不育症诊疗中计算机辅助精液检查与精子形态分析研究

张文博

枣庄市市中区人民医院检验科 277101

【摘要】目的：探析不孕症诊疗中计算机辅助精液检查与精子形态的分析效果。方法：选择已育男性50例为对照组，不育男性100例为观察组，对比分析检查结果。结果：观察组的各项指标与对照组比较有统计学意义（P<0.05）。结论：计算机辅助精液检查与精子形态分析可以为不育症诊疗提供有效依据。

【关键词】不育症、计算机辅助精液检查、精子形态

【 abstract 】 objective: to explore infertility diagnosis and treatment of computer-assisted semen and sperm morphological analysis results. Methods: select children men 50 cases as control group, 100 cases of infertile men as the observation group, contrast analysis of test results. Results: each index in observation group were better than control group, with statistical significance (P < 0.05). Conclusion: computer-assisted semen and sperm morphological analysis can provide effective basis for infertility diagnosis and treatment.

【 key words 】 infertility, computer-assisted semen, sperm morphology

不育症是临床上比较常见的一种疾病，对患者的生活质量造成严重影响。计算机辅助精液检查（CASA）是筛查男性不育的一个有效手段，可以对精液的质量进行检查，判断患者不育的原因，为临床上制定针对性治疗方案提供有效依据[1]。因此，本文探讨了不孕症诊疗中计算机辅助精液检查与精子形态的分析效果，如下报道。

1.资料和方法

1.1一般资料

选择已育男性50例为对照组，不育男性100例为观察组。其中对照组年龄22~50岁，平均年龄为（35.3±8.7）岁；观察组年龄23~52岁，平均年龄为（35.5±8.8）岁。两组的年龄等资料比较无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1采集标本

采集标本前2~7d，叮嘱检验者严禁性生活，通过手淫的方法，在一次性采精杯中留取精液标本，完成标本采集后，轻轻摇匀，待其充分液化后再进行检测。通常标本性状包括pH值、精液量、液化时间、颜色以及黏稠度等。

1.2.2方法

1.2.2.1CASA方法

精液充分液化后，在精子计数板舱中放入4μL标本，运用SCA全自动精子质量分析系统对标本的平均速度（VAP）、精子密度、线性指数（LIN）、振动指数（WOB）、曲线速度（VCL）以及活动力进行检测。检测的过程中，一定要重视质量控制，选择多视野、多角度进行分析，拍摄代表性较强的图像。

1.2.2.2精子形态学分析

运用Diff-Quick法染色和拉薄技术，严格按照相关操作要求分析精子形态学，分为三个部分，分别是尾部畸形、中部畸形以及头部畸形。同时在100倍油镜下对200个精子形态进行观察，并对结果进行记录。

1.3统计学分析

本次实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，其中组间数据资料对比采用t检验，计数资料对比采用卡方检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1两组的精液参数对比

