薄层色谱实验

一、        实验目的：

1、了解薄层色谱的基本原理和应用。

2、掌握薄层色谱的操作技术。

二、实验原理：

1、原理

薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之间进行分离。由于各种化合物的吸附能力各不相同，在展开剂上移时，它们进行不同程度的解吸，从而达到分离的目的。

2、薄层色谱的用途：

1）化合物的定性检验。（通过与已知标准物对比的方法进行未知物的鉴定）

 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱中呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用薄层色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。

2、快速分离少量物质。 （几到几十微克，甚至0.01µg）

3、跟踪反应进程。在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失，来判断反应是否完成。

4、化合物纯度的检验（只出现一个斑点，且无拖尾现象，为纯物质。）

此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。

三、实验装置

 

   

薄层板在不同的层析缸中展开的方式                                                                                                       

四、实验操作步骤：

1、吸附剂的选择

薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。

1）、硅胶：

“硅胶H”—不含粘合剂；

“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；

其颗粒大小一般为260目以上。颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。

化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而R_f值较小。

酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃

本实验选择的吸附剂为薄层色谱用硅胶G。

2、薄层板的制备（湿板的制备）

薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。薄层应尽量均匀且厚度要固定。否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。在烧杯中放入2g硅胶G，加入5—6ml  0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。本实验用此法制备薄层板4片。

3、薄层板的活化

将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110℃活化30min。氧化铝板在200℃烘4h可得到活性为Ⅱ级的薄板，在150—160℃烘4h可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。活化后的薄层板放在干燥器内保存待用。

4、点样

先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。若在同一板上点几个样，样点间距离应为1。点样要轻，不可刺破薄层。

5、展开

薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算Rf值。

6、显色

被分离物质如果是有色组分，展开后薄层色谱板上即呈现出有色斑点。

如果化合物本身无色，则可用碘蒸气熏的方法显色。还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。

对于含有荧光剂的薄层板在紫外光下观察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。

本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。

五、实验内容：

1、检验甲基橙的纯度。（通过与已知标准物对比的方法检验物质是否纯净）

实验样品：甲基橙粗品（自制）、甲基橙纯品。

溶剂：乙醇：水=1：1 

展开剂：丁醇：乙醇：水=10：1：1

2、混合物的分离

实验样品：圆珠笔芯油

溶剂：95%乙醇

展开剂：丁醇：乙醇：水=9：3：1（体积比）

3、1%偶氮苯、1%间硝基苯胺、荧光黄(95%乙醇, 1mg/1ml)、次甲基蓝、环己烷:乙酸 9:1

五、实验关键步骤：                                     

1、载玻片应干净且不被手污染，吸附剂在玻片上应均匀平整。

2、点样不能戳破薄层板面，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm。

3、展开时，不要让展开剂前沿上升至底线。否则，无法确定展开剂上升高度，即无法求得Rf值和准确判断粗产物中各组分在薄层板上的相对位置。

六、思考题

1、  如何利用Rf值来鉴定化合物？

2、薄层色谱法点样应注意些什么？

3、常用的薄层色谱的显色剂是什么？

七、习题：

1、实验报告

2、思考题

预习： 有机未知物的鉴定（2）

 

第二篇：实验六 薄层色谱层析

实验六薄层色谱层析

一、实验目的

1、学习薄层色谱法的原理和方法；

2、学会利用薄层色谱分离提纯有机化合物的规范操作；

2、掌握比移值的计算方法；

3、了解比移值的影响因素。

二、实验原理

基本原理：利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。

分类：柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱、 液相色谱

薄层色谱(thin layer chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。依其所采用的薄层材料性质和物理、化学原理的不同，可分为吸附薄层色谱、分配薄层色谱、离子交换薄层色谱和排阻薄层色谱等。

吸附薄层色谱采用硅胶、氧化铝等吸附剂铺成薄层，将样品以毛细管点在原点处，用移动的展开剂将溶质解吸，解吸出来的溶质随着展开剂向前移动，遇到新的吸附剂，溶质又会被吸附，新到的展开剂又会将其解吸，经过多次的解吸-吸附-解吸的过程，溶质就会随着展开剂移动。吸附力强的溶质随展开剂移动慢，吸附力弱的溶质随展开剂移动快，这样不同的组分在薄层板上就得以分离。

