2．2 细胞培养技术

2．3 细胞融合技术

思考题

1．细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。

2．动物细胞工程发展的主要标志性阶段。

3．植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。

4．植物细胞工程的作用与应用领域。

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第一部分 植物细胞工程

第一章 细胞全能性及其表达

【课时安排】

1.1 概念 10分钟

1.2 细胞分化和脱分化 20分钟

1.3 器官发生 10分钟

1.4 体细胞胚胎发生 20分钟

1.5 植物组织培养 40分钟

总计 2学时

【掌握内容】

1. 基本概念：全能性、细胞脱分化、胚状体、器官发生。

2. 细胞的脱分化过程

3. 离体培养中器官发生的方式

4. 器官分化过程

5. 体细胞胚的形成

6. 植物组织培养过程

【了解内容】

1. 植物细胞分类。

2.细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化

3.分析各种因素对器官的分化的影响。

4. 影响体细胞胚发生的因素

【教学难点】

1. 离体培养中器官发生的方式。

2. 细胞的脱分化和再分化。

【教学目标】

1. 掌握相关基本概念并能对几对重要概念进行辨析。

2. 对分化、再分化、器官分化、体细胞胚的形成有全面深入的了解。

3. 植物组织培养过程。

【教学内容】

一.概念：一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。 植物细胞可分为三类：

第一类是茎尖、根尖及形成层细胞

第二类是筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞

第三类是表皮细胞及各种薄壁细胞

分析各类细胞特点并加以区分。

二、细胞分化 是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

时间上的分化：

空间上的分化：

三、细胞脱分化 在培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。

3.1细胞的脱分化过程可分为三个阶段：

第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；

第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；

第三阶段为终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。

3.2细胞脱分化过程中生理活动与细胞结构的变化

脱分化过程中细胞结构会发生急剧变化。这些变化总体上包括：细胞质显著变浓，大液泡消失， 6

核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。

四、器官发生 植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

4.1、离体培养中器官发生的方式

通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式：

第一种方式是先芽后根

第二种方式为先根后芽

第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。

4.2、器官分化过程

第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。

第二阶段是“生长中心”形成。当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，通常称之为“生长中心”，也称为拟分生组织，它们是愈伤组织中形成器官的部位。

第三阶段是器官原基及器官形成。

在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基。这一途径有两种情况：一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养；另一种情况是外植体某些部位的细胞，在重新分裂后直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。

分析各种因素对器官的分化的影响。

不同外植体类型对器官的分化是影响的。

激素对器官分化的调控：

光照对器官分化的影响：

五、体细胞胚胎发生

胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。

这一定义有以下几方面的界定：

其一，与无融合生殖胚不同，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用。 其二，与合子胚不同，体细胞胚起源于非合子细胞。

其三，与离体培养中器官发生形成个体的途径不同，她经过了胚胎发育过程。

5.1、体细胞胚的形成

1）从外植体上直接发生

在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段：

第一个阶段为诱导期。

第二个阶段是胚胎发育期。

2）经过愈伤组织的体细胞胚发生

第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织。

第二阶段是诱导愈伤组织胚性化；

第三阶段是体细胞胚形成。

3）细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生

1.5.2、影响体细胞胚发生的因素

1）外源激素对体细胞胚胎发生的调控

2）培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响

3）不同基因型间体细胞胚形成能力的差异

六植物组织培养

介绍组织培养概念、发展历史、现状、意义。

进行植物组织培养，一般要经历以下5个阶段：

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1 预备阶段

（1）选择合适的外植体是本阶段的首要问题

（2）除去病原菌及杂菌

对外植体除菌的一般程序如下：

外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。然后制备：

（3）配制适宜的培养基 由于物种的不同，外植体的差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：①含量丰富的基本成分②微量无机物③微量有机物

2诱导去分化阶段

3 继代增殖阶段

4 生根成芽阶段

5 移栽成活阶段

思考题

1．细胞学说与细胞全能性的概念。

2．细胞分化的阶段及细胞结构的变化。

3．真核生物细胞周期调控的分子机理。

5．离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。

6．器官发生的影响因素及调控机理。

7．体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。

8．影响体细胞胚形成的因素及调控。

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第二章 植物细胞培养和次生代谢物的生产

【课时安排】

1.1 单细胞培养技术 30分钟

1.2 次生代谢物的生产 30分钟

1.3 细胞培养生产有用物质 20分钟

1.4 若干有用物质的生产 20分钟

总计 2学时

【掌握内容】

1. 单离细胞的方法。

2. 单细胞培养技术方法。

3. 培养细胞的同步化

4. 固定化细胞培养系统

【了解内容】

1. 成功的悬浮细胞培养体系必须满足的条件。

2. 培养细胞的密度及生活率的测定

3. 次生代谢物的生产的意义。

4. 细胞培养生产有用物质和若干有用物质的生产。

【教学难点】

1. 细胞悬浮培养。

2.工业化生产次及代谢物过程。

【教学目标】

5. 能够对各种单细胞培养技术方法进行分析比较。

6. 能够区分分批和连续培养及封闭与开放培养。

3. 掌握平床和立拄培养系统特点。

【教学内容】

一、单细胞培养技术

1、单离细胞的方法

(一)物理方法 这是最早采用且至今仍用得最多的方法。即悬浮培养的细胞经摇床振动使细胞分散，如果向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩空气，会使细胞分散得更好；分离时用镍丝网进行过滤，细胞大的植物种类用200一300目，细胞小的用400目。过滤后用500转／分密度梯度离心5—10分钟，使单离细脑沉淀在离心管底，收集之。

(二)化学方法 加草酸钙l00ug/L处理胡萝卜细胞悬浮物，因草酸盐能结合细胞间质中的果胶钙的钙离子，从而获得了较分散的细胞。另外，秋水仙碱(o．1mm01／L)或2，4—D或水解乳蛋白 对细胞分散均有一定的作用。

(三)酶法

加果胶酶和少量纤维素酶，使细胞彼此分离开来，也是单离细胞的一种方法。酶法往往对细胞有不良影响，故此法用得较少。

2. 单细胞培养技术方法

(一)液体浅层培养 是先把细胞以一定的密度悬浮在液体培养基中，用吸管将悬浮液移到平皿中使之形成一个浅层。此浅层以1mm为宜，太厚不利于细胞对氧的吸收。用石蜡膜封住平皿后，进行静置培养。该法的优点是培养与空气接触面大、通气好，细胞的代谢物易扩散，防止了有害物质的积累过多而造成毒害。此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照惕。但由于细胞可能游动，不能进行定点观察；也可能出现细胞的集聚作用。

(二)微室培养 此法的优点是可在显微镜下连续观察细胞的变化。

(三)平板培养技术 是先将琼脂(琼脂糖效果更好)加热融化后冷却至43-45c时，迅速与等体积的细胞悬浮液均匀混合。完全冷却后，培养基在培养皿中形成一平板，单离的细胞包埋于培养基内。混合后琼脂的最终浓度控制在o．6%以下，以得到松软的固化状态，有利于细胞生长。此 9

法的优点是单离的细胞在培养基中分布较均匀，也便于定点观察，缺点是通气不好。

(四)看护培养 看护培养也曾称为纸筏营养技术，是在一个锥形瓶中，先加入一定体积的固体培养基，培养基上放上一块几毫米大小的愈伤组织块，在此愈伤组织块上再放上一张预先灭菌过的滤纸，然后放置一个晚上，使滤纸充分地吸收愈伤组织里渗透出来的培养基成分，次日．把分离好的单细胞接种到滤纸表面。单细胞通过滤纸从愈伤组织和培养至中吸收养分后，可以分裂形成小细胞团。小细胞团可转移出来继代培养。如此可促使小细胞团增殖、分化。

(五)饲喂层技术 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后．核失活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板技术制成一琼脂(糖)平板．此平板亦即“伺喂层”，然后将单离细胞以液体浅层或平板技术铺在饲喂层上。饲喂层的作用没有种的特异性，即以一种植物细胞制成的平 板．可以支持另一种的生长。

（六）悬浮培养 是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 悬浮培养与固体培养比较有三个优点：一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；三是振荡培养可以适当改善气体的交换。

一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

冘 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

冘 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

冘 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。

1.培养方法

1）分批培养 分批培养是将游离细胞按一定的细胞密度分散在液体培养基中进行培养，这样可以建立单细胞培养物。分批培养所用的容器一般为100—250m1三角瓶，每瓶装20—75ml培养基，培养过程中，除气体和挥发性代谢产物可以同外界气体交换外，一切都是密闭的。当培养基中主要营养物质耗尽时，细胞的生长和分裂即停止，为使分批培养达到细胞能不断增殖，必须及时进行继代培养，即取出一小部分细胞悬浮液，转移到成分柑同的新鲜培养基中(约稀释5倍)。

悬浮细胞培养进行继代操作时，可用吸管或注射器，不过进液口的孔径必须小到只能通过一个细胞或小细胞团(2—4个细胞)，操作前应将培养瓶静置几秒钟，让大的细胞团沉淀下去，然后再吸取上层悬浮液。

在细胞培养过程中，如何使细胞充分分散于培养液中是很重要的问题，而细胞的分散性与最初用于悬浮培养的愈伤组织的松散性有密切关系，将愈伤组织在半固体培养基上继代2—3个周期，可增加其松散性；另外，培养基某些成分也能增加细胞的分散性，如加入适量的2，4—D、纤维京酶、果胶酶、酵母提取液等均能提高培养细胞的分散性。当然，采用上述方法可以提高细胞的分散性，但无论如何只含有单细胞的悬浮液是没有的，总存在一些细胞田．每个细胞团由几个到几十个细胞组成，这是因为植物细胞有聚集在一起的特性。

分批培养是细胞悬浮培养的一种常用方法，但由于培养过程中细胞生长和代谢方式及培养基成分在不断改变，因此对研究细胞的生长和代谢不是一种理想的方法，但其所用设备简单、操作简便、重复性好，特别适合于突变体筛选和遗传转化等研究。

2）连续培养 连续培养是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方法。在连续培养过程中．新鲜培养基的注入和老培养基的排出不断进行，这样在培养物容积保持恒定的情况下，培养液中营养物质不断得到补充。连续培养有封闭型和开放型之分。

封闭型是指旧培养基的排出与新培养基的注入是等量进行的，排出液中的细胞经机械回收后，又被放回到培养系统中，因此，在这样的培养系统中，随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。

开放型培养与封闭型培养的区别在于新鲜培养基的加入和控制方式，开放型培养中，加入新鲜培养基的容积和排出的旧培养基及其中细胞的容积相等．并通过调节流入、流出速度，使细胞的生长速度保持在接近最高值的恒定水平上。根据调节机制的不同，可分为化学恒定式和浊度 10