两组的前向运动精子、精子密度以及精液量比较有统计学意义（P<0.05），而总活动率和

pH值比较无统计学意义（P<0.05），如下表1所示。

表1 两组的精液参数对比 组别 对照组（n=50） 观察组（n=100）

精液量（ml） pH值 3.8±1.2 3.1±1.1

7.29±0.10 7.21±0.20

精子密度

（106/ml） 73±29 61±35

前向运动精子（%） 56±15 35±17

总活动率（%） 67±17 62±18

2.2两组精液运动参数比较

两组的WOB、LIN以及VAP比较有统计学意义（P<0.05）；而VCL比较无统计学意义（P>0.05），如下表2所示。

表2 两组精液运动参数比较 组别

VCL（μm/s）

WOB（%） 46±4 58±4

LIN（%） 44±5 34±4

VAP（μm/s） 36±3 21±5

对照组（n=50） 37±8 观察组（n=100） 38±8

3.讨论

近年来，不育症在我国的发病率呈现出逐年上升的趋势，在导致不孕的诸多因素中，女性占40%左右，男性占30%~40%左右。有研究表明，男性精液质量有所下降，其原因与不良生活方式和环境恶化等因素有关，而精液质量与不育症的发生率呈现出反比关系，即精液质量越低，发病率越高[2]。西班牙SCA精子质量分析系统通过正相差原理，运用专业图像传感器对高清晰的原始动图进行采集，实时提取运动图像序，能够准确对阈值进行识别，将杂质和精子区分开来，对非精子成分和精子进行分辨，计算精子密度，并且对精子移位在单位时间内的关系进行分析，将一系列参数计算出来，充分反映精子运动特征，从而为临床诊断提供准确依据[3]。在本次研究中，与对照组相比，观察组的前向运动精子比例、精子密度和精液量均较低，说明精液质量降低是诱发男性不育的一个重要因素。同时，精子的动态参数能够将精子的细微运动特点客观反映出来，对男性生育力进行客观评价，并且与受精率有着密不可分的联系[4]。在本次研究中，观察组的WOB、VAP以及LIN等参数均低于对照组，提示观察组患者的精子在运动方面存在一定的问题，即精子运动的前向性、速度以及线性等都比较异常，可能是导致患者不育的一个原因。由此可见，在男性不育症诊疗中，结合精液常规检查与精子动态参数分析，能够对精液质量进行客观、准确地了解，更全面的对男性生育能力进行评估，一方面可以使男性不育症的诊断率提高，另一方面还能为临床上制定针对性治疗方案提供有效依据，具有一定的推广和运用价值。 参考文献：

[1]袁平庆. 计算机辅助精液分析精子运动参数在体外受精中的应用[D].南方医科大学,2013. [2]宋丽君,陈碧,彭彩玲. 计算机辅助精液检查及精子形态分析在不孕症诊疗中的运用[J]. 实用医技杂志,2013,02:133-134.

[3]孙超,徐志鹏,石亮,戴玉田. 不育症患者精子DNA碎片化指数与精子常规参数关系的研究[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2011,04:565-567+570.

[4]王晓岚,罗德梅,巩晓芸. 计算机辅助精液分析在不孕症诊疗中的应用价值探讨[J]. 新疆医科大学学报,2010,02:201-202.

 

第二篇：精液分析规范

精液常规分析的质量保证

《临床检验杂志》徐建平精液分析必须有质量控制

男科实验室必须为正确诊断和卫生保健决策提供可靠的

结果。由于精液分析高度复杂，操作难以标准化，因此必须进行质量控制（QC）以发现并纠正形态误差和结果的高度变异性。

比他实验室之间在纠正浓度、活力和系统性评价上的巨大差异，使强化质控和标准化的需求更加迫切。

质量控制的目的

常规精液分析中质控的目的是检测并尽可能降低随机误差和系统误差的程度。必须是这些误差最小化，从而使实验结果尽可能的接近真值，是结果可信并被临床医生和研究人员使用。

执行质量保证项目的重要性

每个实验室无论规模大小，都应该在标准化方法和操

作的基础上执行质量标准（QA）项目，一保证结果的准确性和精确性。无论如何，纠正浓度、系统性和活力等基本参数应该始终有内部质量控制的监控，可能的情况下还应该参加外部质量控制。

精液分析相关的质量保证

从男科医师写精液分析申请单起，到男科实验室发出精液检查报告止，为了控制此间可能出现的各种误差，男科实验室所采取的行政和技术上的各种有效措施，包括质量控制的措施，称作精液常规分析的质量保证，是整个男科实验室质量保证的主要部分。

质量标准计划的核心

精液常规分析欲得到可接受的结果，需要知道并实施一个

连续性的质量标准项目，对实验室提供的数据定期进行检测和评价，预防、检查、修正出现的问题。

质量标准项目必须在质量手册（QM）中描述，内容包括标

准操作程序（SOP）和一套关于实验室操作程序和方法的详细指南。指南包括一系列表格和文件。

使用CASA也要制定SOP

有关精液常规分析的SOP内容很多，涉及许多细节，每个实验室需

分别对浓度、活力、形态学制作SOP。为叙述的方便，把三者共同的部分合在一起讨论。一些操作细节WHO第5版已详细描述，这里只突出重点作为提醒。各实验室应根据自身的质量控制目标，制定相应的SOP。

