化验室

培 训 教 材

第一节：乳的概念及基础理论

一．概念：牛乳是乳牛为哺育幼牛而从乳腺分泌的一种白色或淡黄色不透明微有甜味的生物学液体，是一种全营养物质。

二．成分：乳是各种化学物质的混合物，其成分有水、蛋白质、脂肪、碳水化合物各种矿物质和维生素，还含有酶类及其他微量成分等。

    乳中所含有的水分大部分是以游离状态存在，成为乳的胶体体系的分散媒。碳水化合物和矿物质呈溶液状态存在，形成真溶液；脂肪以脂肪球状态呈乳浊液和悬浊液分散在乳中，成为乳浊质。蛋白质以极细的微胶粒状态呈悬浊质、乳浊质存在于乳中，成为胶体溶液。乳就是以真溶液、胶体溶液和乳浊液三种体系组成的一种均匀的生物学液体，其稳定性相当高。

正常牛乳中的各种成分大体上是稳定的，但受乳牛的品种、个体差异泌乳期、年龄、饲料、季节、气温、挤奶状况及健康状况等因素影响而有所不同。基中变化最大的是脂肪，其次是蛋白质，乳糖和灰分变化较小。

一般将牛乳分为水分和乳固体两大部分，而乳固体又分为脂质和非脂乳固体。牛乳的主要成分如下表。

三．营养：

牛乳是一种全价的营养品，含有人体所需的各种成分。乳脂肪不同于一般脂肪，含有的脂肪酸种类较一般脂肪多。这是与反刍动物瘤胃中微生物的生物合成相关的。乳脂肪中水溶性、挥发性的脂肪酸含量高，这类脂肪风味好易于消化。乳中蛋白质含量较高，机体的运动便是源于蛋白质的支持。蛋白质水解的最终产物是氨基酸，氨基酸是构成细胞的基础物质。乳糖的甜度是蔗糖的1/4~1/6，是哺乳动物和人类乳腺所分泌的一种特有化合物，在动、植物的组织中几乎不存在，仅存在于乳中。

维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类低分子化合物，在人体内几乎不能被合成，完成需要通过食物来摄取。牛乳中含有几乎所有已知的维生素。牛乳中还含有丰富的矿物质及其他微量元素。

四．牛乳的物理化学性质：

1．     牛乳的色泽：新鲜的牛乳一般呈乳白色或淡黄色。乳白色是酪蛋白酸钙、磷酸钙及脂肪球对光的反射和折射产生的；脂溶性的胡萝卜素和叶黄素、水溶性的核黄素使牛乳呈淡黄色。

2．     牛乳的滋味和气味：新鲜的牛乳具有特殊的香味。牛乳的气味主要成分有低级脂肪酸、羰基化合物及挥发性成分。甲硫醚是风味的主要成分。牛乳的滋味是微甜味，微酸味、微咸味及苦味四种滋味混合在一起组成的。

3．     牛乳的冰点：牛乳冰点为-0.53~-0.55℃，平均为-0.542℃牛乳中掺水会导致冰点回升，掺水10%，冰点约上升0.054℃。因此可根据冰点的变化来推算掺水量。

4．     牛乳的沸点：牛乳的沸点在1个大气压下约为100.55℃。乳在浓缩过程中沸点继续上升，浓缩到原体积的一半时，沸点约上升到101.05℃。

5．     牛乳的密度与相对密度：乳的密度指在20℃时的质量与同体积的水在4℃时的质量之比。正常乳的密度平均为1.030。相对密度是指某物质的重量与同温度同体积的水的重量之比。以15℃为标准，乳的相对密度为1.032。乳的密度随温度的变化而变化。在10~25℃内，温度每变化1℃，乳的密度相差0.0002。