恒定式。化学恒定式培养是以固定速度加入新鲜培养基，选其中一种营养成分(氮、磷或葡萄糖)的浓度调节成为生长限制浓度．从而使细胞的增殖保持在稳定状态之中。在这种培养体系中，除限制因素外．培养基的其他成分的浓度均高于细胞生长的需要，而限制因素的浓度则要调节到这样一种水平：它的任何增减都能由相应的细胞增长速率的增减反映出来。浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断加入的，它是由细胞密度的增加引起培养额浊度的增加来调节的——预先设定一种细胞密度，当超过这一密度时，就排出培养液及其中的细胞，再加入新鲜培养基，从而保持细胞密度的恒定。

2.培养细胞的同步化

细胞分裂周期由分裂间期和分裂期(M)经成，细胞分裂的发生是随机的，并不是人们设想的那样从某一点同时开始步调一致地完成分裂周期的各个时期，因此，一个培养体系中的细胞将会是由处于不同分裂时期的细胞组成，即是不同步的，这对于细胞分裂和代谢机制研究、大规模培养细胞来生产次生代谢产物都是不利的，这些研究和生产都要细胞分裂同步或基本同步。

为了使培养细胞同步化，进行了各种尝试，包括物理的和化学的方法，物理方法主要是通过对细胞的物理特性(细胞或细胞团的大小)和生长环境条件(光照、温度等)进行控制，实现细胞的同步化．如按细胞团大小进行选择和分别培养及低温休克方法。化学方法是使细胞受到某种营养饥饿或是用某种因素抑制细胞分裂，这就是所谓的饥饿法和抑制法。

（1）饥饿法 这种方法是在培养过程中．先停止供应细胞分裂所必需的—种营养物质或激素，使细胞停止在G1或G2期，经一段时间饥饿后，向培养基重新加入这种限制因子，静止的细胞就会同步进入分裂。如在长春花细胞悬浮培养中，先使细胞受到磷酸盐饥饿4d，然后转移到含磷酸盐的培养基中，获得了同步化。

(2)抑制法 使用DNA合成抑制剂如5—氨基尿嘧啶、羟基脲、胸腺嘧啶脱氧核苦，使细胞内DNA合成受到抑制，细胞分裂只能进行到Gl期，细胞都停在G1和s期的边界上，当把这些抑制剂去掉后，细胞即进入同步化分裂。不过用这种方法取得的同步性只保持一个细胞周期。

3. 培养细胞的密度及生活率的测定

(一)起始密度的决定

培养细胞的密度一般在104—105个／mL之间为宜，具体密度视细胞体积的大小和试验培养的效果而定。密度的计算可采用上梅医用光学仪器厂生产的血球计进行。

（二）活细胞百分率的测定

单离细胞并不全是活的，通常只有60％以上的活细胞。活细胞百分率的测定有助于评价细胞质量，同时对以后的培养效率有较正确的估计。测定方法是：先以培养液为溶剂配制o．1％的酚藏花红和用丙酮配制5mg／mL的二醋酸酯荧光素，贮于冰箱。使用时把萤光素稀释至0.01％后，使其与细胞在载玻片上混合。滴一滴o．1％的酚藏花红染色液于载片上后，即盖上盖玻片。在显微镜下，被染上红色的是死细胞，而活细胞木染色。由此可以计算出活细胞的百分率q经15—30分钟后，还可在萤光镜下观察、计数。活细胞会在荧光素作用下发茧光，死者则不会。

(三)植板率的测定

用平板培养的需统计植板车，即每个平板接种细胞总数中形成细胞团的百分串。汁算公式为：植板率%=细胞团数/接种细胞总数*100%

其中，每平板接种细胞数＝每毫升培养液中的细胞数目×该平板细胞培养液的毫升数

二、次生代谢物的生产

工业化植物细胞培养系统主要有两大类：悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。

（一）悬浮培养系统

液体悬浮培养系统基本原理与上述实验室悬浮培养方法一致，但大规模培养所采用的设备及控制技术比实验室小规模培养要复杂的多。

冘 机械搅拌式培养系统

机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的，根据植物细胞的特性，其 11

设备要求在微生物发酵罐的基础上作如下改进：搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置； 为便于取样观察，一般还设计有取样口。

冘 气压搅拌式培养系统

考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往往是容易使培养物污染的部位，因此，发展出空气提升式生物反应器，但其缺点是搅拌不均匀。

冘 旋转式培养系统

一般用于产品中试或某些必需裂解细胞才能获得目的产物的培养，其优点是控制精确，处理灵活，缺点是培养体积较小。

Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统（图3-1）。该系统由培养罐及四根导管连通辅助设备构成。经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定浓度时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高，次生物质累积的量也较少。

（二） 固定化细胞培养系统

针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius等（1979）首次报道了用藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利于细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。

这一技术的优点在于：

冘 细胞的缓慢生长。由于初级代谢和次级代谢注往对前体存在着竞争，细胞生长快速时，初级代谢占优势，而细胞生长缓慢时，次级代谢占优势，故固相化的细胞生长缓慢导致次生代谢物产量增高。

冘 可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节； 冘 细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

冘由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

冘便于次生代谢物的收集 由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：

冘 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等； 冘 附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。常见的固定化细胞培养系统有以下两大类：

（1）平床培养系统 本系统由培养床、贮液罐和蠕动泵等构成（图3-2）。新鲜的细胞被固定在床底部由聚丙烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌贮液罐被紧固在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过蠕动泵循环送回贮液罐中。本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质（表3-2）。不过它占地面积较大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密闭的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。

（2）立柱培养系统 本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1～2cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中（图3-3）。这样，贮液罐中下滴的营养液流经大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。 12

在立柱培养系统中，由于细胞被固定化，因此应尽可能选择那些次生物质能自然地或经诱导后能逸出胞外的细胞株系。此外，为了提高次生物质的产量，还应注意：①要选用高产细胞株系。②在营养液中加入目的产物的直接或近直接前体物质，往往对增产目的产物有特效。③对各类细胞的培养都应反复摸索碳源、氮源和生长调节物质的配比，找出最佳方案。④适量光照及通气在多数情况下有利于产物的生成。

三、细胞培养生产有用物质

利用植物细胞培养生产有用物质，与栽培植物相比，有种种优点，但是，植物细胞生产次生物质还存在许多问题，它与微生物培养系统具有很大不同：1)植物细胞培养时，其生产速度较慢。通常微生物的工业发酵生产只需要几天，便可完成发酵生产全过程。而植物细胞培养至少需要3周，一般要4—5周才能完成一次生产周期。虽然，随着细胞培养技术的改进，其生长速率不断提高，但生产效率仍落后于微生物生产。2)植物细胞培养生产次生代谢物的总量一般要比植株低。通常未经筛选的外植体，次生物质的合成与积累比亲本少的原因，主要是离体培养中，高产植袜的外植体，大多数细胞没有合成和积累所期望的化合物，这与微生物大不相同，而仅少数细胞能够产生浓度与整体植株的细胞相等。当然也有少数变异细胞与微生物突变系一样，会产生比亲本细胞更高的次生物质。3）生产技术上还存在一些问题。植物细胞壁与微生物不同，较脆，在振荡培养中，容易因搅拌而破碎；培养过程需要复杂的培养基及附加物，又极易遭受真茵的污染；次生物的产量不甚稳定等，因此成本较高。

细胞培养生产有用物质的一般程序：

1.选材 在开展细胞培养生产有用物质的选材时，应注意以下先决条件：(1)药效肯定；(z)对其有效成分有充分的了解；(3)有测定有效成分相约理的可靠方法；(4)市场短缺或价格贵重。上述诸条件对随后的．研究开发将带来许多方便。例如：人参是我国传统的名贵药材．国内外对其有效成分和药理研究较多。它具有补元气，安神益智等药效，其药效成分为皂角贰等，对其药理也有一定的测定方法：而且，人参栽培困难，产品短缺，价格贵重。因此，开展人参的细胞培养生产有用物质就很有前途。

取材应取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织，例如人参药效以根部较佳，但其形成愈伤组织的能力较差；茎和叶柄既有一定的有效成分，又有较好的形成愈伤组织能力，是较合适的材料。

2.细胞株系建立 将诱导产生的愈伤组织分离建立悬浮细胞繁殖体系。为了实现细胞培养工业化产品质量，对纫胞株系的选择有两个基本要求，即有用物质的合成积累能力强和生长速度快的细胞株。因此，在培养过程中，要不断对培养细胞进行分析，检测其生化合成某些有效物质的能力，筛选合成能力高的细胞株，不断更新培养的细脑株系。

3.大量培养 将选出的优良细胞株扩大繁殖后，即可作为细胞工厂化培养的生产“种子”。采用成批的、半连续或连续的培养系统，对这些“种子”进行大量培养。

4.产品提取与纯化 从植物细胞培养物产提取和纯化有用的产品.

四、若干有用物质的生产

1.生物碱

2.苷类物质

3.醌类物质

4.酶制剂

5．胰岛素

6．色素

思考题

1．一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬浮细胞系的愈伤组织有何要求？

2．建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？

3．悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律。

4．细胞大规模培养有哪些培养系统？

5．植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题。

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第三章 植物细胞原生质体制备与融合

【课时安排】

1.1 原生质体的制备 25分钟

1.2原生质体培养 25分钟

1.3原生质体的融合 25分钟

1.4杂合体的鉴别与筛选 25分钟

总计 2学时

【掌握内容】

1．基本概念：原生质体

2. 原生质体的制备。

3．原生质体培养

4．原生质体的融合

5.杂合体的鉴别与筛选

【了解内容】

植物细胞原生质体制备与融合意义。

【教学难点】

1. 原生质体的融合方法。

2. 杂合体的鉴别与筛选。

【教学目标】

1.能够对原生质体的融合方法进行分析比较。

2.能够区分杂合体的鉴别与筛选各种方法。

【教学内容】

一、原生质体的制备 在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

（1）取材与除菌 原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣，因为由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2～3次，然后浸入70％酒精消毒后，再放进3％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解

现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种pH值在

5.5～5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3％～3.0％以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等。③酶解：除菌

绿

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

（3）分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取200～400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。

（4）洗涤 刚分离得的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤2～4次。

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（5）鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放入低渗溶液中，则很容易胀破。也可用荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分率。此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。

二、原生质体培养

1、培养基 不同来源的原生质体有不同的营养需求。一般来说原生质体培养基的基本成份与培养细胞的培养基成份相似，只是添加了渗透压稳定剂。常用的基本培养基是MS。但MS配方里的铵态氮含量对许多植物的原生质体来说显得太高，甚至有毒害作用，可以降低其至1／2或1／4强度，另加氨基酸类。