由于我国多数实验室使用精子分析仪（CASA）进行精液分析，下

面所陈述的SOP主要针对仪器而言。

浓度与活力、形态学SOP：精液采集

禁欲的时间：

待做精液常规检查者的禁欲天数规定为2-7天。

实验室人员应对准备采集精液标本者细心交代相关注意事项。

采集室：

尽量靠近实验室，最好是在实验室隔壁，通过有私密性保障的传递窗传递标本。

精液的收集：

采用一次性广口容器为采精器皿，保证精液没有丢失。

采精器皿最好呈漏斗形，与带盖的离心管相连，防止污染，有利于热的传递。操作人员应对标本做好标记，核对送检者的信息。

浓度与活力、形态学SOP：精液体积的测量

准确测量精液体积是获得一次射精的精子总数准确性的关

键步骤。操作人员收到精液标本后应立即连带容器一起称重，然后将容器置于37℃恒温条件下等待精液液化。

采用WHO第5版推荐的天平称重法计算精液体积。天平应具有自动去皮功能，以减少去皮的人为误差。天平的精度要达

0.01g，保证精液体积的精确度达0.1ml的标准。天平每年必须校验一次，并做好校验记录。。

浓度与活力、形态学SOP：液化、外观、PH

1）            精液如果再39分钟内不液化，不要开始进行精液分析，而是在等30分钟。如果60分钟后仍为液化，应采用机械处理

或应用菠萝蛋白酶消化。

2）            PH值应在液化后的同一时间测量。

3）            在精液液化的同时观察其外观并做好记录。

浓度与活力SOP：显微镜

使用5版推荐的相差显微镜，相差显微镜这种能够将精液

中的大部分杂质与精子区分的高级光学系统，使精子头部发光，杂质却与普通生物显微镜一样显示为灰色，这样可以过滤掉大部分的杂质。

显微镜要每天擦拭干净，结束油镜观察后要及时清洁镜头。每年至少用对中望远镜对相位环校验一次，并做好校验记录。

浓度与活力SOP：精子计数板

必须使用生产过程有质控措施和品质管理的精子计数板 ，需要有计数池深度检测报告。

建议使用的计数板的深度应符合以下标准：

10μm±0.5μm 间隙平行度标准：

多点检测的最大值和最小值误差小于0.5μm

计数板使用前要清洗干净(可使用洗涤剂和超声波清洗机)，确保没有灰尘或水痕影响计数板的深度及背景。

计数板的深度每6-12个月必须校准一次，并做好校验记录。

浓度与活力SOP：37℃恒温条件

1）            精液采集后应迅速送抵实验室，并立即置于37℃水浴箱或金属浴多孔保温块内。

2）            精子计数板在使用前至少放在37℃恒温预热台上预热10分钟以上。

3）            最好使用专门适合相差显微镜使用的精子计数板专用恒温载

物台。

浓度与活力、形态学SOP：精液的混匀和抽样

1）      精液在取样用于检测前，应充分混匀标本。可使用二维摇动器

而不能使用漩涡震荡器。

2）      每份标本要重复抽样，在每次取样前都要再次混匀标本。

3）      只有在重复取样的结果一致时才认可此测定值。

检查足够多的精子减少抽样误差

每个实验室都要权衡专家精液分析精确度与世界花费几检测人

员疲劳导致准确性下降之间的利弊。检测精子浓度与活力，每次至少检测200条精子，抽样误差是7%，若抽样在查200条精子，则合并抽样误差小于5%，可以达到WHO第5版的要求。形态学检查比较耗时复杂，最少每次检查100条精子（误差为10%），重复检查的合并抽样误差可以更小些。