一个化合物在吸附剂上移动的距离与展开剂在吸附剂上移动的距离的比值称为该化合物比移值Rf

 

薄层色谱是在被洗涤干净的玻板（10×3cm左右）上均匀的涂一层吸附剂或支持剂，带干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，凉干或吹干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。

    展开剂是影响色谱分离度的重要因素。一般来说，展开剂的极性越大，对特定化合物的洗脱能力也越大，一般常用展开剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油醚<己烷<甲苯<苯<氯仿<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙酸。

三、主要试剂和材料

蒽、香草醛、芴酮及其混合物；薄层层析硅胶G；薄玻璃板；环己烷：乙酸乙酯（5：1或6：1）；0.5%羧甲基纤维钠(CMC-Na)水溶液；毛细管(内径小于1mm)

四、实验装置

五、实验步骤

    在洗涤干净的玻板（15×3cm）上均匀地涂上一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，晾干或吹干后，置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将板取出，干燥后喷以显色剂或在紫外灯下显色或直接观察。

制板（简易平铺法）

（1）二块15×3cm玻片，洗净，控水

取7.5cm×2.5cm载玻片4块，用去污粉搽洗，再用水淋洗，最后浸入无水乙醇中，取出晾干。取用时手指只可接触载玻片的边缘，不能接触载玻片两面。

（2）调糊：3g硅胶G和8mL0.5%羧甲基纤维素钠水溶液在小烧杯中搅匀。在50 mL烧杯中，放入约3g硅胶，加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液8mL，调成糊状。

（3）铺层：用牛角匙将此糊状物倾倒于上述玻璃片上，用食指和拇指拿住玻璃片，做前后、左右振摇摆动，反复数次，使流动的糊状物均匀地铺在载玻片上。每组铺二块。

（4）活化：将已涂好硅胶G的薄层板放置在水平的长玻璃片上，室温放置0.5 h后，移入烘箱，缓慢升温至110 ℃，恒温0.5 h。取出稍冷放入干燥器中备用。

点样：

（1）画线——起始线和前沿线
　　（2）毛细管点样——斑点大小和斑点间间距。用内径小于1mm的毛细管取样品溶液，在距离薄层板底端8~10mm处，垂直地轻轻接触薄层板，斑点直径要小于2mm，一块薄层板可点2个样品，注意保持一定的距离，但斑点不能太靠边。

展开：展开剂选择；展开方法——倾斜上行法。取一有盖的广口瓶作色谱器，加入展开剂（用环己烷︰乙酸乙酯=3～5︰1），展开剂高度不要超过5mm，以免淹没斑点，然后将已点好样品的薄层板放入色谱器中，盖紧，等展开剂上升到接近薄层板上沿时，打开盖子，迅速用铅笔或小针在前沿作一记号取出，晾干。

显色：直接观察并量取a、b值，计算比移值。先用肉眼观察有无可见的斑点，然后放在紫外线分析仪下观察荧光斑点，并用小针轻轻勾划斑点的轮廓，最后放入盛有碘片的瓶中进行显色。

样品：蒽、香草醛、芴酮及其混合物

【操作要点及注意事项】 

    1、调浆时要将硅胶加到CMC-Na中，以免生成太多的团块,浆液要有一定的流动性，稠度以能沿玻棒成细线性下滴为宜。

    2、铺板时一定要铺匀，特别是边、角部分，晾干时要放在平整的地方。

    3、点样时点要细，直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上，浓度不可过大，以免出现拖尾、混杂现象。

4、展开用的烧杯要洗净烘干，放入板之前，要先加展开剂，盖上表面皿，让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上升到距上端0.5－1cm时要及时将板取出，用铅笔标示出展开剂前沿的位置。

    5、制板和活化：铺板厚度0.25-1mm且均匀；晾干；一块一块铺；活化时烘箱要从低温开始
　　6、点样：画线时不能将板划破；点样斑点直径小于2mm，斑间距1-1.5cm，标准左样品右；点样结束干燥后再进行下一步
　　7、展开：展开剂用环己烷：乙酸乙酯混合物（5：1或6：1）
      一般原则：根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素考虑。溶剂的极性越大对样品的洗脱力越强。
　　8、显色：照原样画出斑点形状
　　9、要求在原始记录中画出板的真实展开情况并计算Rf值

六、实验结果