2、培养方法

各种培养单细胞的方法均适用于原生质体的培养。由于原生质体的产率往往较高，故常用液体浅层培养和平板培养这两种方法，而不需用其他更为复杂的方法。但后来发展起来的一种固体和液体相结合的方法效果似乎特别好。这种方法是将原生质体混于琼脂糖中制成乎板，把平板切成小块，转移到液体培养基中，在振荡器上混合振荡培养。此法兼具固体培养和液体培养的优点。对此法再加改进，将原生质体悬液与琼脂糖培养基混合后，逐滴地满在平皿底面上*待凝固后在其周围加入液体培养基，还可在液体培养基中加入经辐射的细胞，兼具了饲喂层方法的特点。原生质体的培养密度可为l05个／mI，左右。通常用直径6cm的培养皿，每皿培养量以3mL为适宜，太多通气差，太少液体易挥发光。尽管在培养皿上下盖之间加石腊膜或用透明胶封住，但由于培养室温度比较高，即使每皿装3mL培养基的情况下，挥发仍快，故最好把培养皿放人能较好保持湿度的有机玻璃等盒子中。

由于原生质体培养再生植株难度比较大，在培养某种植物原生质体时，不但需要借鉴前人的经验，也须自己根据研究对象的培养中出现的情况探索出有效的办法。

三、原生质体的融合

也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。不过，受精作用是一种自发的融合；而原生质体则由于质膜表面带有负电荷，所以它们彼此之间通常相互排斥，原生质体之间保持一定的距离7e然融合频率极低。因而，人们必须采用一定的方法加以诱导，以促进原生质体的融合。诱导融合的方法有：

（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。首先被采用作融合剂的无机盐是硝酸钠溶液。在19xx年用它融合烟草的原生质体，首次获得了种间体的细胞杂种。硝酸钠的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体间不再彼此相互排斥，而紧密地结合在一起。但硝酸钠作融合剂所需要的浓度(o．25m01／L)对原生质体有毒害作用，且诱导频率比自然融合频率高不了多少。所以，此后很少有人采用。

聚乙二醇（PEG）结合高钙高pH诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：

按比例混合双亲原生质体→滴加 PEG溶液，摇匀，静置→滴加高钙高pH值溶液，摇匀，静置→滴加原生质体培养液洗涤数次→离心获得原生质体细胞团→筛选、再生杂合细胞。

通常，在PEG处理阶段，原生质体间只发生凝集现象。加入高钙高pH值溶液稀释后，紧挨着的原生质体间才出现大量的细胞融合。其融合率可达到10％～50％。这是一种非选择性的融合，既可发生于同种细胞之间，也可能在异种细胞中出现。有些融合是两个原生质体的融合，但也经常可见两个以上的原生质体聚合成团，不过此类融合往往不大可能成功。应当指出，高浓度的PEG结合高钙高pH值溶液对原生质体是有一定毒性的，因此进行诱导融合的时间要适中。处理时间过短，融合频率降低；处理时间过长，则将因原生质体活力明显下降而导致融合失败。Jelodar近年介绍，以丙酸钙取代氯化钙作为助融合剂，细胞融合频率和植板率都有明显提高，甚至超过了电激融合法。

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（2）物理法诱导融合 电融合技术优点在于避免了 PEG、高钙、高pH强加于原生质体的生理非常条件，同时融合的条件更加数据化，便于控制和相互比较。

19xx年Senda等发明了微电极法诱导细胞融合。19xx年Zimmermann等提出了改进的平行电极法，现简介如下：

电融合通常是在特制的融合板上进行，两个平行电极之间的距离一般1—2mm，将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后（悬液中除了含有保持渗透压的甘露醇外，尚需加入少量的caCl2(约o．1mol／I，)，使溶液保持一定的导电串。插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。交变电流的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小等因素对融合的效果都有明显的影响。融合效果也因原生质体的来源不同而异。所以，在研究每一种新材料时，对上述诸因素都需要一个探索过程。

上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以X射线、伽玛射线、纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后融合则可能产生没有供体方染色体的细胞质杂种。利用这种所谓的不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。

经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型：①亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。②融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。③融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。

三、 杂合体的鉴别与筛选

融合处理后，原生质体在培养基中再生细胞壁，产生了由亲本细胞、同源融合细胞和杂种细胞组成的混合群体。尽管为增加原生质体的融合频率作了不少努力，但真正的异溺融合体的比例仍不会很高。所以必须通过一定的方法从混合群体中把杂种细胞分拣出来加以培养，使之形成体细胞杂种。所以要对对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。

（1）杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：

若一方细胞大，另一方细胞小，则大、小细胞融合的就是杂合细胞；若一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现上述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再生培养基培养。

（2）互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与生长。遗传互补法则可弥补以上不足。

遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。如不同基因型的白化突变株aB×Ab，可互补为绿色细胞株AaBb，这叫作白化互补。甲细胞株缺外源激素A不能生长，乙细胞株需要提供外源激素B才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素A、B的选择培养基上可能生长。这种选择类型称生长互补。假如某个细胞株具某种抗性（如抗青霉素），另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。

（3）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP，见8．2．2．2）和随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。

（4）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别

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第四章、单倍体植物的诱发与利用

【课时安排】

1.1花药培养 30分钟

1.2花粉培养 10分钟

1.3杂交法获单倍体植株、未授粉子房或胚珠的培养、单倍体培养物的加倍 10分钟

3. 1.4人工种子的研制 50分钟 总计 2学时

【掌握内容】

1．基本概念：单倍体生物、花药培养、花粉培养。

4. 花药培养的过程。

3．影响花粉培养效率的若干因素。

4．花粉培养

5. 人工种子的构成及特点

6. 人工种子的研制

【了解内容】

1杂交法获单倍体植株。

2未授粉子房或胚珠的培养。

3单倍体培养物的加倍。

4. 人工种子的研制的意义。

【教学难点】

1. 花药培养的过程及与花粉培养的区别。

2. 人工种子的研制过程。

【教学目标】

1.能够对花药培养的过程及与花粉培养的加以区别。。

2.能够掌握人工种子的研制过程。

【教学内容】

1 、花药培养 花药培养，是对花粉发育到一定阶段的花药进行离体培养，以改变花药内花粉粒的发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，随后由胚状体直接发育为植株，或使愈伤组织分化成植株。花药培养可获得单倍体或结合的二倍体，在作物遗传育种上具有多种用途。

1.1定义及意义

花药培养：花药作为外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。

▲单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点：冘 体细胞染色体数减半；冘 生长发育弱，体形小、各器官明显减小；冘 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 ▲单倍体的应用潜力

冘 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限冘 获得育种中间材料冘 与诱变育种相结合可以提高诱变频率冘 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义冘 作为遗传工程受体更为有效冘 用作基础遗传研究的各个领域

1.2 花药培养的过程 花药由花药壁和花粉囊构成。经过适当的诱导，花粉囊中的花粉（单倍体）可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终形成花粉植株。

首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari(1964, 1966)。目前已有250多种植物花药培养成功。目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。

花药培养的基本程序是：

外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养

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（1）选取成熟度适中的花蕾或幼穗 所谓成熟度适中是指花蕾或幼穗中花粉正处于形成营养细胞和生殖细胞的阶段（对多数植物而言）。过早或过迟的花粉效果多不理想。不过，由于物种特异性千差万别，准确的取材时期都需经试验而定。

花药培养材料的选择，关键在于选取花粉处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核朗的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期，各种植物最合适的具体时期，依植物种类品种不同而异。接种花药的花粉发育朗观察，可以从一个花蕾中，取下一枚花药，观察其发育期，其余花药可供接种用。大量花药接种，可根据花药内的花粉发育期的进程与花营的大小、外观形态和色泽的相关性，直接选取花药培养材料。每一种植物只要细心观察比较，都可找到花粉发育期的相应外部形态指标。

（2）花药预处理 大量试验结果表明，花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。通常选取花粉发育期合适的花药、取花蕾在3—5℃低温条件下，处理3—10天，对花药培养有促进作用，可以提高花粉的诱导率。

花药经无菌操作从上述材料中取出后，经下述方法之一进行预处理：①用甘露醇或其他糖、无机盐配成的高渗溶液（约25％w／v）处理6～8min，或者低速（2000r／min）离心30min，将有利于单倍体愈伤组织的形成。②低温（4～10℃）或高温（35℃）处理2～20天，可明显提高某些植物单倍体胚的比例。烟草、茄子3～5°C 72小时，水稻10°C 10～14天，柑橘3°C 5～10天，马铃薯4°C 48小时。

低温处理的作用：

冘 可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；冘 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；冘 激发花粉产生原胚；冘 促使细胞同步分裂。

（3）接种培养 取消毒后的花蕾，在无菌条件下，用镊子剥去花瓣，取花药均匀接种于培养基上，并剥除花丝、花药粒和镊子央伤的花药等。每个试管可按种20一30故花药。花药培养方式有固体培养和液体培养两种。常用的培养基有MS、N6和马铃薯等培养基等。蔗糖浓度比一般培养基略有提高，浓度约5％一10％，并附加不同种类和一定浓度的植物生长调节剂。固体培养基的琼脂用量为o．6％一0.8％。液体漂浮培养有时加入水溶性聚蔗糖(FkDU)效果可能更好。培养室的温度一般在20一30℃，光照每日12小时左右。

选择适当的培养基与培养条件 花药培养基大体有两种类型。对多数植物而言，在愈伤组织培养基中一般已添加适量的生长素类激素，如2，4-D、萘乙酸或吲哚丁酸等，花药可以在这种培养基中去分化而长成愈伤组织，但通常不会长成单倍体植株；但有些植物，如烟草、曼陀罗等则只需在简单的蔗糖和无机盐培养基上即可完成从花粉去分化、单倍体胚的形成乃至单倍体植株的长出这一完整的过程。无论哪种情况，在培养基中加入适量的脯氨酸或羟脯氨酸，对促进单倍体愈伤组织的形成都有明显的作用。

此外，培养条件是一个值得注意的问题。由于花药中含有至今成分不明的水溶性“花药因子”，只有当培养基中的“花药因子”积蓄到一定程度，添加外源激素才会奏效。因此，适当密植花药是必要的。据报道，在花药培养过程中如果能以0.5 mol／L甘露醇处理2天（造成水份亏缺），或者在含氧2.5％～5％的氮气罐中闭密30～60min，都将有利于单倍体愈伤组织和胚的生成。