因为要减少抽样误差而增加数倍的工作量，在人员无法增加

时，唯一的出路是使用合符要求的CASA。

取样和加样时注意的SOP细节

许多操作细节必须在SOP中予以规定，如：

●稀释精液时抽取的样本量要大于0.5ml，使样本具有代表性。

●做浓度与活力检测时加样的量要严格控制在5μl，太少会产生气泡。

太多会增加精液浮力而影响计数池间隙的准确性。

●样本滴加到计数池后要将计数板继续放在预热台上静置30～60秒，减少液体流动的影响。

●精子有趋热和趋光的特性，采用发热的卤素灯做显微镜的光源时，整个检查时间最好在1～2分钟内结束，同时可避免液体蒸发对精子浓度的影响。

计数时注意的SOP细节

●若使用CASA做浓度检测，每份标本在正式检查前应该先在显微镜下使用网格计数板初略评估一下大致浓度，对于浓度超过50×10⁶/ml 的标本一定要稀释，最好用同标本的精浆稀释或用培养液稀释。

●CASA可能会把一些面积与精子头类似的杂质误判成不动精子；由于精子浓度过高且活力较强时发生的精子碰撞现象增加，被撞的不动精子易判成活动精子，而主动碰撞的精子会在碰撞前后易被判成2 条精子。

●最好利用计数板盖板上的网格预先规定检查视野，减少人为选择视野造成的随机误差。

●对于边框压线的精子数下不数上，数右不数左。

精子特别稀少甚至没有时的SOP

●当精子浓度＜5×10⁶/ml时，应检查3mm×3mm网格范围甚至整个

计数池。

●对疑似无精子的标本，应该将1ml标本离心（3000g15分钟）后

检查沉淀物，在任一重复样本中观察到精子，提示隐匿精子症；如果两个样本都未观察到精子则提示无精子症。

形态学SOP：染色剂与温度的稳定性

●每个实验室做精子形态学分析时必须固定一种染色方法，分析结果

才有可比性。

●染色液的质量有有保障，来源一定要稳定。染色剂盒应按要求妥善保管、储存和正规使用。记录每批次的批号。每次启用新的瓶装染色液时，应实验室保留的标准染色片进行比较，以期发现和分析可能存在的问题。

●染色温度对染色效果的影响很大，往往不能通过延长染色时间来弥补，所以一年中的染液温度（使用时）应该恒定，且最佳温度是

25-30℃，使用恒温染缸可以达到保温的效果，但应提前2-4小时开启电源，以保证染液温度的均衡性。

形态学SOP：染色方法和时间

●为保证染色效果的一致性，两次取样分别制作的2张涂片，要背靠背地同时染色。

●认真记录每瓶染液的染色玻片数，到规定的上限时要及时更换整瓶染液，不可新旧染液同时使用。

●要使用秒表等计时工具，不能凭经验数数。

●尽量快速沥干玻片上的残留染液，减少上一种染色剂对后道程序的影响。

●绝不能把已经染好的涂片放在水龙头下冲洗，水流过大会导致整体染色背景变浅，尤其是精子尾部成像模糊或变细。要用均匀的方式（如尖嘴塑料瓶）对称轻柔地冲洗2张涂片。

检测数据要经过95%可信区间检验

●可以通过WHO第5版推荐的统计学计算公式进行计算（先进的CASA 能够自动计算），进行两个样本均数差别的检验。

●将两次检查结果直接查表（WHO第5版表2-5，表2-1），判断差异是否可以接受。

●如果实验室的技术人员都经过严格的SOP培训，或使用能自动检验95%可信区间的CASA，在每天工作的始末，对第1份标本和最后

1份标本进行检验，是工作量太大的单位的一种简约式选择。

精液分析的IQC

精子浓度、活力和形态学等基本参数应该始终有内部质量控制

（IQC）的监控。执行IQC的实用方法是购买独立机构的商品化质控品。这些质控品不应该来自本身有临床任务的单位，以保证公正和确保产品有专门的企业标准、品质管理和质量控制的保障。这些质控品的靶值和已知变异范围应附报告，详细说明靶值的获得方式，每批次的数量、各自的编号、生产日期、有效期等信息。

男科实验室可用质控品标称的范围来评价自己工作的准确性。

浓度质控品：微球悬浮液

●微球悬浮液也称质控珠。可以配合计数板上的网格进行人工计数的培训。

●使用质控珠可以校验CASA对精子的捕捉功能，CASA的捕捉率应达 99%以上。质控珠不能判断CASA对杂质的误捕情况（对此应选用背景相对差的冷藏精液质控标本）。

●质控珠的标称浓度以25×10⁶/ml左右为宜。过高浓度的质控珠容易产生微球聚集的现象而影响浓度的准确性。

●定期（如一周一次）用质控珠对CASA的捕捉率进行校验，可同时调整使用相差显微镜时的习惯亮度、聚光镜的位置等，把达到最高捕捉率时的条件固定下来。

活力质控措施：视频录像

●人工分析精子活力可以采用WHO推荐的用摄像机拍摄视频录像，通过重复播放视频录像来重新评估精子的活力。

●越来越多的CASA采用了＞50帧的高速率步进式CCD，改变了拍摄多

幅照片再描绘精子运动轨迹的旧设计思路，软件的升级使新型

CASA具备了视频录像功能，可以实时记录精子的运动轨迹，永久储存，随时重复回放，创造了人工校验CASA活力分析质量的基本条件。

视频录像的分析

●在分析视频录像时，WHO推荐的方法是：将一个醋酯膜栅格覆盖在视频监视器上，模拟用显微镜分析时目镜中的栅格。

●实际上可以利用计数板上的精确的网格（1小格边长为0.1mm），

测量出显示屏上相应的长度，再按此比例制作网格胶片，覆盖在显示屏上，用彩色笔先确定不动精子，再确定前向运动精子，最后确定非前向运动精子。人工评估可以重复，也可以和CASA的分析结果进行比较。

形态学质控措施：网格定位片

●使用WHO推荐的网格定位玻片制作实验室的系列染色精子质控片，供重复使用确定操作人员或CASA的评估水准和准确性。

●购买独立机构生产的商品化的质控涂片，其制作过程有质量控制，定位精子都附有各参数的检测数据，可提高重复阅片的精确性，但要特别注意此种质控片的染色方法要和实验室的染色方法一致，且都有一定的保质期，需要定期更换。

●实验室在每天开始形态学检测工作时，首先阅读质控涂片，记录分析结果并与对应的标准数据进行比较，超出可信区间的结果要进行误差来源分析。

形态学质控措施：制作DVD

WHO第5版推荐制作DVD用于评估精子形态学，但只能是辅助方法而不能替代对精液样本的重复评估。

CASA也可以自带刻录软件，可以把每份标本储存的全部图像

都记录在DVD中，这种质控的方法不仅有利于图像的长期保存，更有利于培训或学术交流。这不仅是监督实验室形态学分析质量的方法，也是形态学外部质量控制的重要方法之一。

浓度与活力检测报告的规范

●要有一次射精的精子总数、前向运动精子总数等WHO第5版特别强调的参数指标。

●采用WHO第5版各参数的第5百分位数作为参数值下限。

●当检查的精子总数不足400条时要按计数的精子数报告取样误差的百分率。

●以重复抽样的经过差别统计学检验后的均值出报告。如果采用单次检测结果，应于注明。

●低于2×10⁶/ml的精子浓度若仅用于普通临床检测目的可以统一报告精子浓度＜ 2×10⁶/ml就足够了。

形态学检测报告的规范

●对异常精子的分类有非常重要的临床意义，各种形态学异常都应该有百分率统计报告。

●大多数CASA不能对精子尾部作出判断，需要人工补充评估或修正，没有尾部分析结果的报告是有重要缺陷的。

●推荐采用WHO第5版各参数的第5百分位数作为参数值下限。

●当检查的精子总数不足400条时要按计数的精子数报告取样误差的百分率。

●以重复抽样的经过差别统计学检验后的均值出报告。如果采用单次检测结果，应于注明。

制作Xbar(举例）

制作活力、形态学Xbar

?         除了定期用已知靶值的质控珠做浓度的监测外，用已知靶值的冷藏精液标本做浓度监测也是可行的方法。如果是使用CASA检测标本，则应先对CASA（包括计数板）的质量和性能进行检验，否则容易在“错误” 的基础上得出“在控”的结论而忽略了系统误差的存在。