无论是长出愈伤组织还是单倍体胚，都应像组织培养那样，适时转移至添加细胞分裂素类激素的分化培养基中，以利植株生成。不过花药培养中双倍体植株所占百分比过高的问题仍未得到根本解决。

1.3影响花粉培养效率的若干因素

基因型的差异 植物的不同种和品种间花药，在离体培养下的反应能力有明显差异。例如，在柑桔中，四季桔花药培养产生花粉胚的能力就远比其他品种类型强；有的品种类型甚至很难获得花粉植株。业已证明，矮牵牛的花药反应能力与非单个基因控制约遗传性有关。

花药(花粉)的生理状态 不同生长季节、栽培环境，取不同部位的花蕾，其花粉的生理状态均可能不同，诱导率有明显差异。甜椒杂种一代单核早期和双核期花粉在冬季还有少量的诱导率， 18

但春季诱导率为零。株龄对花药培养也有极大影响，天丝葵从2月龄植株上采集的花药经培养后平均有11．2％产生愈伤组织．而二年生苗的花药，只有2%产生愈伤组织。

花粉发育期 迄今为止，花粉处于以下各时期的材料培养均已获得成功：四分体期、小孢子早期、中期和晚期(即单核靠边期)、有丝分裂期和双核花粉期。其中多数成功的例子中是采用单核靠边期。

培养前低温顶处理 一般用3—5C处理3—10天有利于提高小袍子的离体培养反应能力。这已在曼陀罗、天仙子、柑桔等众多的植物上得到证实。

培养基的影响 花药培养采用最多的培养基仍是MS。在一些植物中，须对其中的铵态氮和硝态氮的比例加以调整。我国科学工作者研制成功的N6和马铃薯培养基对不少园艺植物的花药培养效果较好。采用液体悬浮培养方法比固体培养基好，可以诱导更多花粉启动发育。

2 花粉培养

花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养.从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。

花粉培养是从花药游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分化启动发育为单倍体植袜。花粉培养与花药培养相比，可以避免花药上的体细胞的干扰，并有可能从较少的花药获得大量的花粉植株；但要求的培养技术更高。迄今为止，获得成功的例子比花药培养少。

由于花药培养时一些二倍性的花药壁细胞亦形成愈伤组织，从而增加了培育单倍体植株的难度。19xx年 Nitsch 等首创用挤压法分离花粉进行培养的方法。他们取下烟草成熟花蕾，在5℃放置48h后进行表面消毒，取出花药。让花药在28℃的液体培养基上漂浮光照4天，作为预处理。然后用器械挤破花药，制成花粉悬液。经过滤、离心、培养，只得到约5％的花粉植株。究其成功率低的原因，一方面系由于挤压损伤了花粉，另方面可能由于缺乏“花药因子”，花粉生长、发育欠佳所致。为了克服上述缺点，19xx年，Sunderland等提出了自然散开法收集花粉的方法。他们将花蕾或幼穗在7℃冷处理二周后，让其在适当的液体培养基表面培养，待花药自然开裂散落出花粉后，离心收集花粉，置于含肌醇和谷氨酰胺的培养基中生长。虽然本方法使花粉成株率有所提高，但与花药培养相比仍然低得多。不过花粉培养一旦成功，则可较明确地判断为单倍体植株。

(一)花药预培养

取花粉处于合适的发育期的花蕾，置于内装有浸湿的滤纸的培养皿中，在5C左右的低温下处理几天，然后灭菌，并在无菌条件下取出花药，把花药接种于Nitsch等培养基中预培养数天，然后将花粉分离出来，再进行液体悬浮培养，小袍子可以启动发育。观察表明，通过这样的予培养，药壁组织对小袍子的起动发育起着重要作用，这种作用可能涉及以下两个方面：(a)药壁组织向花粉提供了必要的营养物质；(b)通过药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质；药壁起着花粉代谢库的作用。因此，小袍子启动后，在分离培养过程中，可以连续分裂。如果不经花药预培养，即使其他条件相同也往往没有反应。近年来许多研究者采用类似方法获得了马铃薯、茄子、颠茄、矮牵牛、天仙子的花粉植株。

〔二〕花粉培养

1.花粉的分离 选取花粉合适发育期的花蕾，经消毒处理。取出花药，放在加有4—5ml的液体培养基的小烧杯中。用粗的玻棒，在烧杯壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。然后根据不同植物花粉粒的大小，选用孔径大小合适的尼龙网(孔径20一60 um)过滤，除去药壁组织。过滤后的花粉液再经低速离心(100一160转／分)3分钟．使花粉粒沉于离心管下部，再用新鲜培养基稀释，重复两次，可得到纯净的花粉群体。

2．花粉的预处理 用低温处理(如前所述)，或在单核后期用离心预处理，有促进花粉启动之效。

3.培养方法 花粉培养方法常用的是悬滴培养和液体浅层培养。悬滴培养每滴可接种50一80粒花粉。液体浅层培养用直径5cm的培养皿，加2．5mI的花粉悬浊液，花粉的密度为l04一105个／mL。

花粉培养基常用的有MS、Nicsch或White等，有的在基本培养基中，加入花粉组织的提取物，对花粉培养有促进作用。花粉提取物除了本种的花药外，也有采用异种的花药提取物。据分析， 19

花药提取物中起作用的物质可能是细胞分裂素、肌醉、谷酷胺和丝氨酸之类的物质。对于培养基中生长调节剂和蔗糖浓度，可根据花粉培养的不同发育阶段进行调整。

虽然以花药与花粉培养单倍体植株的研究目前都已取得长足的进展，但白化苗出现过多仍是亟待解决的问题。

3 未授粉子房或胚珠的培养

子房、胚珠中的成熟胚囊由6个单倍体细胞（包括1个卵细胞）和1个具2个极核的中央细胞构成。理论上这6个单倍体细胞都可能发育成单倍体植株。19xx年，San Noeum首先从大麦的未授粉子房培养获得单倍体植株。虽然该领域的工作目前还开展得不多，但由于诱导出的植株大多是单倍体绿苗，因此这可能是一个充满希望的发展方向。

未授粉的胚珠和子房的培养，可以诱导孤雌生殖产生雌性单倍体；还可以用于离体受精，克服孢子型不亲和，获得远缘杂种。获得孤雌单倍体的植物有：西葫芦、莴苣、扶郎、花、百合等。

4 杂交法获单倍体植株

杂交，特别是远缘杂交，杂种胚在胚胎发育过程中往往会将一方亲本的染色体逐步排除，最终将得到仅含一方染色体的单倍体植物。19xx年Kasha利用该原理将球茎大麦与普通大麦杂交，培育出了普通大麦的单倍体胚和植株。由本方法得出的单倍体胚长成的植株都是绿苗，这是本方法的突出优点。

5 单倍体培养物的加倍

我们之所以要得到单倍体培养物（愈伤组织、幼胚以及植株），其目的是为了对它们进行染色体加倍，从而获得纯合正常二倍体植物。在诱发单倍体植株的各阶段（形成愈伤组织、幼胚及小苗），都可用0.2％～0.4％秋水仙素处理24～48h，然后按常规途径培养；即可能得到染色体加倍的能正常开花、结果的二倍体植株。

第五章 人工种子的研制

一人工种子的概念

人工种子又称合成种子或体细胞种子。任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。

根据包被的需要程度可分为三类：

第一类是裸露的或休眠的繁殖体，如可以适当干燥的体细胞胚（如鸭毛草的体细胞胚）、休眠的微鳞茎和微块茎等，它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率；

第二类为人工种皮包被的繁殖体，一些体细胞胚、原球茎等虽不能过度干燥，但只需人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚；

第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体，大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。

与试管苗技术和自然有性繁殖种子相比，人工种子具有以下突出的、甚至是不可取

代的优点：

其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既能保持原有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；

其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有重要的实用意义；

其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；

其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；

其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。

二人工种子的构成及特点

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（1）人工种皮 这是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换畅通，又能防止人工胚乳中水份及各类营养物质的渗漏。此外还应具备一定的机械抗压力。

（2）人工胚乳 这是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分，再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。

（3）胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的结构，具有萌发长成植株的能力。

虽然人工种子的研制历经十几年已经取得了长足的进展，但是仍有一些关键技术尚未攻克。例如，人工种皮的性能尚不尽人意，还未找到一种符合多数物种需要的人工胚乳，胚状体如何让它处于健康的休眠状态，人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。有理由相信，不久的将来，人类终将摆脱大自然的羁绊，实现工厂化生产植物种子的目标。 三人工种子的制备

（1）胚状体的制备及其同步生长 如前所述，通过外植体的固体培养基培养、液体培养基的悬浮细胞培养以及花药、花粉的诱导培养都可获得数量可观的胚状体。

体细胞胚的诱导和形成需要经过至少两个阶段：第一阶段，在含高生长素浓度的培养基中，诱导培养胚性细胞；第二阶段，在较低生长素或无生长素的培养基中形成体细胞胚。

但这些胚状体往往处于胚胎发育的不同时期，不符合大量制备人工种子的需要。因此诱导胚状体的同步化生长成了制备人工种子的核心问题。采取以下措施可促进胚状体的同步生长：

低温法：在细胞培养的早期对培养物进行适当低温处理若干小时。由于低温阻碍了微管蛋白的合成，纺锤体形成受阻，滞留于有丝分裂中期的细胞增多。此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。

抑制剂法：同理，细胞培养初期加入DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶等，使细胞生长基本上都停顿于G1期。除去抑制剂后，细胞进入同步分裂阶段。

分离法：在细胞悬浮培养的适当时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育某个阶段的胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。

通气法：有人发现，在细胞悬浮培养液中每天通入氮气或乙烯1～2次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。

渗透压法：随着植物胚状体发育从小到大，其渗透压值呈现规律性的从高到低的变化。我们可配制一定渗透压值的培养基而使胚状体的发育停留在指定的阶段（如向日葵球形胚的渗透压为17.5％），从而达到同步发育的目的。

控制细胞及胚状体的同步化生长是一个尚未完全解决的问题。除了上述提出的外因干预以外，物种及不同外植体细胞的敏感性，对实现同步生长也有很大影响。只有经过实验摸索才可能成功。

此外，刚收获的胚状体含水分很高，不够成熟，亦难以贮存。一般应经自然干燥4～7天，使胚状体转为不透明状为宜.