?         活力和形态学的Xbar都是按百分率计算的，在统计学中已经详细介绍了。要注意的是：活力Xbar要以百分比最高的参数为目标，一般情况下是不动精子（IM）。由于异常精子形态种类繁多，目前尚无明确的参数阈值，所以形态学Xbar一般以正常精子形态的百分比为目标。

各实验室之间的外部质量控制

实验室的外部质量控制（EQC），在国外一般由独立的中心机构牵

头发放精液分析的质控样本，参加EQC的实验室需制定参与外部质量评价的程序，对质控样本的处理和保存、检测过程、结果报告时间等进行详细的规定，确保能够遵守EQC的要求。各实验室应采取与常规测试一样的程序检测该中心机构提供的样品，并实事求是地参与外部质量评价活动，如实回报检测结果。

独立的中心机构需客观地评价各实验室对发放的精液质控标本的检测结果，对数据的离群值进行检查并计算均值和标准差，从而对参与实验室的精液分析质量给出评价鉴定。

外部质量控制的目的

●外部质量控制（EQC）是监测分析结果的完整质控程序的一部分。

而外部质量保证（EQA）则监控着与样本收集和结果报告有关的所有实验室程序，以确保实验室程序在控。

●EQC可以评价各实验室精液常规分析的准确性，使实验室之间的结果得到比较，也能以一种在单个实验室无法实现的规模对不同方法进行评价和比较。

●EQC包括同行比较和能力验证程序。通过外部质量评价可以发现实验室存在的系统误差，得以纠正后便可明显提高精液分析的准确度。

实验室组织结构表（举例）

实验室工作人员岗位职责表（举例）

实验室工作记录表（举例）

实验室人员培训计划表（举例）

SOP手册（目录举例）

?         1.标本验收和保存的标准

2.精液标本的安全处理

?         3.精液黏稠度的评估

?         4.精液外观

?         5.精液pH值

?         6.显微镜初检

?         7..精确测量精子浓度与活力分析（CASA）

?         8.特殊精液标本的处理方法：

?         9. 实验报告的保存和发放

?         ……

质控品使用记录(举例）

微球悬浮液（质控品） 批号：购买日期     有效期

各种报告单汇总

仪器保管责任人一览表(举例）日期

染色液使用记录和更新记录表

技术人员Sbar汇总

EQC的参与条件尽可能一致

●EQC的评价程序：

根据作为组织者的中心实验室详细要求的标准操作程序进行，在执行前要比较原先执行的自行制定的SOP，对不符合要求的地方进行改进。

●按照自己的SOP去检测EQC中心的质控品是有缺陷的，因为不同的SOP无法进行可信、可重复的有价值的比较，除非是为检验不同方法专门设计的EQC项目。

IQC是EQC的前提

● 每个实验室必须先实行IQC，且认真执行“检查足够多的精子”和 “进行95%可信区间检验”的统计学原则，才有资格参加EQC，随便组织几个单位共同检测一种质控品的做法不是真正意义上的EQC,

至少不能给予参加单位有积极的反馈意见。

●EQC样本要按规定处理，如及时将检测几个报告给中心实验室等；

并要做好保存记录。

结语

?         我国开展精液分析项目的单位很多，但男科实验室开展精液分析

质量控制的却是一小部分。即使开展精液分析质控多年的实验室，很可能对照5版方法还有可以改进和提高的地方。

?         如同其他检验项目一样，精液分析的质量控制势在必行，虽然难度很大，但事关人口素质、种族繁衍、环境评估和毒理药理研究等，应该引起我们的充分重视。

谢谢