（2）人工胚乳的制备人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，通常还要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉、糖类）以减少营养物泄漏。常用人工胚乳有：MS（或SH、White）培养基+马铃薯淀粉水解物（1.5％）；0.5×SH培养基+麦芽糖（1.5％）等。尚可根据需要在上述培养基添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等。

（3）人工种皮的研制

理想的人工种皮应该是：具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失；同时又具有良好的透气性，以保证繁殖体维持生理活性的需要；此外，还应有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作；但同时又要求其无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。

配制包埋剂及包埋褐藻酸钠是目前最好的人工种子包埋剂，它无毒、使用方便，具有一定的保水、透气性能，价格较低。经CaCl2离子交换后，机械性能较好。其次是琼脂、白明胶等。 21

通常以人工胚乳溶液调配成4％的褐藻酸钠，再按一定比例加入胚状体，混匀后，逐滴滴到2.0％～2.5％CaCl溶液中（图3-5）。经过10～15min的离子交换络合作用，即形成一个个圆形的具一定刚性的人工种子。而后以无菌水漂洗20min，终止反应。此时的人工种子是一种胶囊状结构，将其晾干后可贮存或播种。为了克服人工种子易于沾粘和变干的缺点，美国杜邦公司以一种称为Elvax 4260的涂料对人工种子进行表面处理，效果较好。此外以5％CaCO3或滑石粉抗粘，也有一定效果。

以上所述滴胶法获得的人工种子，其直径随滴管口径的大小而定；每颗种子内含胚状体数目主要取决于包埋剂中胚状体的密度；人工种皮的厚度则随人工种子在CaCl2溶液中离子交换时间的长短而定，一般掌握在10～15min。种皮太厚，不利于胚状体萌发；种皮太薄，则在贮存、运输以及播种过程中都会遇到麻烦。

7.4 人工种子的贮存与萌发

人工种子的贮存与萌发是迄今尚未攻克的难关。一般要将人工种子保存在低温（4～7℃）、干燥（＜67％相对湿度＝条件下。有人将胡萝卜人工种子保存在上述条件下，两个月后的发芽率仍接近100％。但这种贮存方式的费用是昂贵的。在自然条件下人工种子的贮存时间较短，萌发率较低。人工种子的研制尚处于实验室研究阶段。

思考题

1．人工种子的概念和类型。

2．人工种子对繁殖体有什么特殊要求？

3．目前人工种子生产中需要研究解决的主要技术问题。

4．目前人工种子最适于在哪些方面应用？

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第二部分 动物细胞工程

【课时安排】

1.1细胞培养的条件 20分钟

1.2影响细胞生长的因素 20分钟

1.3原代细胞的培养与建系 60分钟

总计 2学时

【掌握内容】

1．细胞培养的条件

2. 影响细胞生长的因素。

3．原代细胞的取才

4．原代细胞的分离和制作

5. 原代细胞的培养方法

6. 细胞的纯化

【了解内容】

1. 影响血清的作用因素。

2. 动物细胞工程概况

【教学难点】

1. 原代细胞的培养与建系。

2. 原代细胞的分离和制作。

【教学目标】

1.能够掌握原代细胞的分离和制作过程。

2.能够掌握原代细胞的分离和制作。

【教学内容】

一、细胞培养的条件

细胞培养的条件应模拟体内的生长环境，除定时输送培养液满足细胞生长所需的营养外．还要考虑到细胞生长的环境如温度、气体环境和氢离子浓度及渗透压等。

1. 细胞的营养 离体细胞与体内的细胞在营养代谢上是有区别的。机体内的细胞营养可受神经和激素等影响并进行—系列的统一调节，而离体的细胞则不受其调节。离体培养细胞与体内细胞在营养要求上的主要差别如下：

(1)体外长期培养的细胞大多需要血浆、血清或胚胎浸出液，而这类培养液可能含有微量的激素、维生素及必要的氨基酸，足以供给细胞营养的需要。

(2)在体内血液中许多活性很强的物质只需微量即可维持营养的需要，而在体外培养时无法观测，量多了可能与微量的作用不同，量少了又可能很快就会消耗掉。

(3)组织培养是—群离体细胞，而这些细胞有不同的营养要求。这种不同的营养要求在体内因有别种器官和组织细胞的活动而间接供给．但在培养基中则没有这种供给。

(4)各种组织都有其特殊的营养要求，能适合某一种组织的培养液。不一定就能适合另一种组织的细胞，其差异有时较大。

由此可见，各种不同的细胞具有不同的营养要求。因此，细胞营养的研究在组织细胞培养中非常重要。

凡能进入细胞中被细胞所利用，参与细胞代谢活动和维持细胞生存的物质均属营养物质。体外培养细胞的生长所需的基本营养物质，除糖类、氛基酸和脂类三人类营养物质外．也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素等。

1)水 水是一种良好的溶媒。人体细胞中大部分是水。一切营养物质只有溶于水，才易被细胞吸收。代谢产物也需溶水才能排泄。生化反应也必须在溶液状态下才能很好起作用。细胞培养用水必须经过2—3次破璃器皿蒸馏或者用离了交换树脂处理。这样的水含杂质少、纯度高， 23

应用起来安全可靠。 —般在电导仪上表示2一3×10欧米咖以上方可使用，生长掖要在5×106以上。

2）糖 细胞靠糖的氧化来获得能量。葡萄糖是机体活功能量的主要来源，故在培养液中应加入一定浓度的葡菏糖(0.56mm01／L)．以在生物氧化后供给细胞大量的能量。近年证明谷氨酰胺也是碳的重要来源。

3）氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。所有培养细胞需要以下12种基本氨基酸：精氨额、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酿、额氨酸、胱氨酸及酪氨酸。另外尚需谷氨酰脓。谷氨酰胺对细胞具有特殊作用，能促进各种氨基酸进入细胞膜。它所含的氨又是核酸中膘吟和嘧啶的重要来源，同样也是合成三磷酸腺苷的所需物，也是能源和碳的来源。因此，谷氨酞胺对培养细胞非常重要，肿瘤细胞培养时比正常细胞需求量高1倍。很多细胞在含氨基酸的培养液中生长良好。

有时细胞培养还加以下七种氨基酸，即天门冬氨酸、天门冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸(非必需氨基酸)。尤其是丝氨酸对很多癌细胞、成纤维细胞生长很重要。细胞只能利用左旋的异构体，而右旋的即使超量也无用。

4）维生素 维生素是人类及动物细胞维持生命和生长所需的一种活性物质。许多维生素是酶的辅酶和辅基的组成部分，对细胞的代谢有重大的影响，某些维生素缺乏，短期可引起细胞死亡。维生素的需求量随细胞而异，如生物素、叶酸、泛酸、吡多醇、核黄素、硫胺素及B12等在很多常用限定培养基中已成为固定组成成分。

5）无机离子和微量元素 钠、钾、镁、钙、磷、氮等无机离子是细胞生长所必需的，它们参与细胞的代谢，是细胞组成所需要的。此外，微量元素铁、锌、硒等也是细胞生长所需要的。细胞培养时用的平衡盐溶液主要含钠、钾、钙、镁等阳离子，其比例与海水或高等动物血液内的比例相似。

各种细胞对无机盐的需要是不同的。一般来说。氯、钠、钾、钙、镁、磷是重要的天机盐成分。它们也有相互桔杭作用。如钙和镁能位细胞膜渗透性降低，而钾和钠能使细膜渗透性增高。甲和钠能位肌肉收缩性丧失，而钙和锈能恢复肌肉的收缩性。镁的毒性作用可用钙来解除。因此，这些离子在溶液中只有保持一定的比例，才可以使细胞维持正常的生埋平衡状态。

6）促生长因子 体外培养细胞除需要上述营养成分外．同样需要促进细胞生长的激素类物质，尤其是促细胞生长因子。如胰岛素能促使细胞利用葡萄糖和氨基酸。有促进有丝分裂作用．对很多细胞的增殖生长均有促进作用。氢化可的松对皮肤上皮细胞及乳腺上皮细胞增殆生长有很好的促进作用，还能提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克降形成率。血清中合有多种促细胞生长的因子。是体外培养细胞所需生长因子的重要来源。血清对体外培养细胞固然至要．但有不少国素可影响血清的作用．如供血名的年龄、血型、血色素、胆红质、脂肪酸等。

(1) 年龄 较老动物的血清对细胞生长有抑制作用。其抑制成分存在于血清的类脂质与蛋白质

部分。随着年龄的增加，血清卵磷脂含昆下降，而类脂质、蛋白质与抑制剂的浓度增加，对细胞生长不利。

(2) 血型。一般认为AB型血清比A型和O血清对细胞生长有利，原因不清。

(3) 血色素。发现低浓度的血色素可引起正常与恶性的鼠成纤维细胞的增殖，而高浓度的血色

素可产生抑制作用。因此在制备血清时，必须尽量避免溶血。

(4) 胆红质。低浓度一般对细胞生长影响不大，对有的细胞有抑制作用。因此在选血清时．也

应注意这个问题。

(5) 脂肪酸。血清中的脂肪酸的含最对细胞生氏有很大的影响。老年动物血清中脂肪酸的含量

较高；雌性动物血清中的脂肪酸的含量较雄性高。因此制备血清时应选择雄性幼年动物。

(6) 血清在培养液中的浓度并非越高越好。原则上是能达到维持细胞良好的生长和繁殖．又不

浪费。一般常用的比例是10％、20％和40％，随各类细胞的需求而定。

2、影响细胞生长的因素 6

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细胞在体外进行培养，失去了机体的调节和控制。因此，除满足营养的要求外，还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。

1）、温 度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37—38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；如把细胞置于25—25时，细胞仍能生存和生长，但速度减缓；若温度过低，在降到冰点以下时，细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚风等保护剂，封入安领瓶后，置于液氮中，可起保护作用，此时细胞可耐受一70℃以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。放在40℃数小时后，再置37培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱落于瓶壁。

2）. 渗透压 细胞在高渗溶液或低渗溶液中，可以立即发生级缩或肿胀、破裂。所以，渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与Nacl有关，但不能忽视其他电解质对渗透压的影响。理想的渗透压因细胞的类型及种族而异。人血浆渗透压为290 mmol／L，，被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290一300 mmol／L。人胚肺成纤维细胞为250一325 mmol／L，鼠则为310mm01／L左右。在实际应用中，260一320 mmol／L的渗透压可适于大多数细胞。

3）.气体环境和pH 体外培养细胞需要理想的气体环境。氧和二氧化碳是细胞生存必需的条件之一。氧参与细胞的三唆酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞征低氧条件下，可借糖酵解取得能量，但多数细胞低氧时很难生存。氧张力通常维持在略低于大气状态．若气分压超过大气中氧的含量对有些细胞可能有害。采用开放式培养时， —般要把细胞置于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中。

CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分．并与维持培养液的PH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下，细胞容易生长；一般不能低于1％，否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在PH 7．2一7. 4条件下生长，低于PH 6．8或高于PH7．6对细胞有害，甚至造成细胞退变或死亡。各种细胞对PH的要求不尽相同。 一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差，永生性细胞系和恶件细胞对PH的变动耐力强。但总的来说。细胞对碱件不如对酸性的变化耐受。偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，使培养基变酸，PH发生变化。所以、为了维持培养环境恒定的PH．多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的力法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2，但CO2易于逸出。故只适用于封闭式培养。开放式培养还是置于含有5%CO2的气体外境中为宜。

4）.无毒和无菌 无毒和无菌是体外培养细胞的首要环境条件。细胞在活体内．偶尔有细菌或有害物质入侵，因体内有强大的解毒系统和免疫系统，可将其解毒或清除，而不易受损害。但在离体的环境中。失去了防御系统，—但有害物质入侵或细菌污染，可导致细胞死亡，前功尽弃。如培养瓶皿、支持物、培养基、瓶盖、瓶塞等在选用这些器具、材料时要注意。若这些物品消毒不彻底，带茵或操作过程不小心使细胞污染，也会导致细胞死亡。

5）.辐射线和超声波

可见光的波长是390一780 nm。可见光的各种有色光能引起细胞退变，延长核分裂的间朗。还可显著降低细胞的附壁能力。因此，体外培养细胞应避免日光直接照射．最好在黑暗巾进行培养或短期存放。

紫外线 弱紫外线下耐受能力强的细胞变化不大，但对敏感的细胞有损害。紫外线强时，新分离的细胞显示：不能进行充全的有丝分裂；在有丝分裂时增加了脱水收缩，细胞质的起泡减少。 放射线 x射线对细胞有明显损伤。B射线可影响细胞核的分裂。Y射线使核分裂数减少并出现不正常的核分裂，可使细胞死亡。

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超声波和振动在超声波振动下，细胞很快会破裂，开始是胞质发生紊乱的流动，原生质胶体也有明显变化，若停止超声波振动可回复。当超声波在2．5W／cm2时，细胞受损，染色体发生畸变，首光发生畸变的是核染色体。

6）.细胞接种浓度 在体外培养细胞时，细胞接种数对细胞的生长有影响。适宜的接种密度，可以促使细胞增殖．接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。如果培养液与细胞的容积比例大于2000：1，生长物质弥散到细胞外的比例增加将使细胞内达到低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增值．培养液中的PH变碱．抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。如果接种密度大高．每个细胞周围培养液的容积降至o．oo 7mm3以下，细胞内生物活性物质的浓度增加，容易使排除物或其他代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，因此也会妨碍细胞的增殖。

如何选择适宜的接种浓度要根据细胞的代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定。一般来说，细胞代谢旺盛、生长速度快的细胞如肿瘤细胞，接种浓度宜偏低；而正常组织细胞生长较慢，代谢不够旺盛，接种浓度可偏高，如果是为了保种或不需急用，接种浓度可偏低些；有时为了便于观察细胞形态结构，接种浓度也可以适当降低。

二.原代细胞的培养与建系

凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10一20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。

1.原代细胞的取才 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步。若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养。取材的基本要求如下：

(1)取材要注意新鲜和保鲜：新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4—6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4C存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织血加入含lo％二甲基亚矾的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。

(2)取材应严格无菌：所取标本材料应在无菌条件下进行。为了确保无菌对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗生素培养液内于4C下存放2h以上。以确保所取材料无菌。所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。

(3)防止细胞机械损伤：取材和原代细胞制作时．耍用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

(4)避免组织干燥：要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。

(5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等：一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长、肿瘤组织较正常tK织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。

2. 原代细胞的分离和制作 人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密．不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖．即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长．若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来．常采用的方法如下：

1）悬浮细胞的分离方法 组织材料若来白血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料．最简单的方法是采用1000 r／min的低速离心10min。若悬液量大，可适当延长离心时间．但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞。

2）实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，出于细胞间结合紧密．为了使组织中的细胞充分分散形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

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机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织、部分胚胎组织可采用剪刀剪切，用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用9号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)．应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的侨连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞闭块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞恳液，接种培养后，纫胞容易贴壁生长。

1 酶消化分离法 常采用胰蛋白随和胶原酶，其分离方法如下

(1)胰蛋白酶分散技术；肤蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的态键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开．在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用．取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、PH以及消化时间的长短等。

①细胞类型：胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织。能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、 上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等无效．但若与胶原酶合用能增加其对组织的分离作用。

⑦酶的话力：市售的胰蛋白酶，其活力都经过测定证明有效，但配制时必须新鲜、需保存在低温冰箱中，消化时的PH和温度都要适宵．否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的话力有关，最终使用活力为1：200或1：250．在56℃、pH8．0时活力最强。

③酶的浓度：胰蛋白酶一般采用的浓度为o．1％一o．25％(活力1：200或1：250)，但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性。

④温度：一般认为胰蛋酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37进行消化比室温作用快。

⑦pH：消化分离细胞时PH只能选用7．6—8．o之间，否则对细胞有损伤。

⑦消化时间：如果细胞消化时间过长．可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代酣， 一般消化时间以20 mm为宜。

(2)胶原酶消化法：胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好。此曲消化作用缓和，无需机械振荡，但胶际酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

鉴于胶蛋白酶和胶原酶的生物学活性和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时有差异，以及两者价格不等。有人采用e原酶与胰蛋白酶并用，采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和免肝、癌组织非常有效。

2.非酶消化法[EDTA消化法]

EDTA是一种非酶消化物，又称整合剂，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0. 02％的工作液，对—些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成整合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，可与姨蛋白酶混合使用(1：1或2：1)，既利于细胞脱壁又利于细胞分散。可降低胰酶的用量和毒性作用。

3. 原代细胞的培养方法

原代细胞的培养也叫初代培养．是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胎系的第一步。

1）组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法是；为将剪成的小组织团块接种于培养 27

瓶(或皿)中．瓶壁可预先涂以胶原薄层．以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24h后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5—7d后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃夫，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下：

(1)按照的述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加人少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距o．2-o．5cm，一般在25mI培养瓶(底面积为17.5 cm 2)可接种20-30小块为好，小块放置后，轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上．然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2—4小时，待小块贴附后。将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败。若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不适宜多，以保持组织块湿润即可，培养24h后再补液，培养初期移功和观察时耍轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长．培养3—5d时可换液，一方面补充营养，一力面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

2） 消化培养法 该方法是采用而述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除．使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。

3) 悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞．如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无须消化，可采用低速离心分离。直接培养。

4）器官培养 器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养．其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活。器官培养的目的和技术均与单层纲胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察；并观察不同培养条件对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求：

(1)需要特殊的培养条件：因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给。因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和有养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。

(2)器官内部细胞需要柯足够的氧气渗入，常采用以下两种方法

①将器它组织块置于培养基气液面以利于气体交换。

②提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5％

CO2、以维持PH值。

4细胞的纯化和克隆

体外培养的细胞源于人或动物体内或胚胎组织，其体内的细胞都是混杂生长，每一种组织都有血管和间叶组织．因此，来源于上述组织的培养材料的原代细胞、传代细胞绝大多数呈混合生长．既有上皮样细胞，又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。

1）细胞的纯化 细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化。

自然纯化 即利用某一种类细胞的增值优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及目的来选择细胞。此法花费时间长，留下来的往往是成纤维细胞。仅有那些恶性变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。

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人工纯化 即利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。

1 细胞因子依赖纯化法 人和动物组织中某些细胞需要有特殊的细胞因子存在的微环境才能长期存话和生长繁殖，如IL—2是T细胞生长所必需的细胞因子，体外培养中淋巴细胞若加入IL—2就可使T细胞生长繁殖．形成IL—2依赖的T细胞系，如cTLL—2细胞株，而其他细胞则自然被淘汰。

2 酶消化法 是比较常用的纯化方法

如上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化：两者在胰蛋白酶的作用下，由于成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代细胞初次传代和早期传代中两种差别大为明显，故可采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。

3机械刮除法 原代培养时，如果上皮细胞和成纤维细胞为分区成片混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。可采用机械的方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域．

4 反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞能在短时间内(10—30 min)完成附着过程、而上皮细胞在短时间内不能附着或附着个稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。

2）细胞的克隆化（56-59医学细胞工程打印）

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【课时安排】

1.1细胞组织培养 30分钟

1.2细胞融台和单抗的杂交瘤技术 30分钟

1.3细胞拆合 40分钟

总计 2学时

【掌握内容】

1．细胞培养法

2. 无血清培养。

3．细胞组织培养污染的防治

4．淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术

5细胞拆合

【了解内容】

1培养物的传代。

2组织培养法

3动物细胞融合

【教学难点】

1. 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术

2. 细胞拆合。

【教学目标】

1.能够掌握淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术。

2.能够掌握克隆羊培育过程。

【教学内容】

三、细胞组织培养

经常有不少人将细胞培养与组织培养混淆，其实它们是有区别的。细胞培养指的是离体细胞在无菌培养条件下的分裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。而组织培养意味着取自动物体的某类组织，在体外培养时细胞一直保持原本已分化的特性，该组织的结构和功能持续不发生明显变化。

1 细胞培养法

培养动物细胞一般可按以下步骤进行：

无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。

以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。

将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子。

低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养。

由于绝大多数哺乳动物细胞趋向于贴壁生长，细胞长满瓶壁后生长速度显著减慢，乃至不生长。因此哺乳动物细胞的大量培养需提供较大的支持面。以下三种方法是专为大量培养哺乳动物细胞设计的：

（1）微导管培养法 将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成的外径不超过1mm的微导管平铺成层，根据设计由多层微导管构成培养系统的核心装置。整套微管床浸没于培养基中。动物细胞贴附生长于微管床表面。管内的无菌空气经扩散可进入营养液中（图3-6）。微导管表面的细胞密度可达每平方厘米100万个。

（2）微载体培养法 以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成与培养基比重基本相等的直径从几十微米到几百微米的固体小珠——微载体。将这些微载体与培养基混合均匀，通入无菌空气，动物细胞则贴附在微载体表面旺盛地生长，每毫升培养基可达到1000万个细胞的密度。

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（3）微胶囊培养法 本方法与前述植物人工种子类似。将一定量动物细胞与大约4％

的褐藻酸钠混合后，滴到CaCl2溶液中，彼此发生离子交换而逐渐硬化成半透性微胶囊。

可通过控制离子交换的时间调控微胶囊的刚性。细胞在微胶囊内生长，既可吸收外界营养，又可排出自身代谢废物。其最突出的优点是微胶囊内细胞及其产物可不受培养液中血清复杂成分的污染。

2 组织培养法

组织培养法与细胞培养法类似，主要区别在于省略了蛋白酶对组织的离析作用。其基本方法介绍如下：

无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。

3 以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成1～2mm小块，移入培养瓶。

加入合适的培养基浸润组织。小心地将培养瓶平翻180°，搁置15～30min，以利组织块的贴壁生长。

翻回培养瓶，平卧静置于37℃培养。

3 培养物的传代

悬浮培养的细胞只需定期吸移原培养细胞到新鲜培养基即可，比较方便。组织培养物的传代往往会遇到细胞贴壁生长的麻烦。在这种情况下可用物理法（培养液冲洗，刮刀刮取）或化学法（0.25％胰酶解析）剥离培养组织，视组织块大小进行适当切割后再漂洗、移置于新培养瓶。

4 无血清培养

上述细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清，不仅价格昂贵、容易混进污染物（包括病毒和细菌），而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。

无血清培养基由于必须包括血清中的主要有效成分，因此组成相当复杂，一般包括三大部分：①基础培养基，大多以DME培养基与Ham F12培养基等量混合为基础培养基；②基质因子，包括

纤粘素、血清铺展因子、胎球蛋白、胶原和多聚赖氨酸等；③生长因子、激素和维生素等约30种有机和无机微量物质，其中包括哺乳动物的绝大多数内分泌激素。

培养基配制繁琐是无血清培养的最大缺点。国外已有专用无血清培养基商品供应，如SFRE199-1和NCTC135等。

5 细胞的冷冻保存复苏技术 细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消能大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此。在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。

培养物的长期保存方法基本上有两大类：经典传代法和冷冻保存法。Carrel是经典传代法的创始人之一和杰出代表，他在极简陋的条件下每隔几天把鸡胚心肌细胞传代一次。在令人难以置信的长达34年的时间里成功地无菌传代3400次。经典传代法使培养物始终处于活跃生长状态，但手续较为繁琐，维持费用较高。

冷冻保存法具有操作简便、保存期长的特点。现以其中的液氮保存法为例简介如下：

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主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻储存器为液氟储存器．规格有历30L和50L两种。使用时要注意以下几点：—般2周需充液氮一次．至少1个月充氮一次。液氮温度达一196，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上。以免引起冻伤。液氮容器为双层结构，中间为真空层．瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。细胞冻存时常备的材料有：o．25％胰蛋白酶，含10％一20％的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油，2mI安领(或专用细胞冻存管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或冻存管架)等。

（1）将成熟培养物（细胞）与5％～10％的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中；

（2）缓慢降温（每分钟1～3℃）至-30℃；

（3）继续降温（每分钟15～30℃）至-150℃；

（4）转移至液氮冻存。可无限期保存。

若安瓿瓶置-70℃冷存，保活期通常只有几个月。在-90℃下培养物可保存半年以上。 细胞的复苏 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 6 细胞组织培养污染的防治

在进行细胞与组织培养的各个环节，都应如前所述十分重视灭菌与无菌操作。一旦发生染菌或交叉感染，抢救工作相当麻烦，而且还不一定能成功。对一般性细菌污染可试用氨苄青霉素（终浓度200μg／ml）或链霉素（终浓度200μg／ml）除菌。若霉菌蔓延，除小心地铲除菌落（丝）外，还应在培养基中加制霉菌素达 100μg／ml以抑杀散落的孢子、菌丝。支原体的感染令人棘手，即使以100μg／ml的卡那霉素处理后也只能抑制其繁衍而未能根除。有人建议用庆大霉素或去污剂加以清除。相比之下一般性的病毒侵染不一定得兴师动众加以围剿，因为它们在正常情况下不大影响细胞的生理功能和实验结果。

此外，细胞系株之间的交叉污染是一个值得重视的问题。一定要突出强调以下的规定：在一个工作区内不能同时放置两种以上细胞株，除非由于细胞融合等工作需要的暂时存放。同时，两种细胞株不能共用培养器具，即使器具消毒后也是如此。

总之，微生物污染与细胞株间的交叉感染是细胞、组织培养工作者必须时刻关注的问题。预防为主，防治结合是实验室工作的指导方针。

四、细胞融台和单抗的杂交瘤技术

1、动物细胞融合 细胞融合．即两个或两个以上细胞合并成一个细胞的过程。在自然情况下，受精过程即属于这种现象。近年来可用人工法将两个离体细胞在特殊诱导物的作用下使细胞膜发生一定变化，使两个或多个细胞发生融合．形成体细胞杂交，产生一个新的杂种细胞。细胞融合是研究细胞间遗传信息转移、基因在染色体上的定位、以及创造新细胞株的有效途径。动物细胞融合的途径有以下三条：

1） 病毒诱导融合

自从19xx年冈田善雄偶然发现已灭活的仙台病毒（HVJ，副粘液病毒的一种）可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合形成多核体细胞以来，科学家已证实，其他的副粘液病毒、天花病毒和疱疹病毒也能诱导细胞融合。仙台病毒诱导细胞融合的方法如下：

如果双亲本细胞都呈单层贴壁生长，则将它们混合培养后直接加入灭活的仙台病毒诱导融合即可。本方法虽然较早建立，但由于病毒的致病性与寄生性，制备比较困难；此外本方法诱导产生的细胞融合率还比较低，重复性不够高，所以近年来已不多用。

2）化学诱导融合

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19xx年高国楠用聚乙二醇（PEG）成功诱导植物细胞融合后，次年，Pontecorvo即用该法成功融合动物细胞。20多年过去了，PEG诱导融合一直成为动植物细胞融合的主要手段。对动物细胞而言，由于它们不具刚硬的细胞壁，它们的融合更加简便。关键在于亲本双方要有较明显可识别的筛选标志（基因和／或性状）。

动物细胞的PEG融合方法可参照前述植物细胞融合的PEG悬浮混合法进行。但由于动物细胞pH值多为中性至弱碱性，PEG溶液的pH值应调至7.4～8.0为宜。此外，尚可将细胞-PEG悬浮液进行适当离心处理，迫使细胞更紧密接触，提高融合率。不过此时PEG的分子量不宜过大，以1000左右为宜；浓度不能过高，达30％～40％即可，否则细胞难以离心沉降。加入5％～15％的二甲亚砜效果更好。

3） 电激诱导融合 方法参见植物原生质体电激融合。

细胞融合方式

(一)完整细胞之间的融合

将制备好的两种亲本细胞，在诱导剂作用下融合成的杂种细胞具有双亲的特性，保留了亲本完整的染色体，亦可能丢失亲本之—染色体。其基因型表达形式呈现多样性，可能会出现多种功能．这是生物变异的有效手段。单抗杂交瘤细胞即属于此种方式。

(＝)核体、胞质体与完整细胞的融合作用

细胞核连同其外表面薄层细胞质构成的颗粒称核体。而不具有细胞核的细胞称胞质体. 按完整细胞间的融合方式，将核体与完整细胞或与另一种细胞的胞质体融合，构成杂种细胞，

(三)微小细胞与完整细胞的融合

—个或几个染色体包裹一层细胞质的小体称为微小细胞。其制备方法为取对数生长期的细胞用秋水仙碱处理一定时间(与制备染色体类同)，以终止细胞分裂。此时细胞核分裂成若干个微核，每个微核由一个至数个染色体组成，然后用细胞松弛素B处理细胞、通过离心，使微核脱离细胞而形成微小细胞。

将微小细胞与另—完整细胞融合，使后者获得另一种细胞的染色体合子称微小细胞杂种细胞。本技术除可获得具有工业意义的杂种细胞外，对研究细胞染色体生物学功能也具商重要意义。

四)脂质体介导的细胞融合

将动物细胞匀浆破碎后可提取线粒体及溶酶体等细胞器，也可采用生化技术分离出DNA或mRKA的RT-PcR产物，将这些产物包装成脂质体，然后将脂质体与另一完整细胞融合．即可获得相应杂种细胞。通过转移细胞器所获得的杂种细胞可获得抗药性及抗毒性等遗传性特征。

在科学高度发达的今天，细胞融合已经比较容易做到，但这种融合的结果如何，一要经筛选，二要经检测才能清楚。与植物杂合细胞筛选的模式类似，动物杂合细胞筛选也可采用抗药互补性筛选和营养缺陷性筛选方法。此外也有人采用温度敏感突变等特征进行筛选。总之，细胞株具备愈多可识别的突变性状，以它为亲本进行细胞融合和筛选也就愈容易做到。细胞融合技术可在种内、种间细胞中进行，也可打破值物和动物界的疆域。如植物细胞的原生质体与人的HaLa细胞均已杂交成功。

2. 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术

淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术自19xx年问世以来，短短20几年取得了飞速的发展，几乎可以用这项技术获得任何针对某个抗原决定簇的高纯度抗体。因此单克隆抗体的应用范围已经扩大到了生物医学的众多领域，如免疫学、细菌学、遗传学、肿瘤学等，但目前主要利用其高特异和高纯度的突出优点大量应用于临床诊断方面。至今，据不完全统计，在美国用于免疫检测的单克隆抗体已占诊断检测项目的30％。到20xx年，其利润预计可达到100亿美元。 单克隆抗体产品之所以应用范围如此之广，产业兴起如此迅速，是由它本身的特点决定的。 众所周知，当某些外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质），即抗原进入动物或人体后，会刺激后者形成相应的抗体，引起免疫应答，从而将前者分解或清除。随着免疫学的深入发展，科学家们已经知道，每种抗原的性质是由其表面的蛋白类物质（决定簇）决定的。遗憾的是， 33

抗原表面往往有很多种决定簇，可以引发机体产生相当多种特异性抗体，这种情况给临床医学的诊断与治疗带来诸多不便。

哺乳动物和人体内主要有两类淋巴细胞：T细胞和B细胞。前者能分泌淋巴因子（如干扰素），发挥细胞免疫的功能；后者能分泌抗体，具有体液免疫的作用。由于外环境纷繁复杂，千差万别的抗原诱使B淋巴细胞群产生的抗体高达数百万种。不过每个B淋巴细胞都仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体。显然，要想获得大量专一性抗体，就得从某个特定B淋巴细胞培养繁殖出大量的细胞群体，即克隆。如此克隆出的细胞其遗传性质高度一致，由它们分泌出的抗体即叫作单克隆抗体。令人遗憾的是，B淋巴细胞在体外不能无限分裂繁殖。为了攻克上述难关，充分利用单克隆抗体纯度高、专一性强的优点，19xx年柯勒和米尔斯坦（Kohler＆Milstein）利用肿瘤细胞无限增殖分生的特征，将B细胞与之融合，终于获得了既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，在生物医学领域做出了重大贡献，由此荣获19xx年诺贝尔生理学与医学奖。

淋巴细胞杂交瘤技术的基本原理如下：

实验前数周分次用特异抗原免疫实验动物（小鼠），使其脾内产生大量处于活跃增殖状态的特异B细胞。杀鼠取脾制得含大量B细胞的脾细胞后，将鼠骨髓瘤细胞和脾细胞以聚乙二醇（PEG）法进行细胞融合。杂合细胞的选出是本技术的关键。B细胞天然地不能在体外增殖，而骨髓瘤细胞是所谓的HGPRT基因缺陷细胞，因此只有从淋巴细胞获得HGPRT基因等因子的骨髓瘤细胞才能在HAT选择培养液中生长。由于脾中具极多种B细胞，融合后也必然产生很多种杂合细胞，因此必须对筛选得到的杂合细胞高度稀释后进行单细胞培养，待其增殖成一个细胞群体（克隆）后，用特异技术分别检测它们产生的抗体，从中挑出能产生所需单一性抗体的杂合细胞，即杂交瘤细胞，这就是所谓的二级筛选法。此外还应注意，杂交瘤细胞是准四倍体细胞，遗传性质不稳定，随着每次细胞有丝分裂，都可能丢失个别或部分染色体，直到细胞呈现稳定状态为止。因此在建立杂交瘤细胞系的过程中要经常检查，存优汰劣。

获得较稳定的单克隆杂交瘤细胞后，可将它们注射入哺乳动物（小鼠）腹腔，然后从腹水中分离、提取单克隆抗体；或者将它们移到培养瓶或生物反应器中培养，再从培养液中回收产生的抗体。

淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体的技术方兴未艾，必将在21世纪得到更大的发展。

五 细胞拆合

从不同的细胞中分离出细胞器及其组分，在体外将它们重新组装成具生物活性的细胞或细胞器的过程称为细胞拆合。细胞拆合的研究大多以动物细胞为材料，其中尤以核移植和染色体转移的工作令人瞩目。

4．1 核移植

生物学家进行细胞核的移植试验基本上出于两方面的目的：①研究异种核质之间遗传相互关系；②探讨已分化细胞核的遗传全能性问题。现简述如下：

（1）异种核质关系研究本项研究 的杰出代表是中国的童弟周教授和美籍华人牛满江教授。他们早在60年代就开展了鱼类核移植工作。他们取出鲤鱼胚胎囊胚期细胞的细胞核，放入鲫鱼的去核受精卵中，结果有部分易核卵发育成鱼。经检查，这些鱼确为杂种鱼。它们的口须和咽区象鲤鱼，而脊椎骨的数目却象鲫鱼。侧线鳞片数为中间类型。血清及血红蛋白的电泳分析都支持杂种鱼的结论。此外他们还进行了草鱼与团头鲂等组合的核移植实验，均得到杂种鱼。它们有的为中间性状鱼，有的则偏象某一亲本。杂种鱼的性状与供核亲本鱼类似，这种现象无可非议。而对于所出现的中间性状，人们众说纷纭，难道细胞质里具有某种遗传物质，能插到新移进来的异种细胞核的基因组中，并真正发挥了作用？这是盛行的细胞核遗传理论难以解释的。异种核质关系的研究是一个充满生机与挑战的领域，正等待科学家去开拓与耕耘。

（2）细胞核遗传全能性的研究 除了原核细胞以外，所有真核生物细胞都有细胞核（个别种类已分化的细胞，如人红细胞除外）。那么，处于个体发育各个时期（如胚胎期和成年期）的细胞，履行不同职责的细胞（如乳腺细胞和小肠上皮细胞），它们细胞核的遗传潜能是否一样？是否还具有遗传全能性？生物学家对此进行了孜孜不倦的探究。

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19xx年，Briggs成了研究细胞核遗传全能性的第一人。他将豹纹蛙囊胚期细胞的细胞核取出，送入去核同种蛙卵中，部分卵发育成个体；而他从胚胎发育后期、蝌蚪、成蛙细胞中取出的细胞核进行类似的实验却都以失败告终。从此我们知道，胚胎早期（囊胚期）细胞是一些尚未分化的细胞，其核具有发育成完整个体的遗传全能性；而胚胎后期乃至成体的细胞已出现明显分化，其核已难以重演胚胎发育的过程。然而19xx年南非科学家Gur-don的实验却取得了突破。他首次将非洲爪蟾体细胞（小肠上皮细胞）的胞核取出，植入到经紫外线辐射去核的同种卵中，竞然有1.5％的卵发育至蝌蚪期。虽然实验没有取得完全的成功，但至少提示了体细胞核仍具有遗传全能性，是可能去分化而重新发育的。不过由于科学技术发展水平的限制，利用体细胞核发育这条途径屡遭挫折，多数生物学家转向以未成熟胚胎细胞克隆动物的领域，并很快取得成效。19xx年Ⅲmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。随后，19xx年Willadsen用未成熟羊胚细胞核克隆出一头羊。进入90年代，利用幼胚细胞核克隆哺乳动物的技术几近成熟，世界许多国家和地区，如美国、英国、新西兰、中国、台湾等纷纷报道克隆成功猴、猪、绵羊、牛、山 羊、兔等。

不过最让生物学家和全世界震惊的重大突破是英国PPL生物技术公司罗斯林（Roslin）研究所的维尔穆特（Wilmut）博士19xx年2月27日在世界著名权威杂志《Nature》宣布的用乳腺细胞的细胞核克隆出一只绵羊“多莉”（Dolly）的消息。“多莉”的诞生，既说明了体细胞核的遗传全能性，也翻开了人类以体细胞核竞相克隆哺乳动物的新篇章。此项技术因而荣登美国《Science》周刊评出的19xx年十大科学发现的榜首。仅仅过了一年半，19xx年7月5日，日本人就喜迎了叫作“能都”和“加贺”的两头克隆牛犊的降生。它们是用母牛输卵管细胞的细胞核克隆成功的。几乎与此同时，一组科学家在美国檀香山宣布，他们已用经卵泡细胞的细胞核克隆成功的小鼠“卡缪丽娜”再克隆出了下一代。祖孙三代22只克隆鼠组成的大家庭具有完全一致的遗传基础。随后，德国和韩国的科学家也相继宣布用体细胞成功克隆出哺乳动物。综上所述可见，几个世纪以来人类梦寐以求的快速、大量繁殖纯种动物的夙愿，在本世纪结束之前正在变成现实。

克隆风云 （改造生命之州）

克隆是当前最为热门的科学话题之一。自从19xx年报道了克隆羊诞生的消息，世界各国报刊媒体就连篇累椟地谈论着克隆技术的是是非非，克降迅速成为世界注目的焦点，科学家更是为之振奋。在短短的几年时间内，克隆技术突飞猛进，克隆羊、克隆鼠、克隆牛、克隆猴??一批克隆动物相继诞生，人们甚至跃跃欲试克隆人，从而引发了激烈的争论。

那么，究竟什么是克隆?克隆技术是天使还是魔鬼，是福音还是灾难?要回答这些问题，我们还是要从多莉诞生说起。

19xx年7月5日，在英国罗斯林研究所——一家专业从事家畜繁育的研究所，诞生了一只绵羊。它雪白的面孔，灰白色毛绒绒的卷毛，看起来与当地盛产的山地绵羊无异。但它的创造者——英国著名的科学家维尔穆特和坎贝尔，为这只小羊的诞生而激动万分，因为这是一只非同寻常的绵羊，凝聚了维尔穆特整整23年的心血和汗水。几个月后，当这项研究成果正式发表后，立刻在全球范围内刮起了前所未有的克隆风暴。英国的自然杂志是全世界最为著名的研究刊物，每周出版，具有发表重大研究成果的悠久历史，上面的每一篇论文都会引起从事相关领域研究的科学家的重视，每一期的出版都会引起英国主要媒体的关注，其中的一些工作还会受到报道和评论。这是科学家心目中的圣殿，论文一旦在上而刊出，就意味着该研究工作被国际同行认可其重要性。

19xx年2月27日的这一—期引起的关注，确实是异乎寻常的。根据该刊惯例，刊物的标题及主要内容在正式出版前一周，已先行送达各大媒体，这样，在刊物正式出版的当天，媒体就可以同时发表它们评论和观点。

那么，“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢？现简介如下。

上述克隆过程看似简单，其实，成功地进行核移植就重复了277次，占易核卵总数的63.8％；培养这宝贵的易核卵时，仅有约十分之一（29个）具有活力，能生长至胚胎发育的桑椹期或囊胚期。把这29个早期绵羊胚分别植入13只代孕母羊子宫中，最终仅产下一羔——“多莉”。 35

如此低的成功率，既说明了实验的艰难，更反映出技术上的不成熟。19xx年日、美、英、意四国科学家克隆“卡缪丽娜”小鼠的“檀香山技术”就放弃了电刺激法而采用化学刺激法，促进外源细胞核与卵细胞质的融合，将克隆成功率提高到2％。

19xx年2月克隆“多莉”羊的新闻轰动了世界。如果说当时还有一些人持怀疑态度的话，那么现在随着“能都”和“加贺”等多头克隆牛的问世以及克隆鼠的再克隆成功，用体细胞而不是用早期胚胎细胞的细胞核克隆哺乳动物，已经成了广为科学界和普通群众接受的事实。这项登上世纪顶峰的成就必将对21世纪生命科学、医学以及农学等诸多领域产生重大的影响，如：①遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物（人）生长、发育、衰老和健康等机理的研究。②有利于大量培养品质优良的家畜。③经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官。④科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆，即借腹怀胎的新领域，这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。

回眸动物克隆史，我们清楚地看到了从利用早期胚胎细胞到成年体细胞的飞跃。在此基础上，克隆人已经不再是科幻小说中的故事了。今年（1998）初，美国哈佛大学理查德·希德一宣布他的克隆人计划，立即招来全世界一浪高过一浪的反对呼声。1月12日，欧洲19国联合签署了禁止克隆人的协议。我国政府以及美、英、德、日也已明确表示反对。然而这位69岁的博士称，克隆人“只不过是人类生育的另一项先进技术”。他计划把自己的细胞核与损献者的卵相结合后，再将这个胚胎植入他妻子格洛丽亚的子宫，以期生下他的复制品。目前全世界都以关切的目光注视着希德的举动和美国政府的反应。另据报道，韩国科学家已于最近克隆成功人的早期胚胎，但摄于法律的约束，又主动将她销毁了。正像核能的开发具有截然相反的作用那样，人类对克隆自身应采取十分慎重的严肃态度。

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