6．     牛乳的粘度：牛乳的粘度在20℃时为1.5~2.0mPa·s。

7．     牛乳的酸度：正常牛乳的酸度为16~18。T，pH值为6.4~6.8，pH值低于6.4的酸度一般为酸败乳，pH值高于6.8的乳可能是乳房炎乳。

第二节    生产工艺

一．       工艺流程：

二．       生产中应注意的问题：

1．     收奶中应注意的问题：不得混入过多的空气。（微生物、脂肪）

2．     各工艺过程：搅拌、均质、巴杀、闪蒸、贮存、配料、UHT、无菌灌装等。

3．     脂肪上浮的机理：

   牛奶中脂肪的密度约为930kg/m3，而牛奶的密度为1028~1032930kg/m3，因此牛奶中脂肪上浮是一种自然现象。根据斯托克公式，其上浮速度为：

  其中：v：上浮速度

        dp：乳脂肪直径

        ρ1：奶的密度

        ρ2：脂肪的密度

        υ1：奶的粘度

    由此可见，脂肪的上浮速度和乳脂肪球直径的平方成正比，而未均质奶的乳脂肪直径平均为3—4微米，均质后直径可达0.2微米，大大降低了脂肪球的上浮速度，因此均质的效果将直接影响脂肪的上浮。

脂肪上浮产生的原因：

1．     很明显，不良的均质效果将很快导致脂肪上浮，因此，保证良好的均质效果是防止脂肪上浮的必要条件，但总结近年来成品脂肪上浮的原因却并非由于均质效果不良引起的，而是由下述原因引起的。

2．     原料奶的细菌数或嗜冷菌过高。脂肪球外覆着一层脂肪球膜，主要由磷脂、蛋白、微量金属元素及结合水等组成，球膜内充满各种自由脂肪酸。若原料奶中的细菌数过高，成其是嗜冷菌数过高，其代谢产生产部分脂肪酶和蛋白酶可存活于超高温灭菌中，分解脂肪球膜，使自由脂肪酸游离出来并聚合在一起，从而导致脂肪上浮。

3．     过度的机械处理。乳脂肪的熔点从-7.9℃至69.3℃，一般情况下，经中度的机械处理不会破坏脂肪球膜。但如果在低温下经过度的机械处理，如：高速搅拌、往复循环等，由于低温下乳脂肪的可塑性差，脂肪球很容易被破坏，从而使脂肪酸游离，导致脂肪上浮。

4．     低温下均质。如在低温下均质，乳脂肪呈固态，在强大的机械力作用下，不易形成完整的脂肪球膜，反而加速了自由脂肪酸的结合。

5．     原料乳在接收和预先处理过程中混入过多空气。

6．      

第三节        检验计划

一．       原辅料检验计划

二．       过程检验计划

三．       成品检验计划

第四节        化验室的安全操作

一．废弃物的处理：酸、碱的处理必须用大量的水冲入下水道；氰化物须单独处理；强氧化剂和强还原剂不能和有机化学药品放在一起。

二．意外事故的处理：出现意外事故时要沉着冷静，临危不惧，及时抢救，要勇敢，更要有科学态度。

1．     火灾：出现火灾时，要立即切断电源，并使用灭火器材，同时与有关部门联系，请求援助。水是较常用的灭火材料，但化验室起火时，是否用水来灭火要十分慎重，因为有些化学药品比水轻，会浮在水上流动，反而可能扩大火势；有的药品会与水反应发生燃烧甚至爆炸。

2．     触电：遇到触电时，首先应该使触电者迅速脱离电源，但不能徒手去拉触电者，以免抢救者遭电击，应迅速用绝缘物切断电源。将触电者抬至空气新鲜处，如情况不严重，能在短时间内自行恢复知觉。若已停止呼吸，应进行人工呼吸同时给氧。

3．     割伤：割伤时，若有玻璃碎屑混入伤口的，必须立即取出。将伤口清理干净后，在伤口上涂抹红药水或龙胆紫药水，再用消毒纱布包扎。

4．     烫伤或烧伤：如皮肤只出现红痛或红肿，可涂以95%的酒精并浸湿纱布盖于伤处或用冷水止痛；如皮肤起泡，除以上方法外，还可用3%~5%的高锰酸钾涂抹并用纱布包扎；如组织破坏，皮肤出现黑色、棕色或白色，需用消毒纱布后去医院治疗。注意不要把烫伤引起的水泡弄破，以防止感染。

5．     化学灼伤：化学灼伤时，应立即脱掉衣服，清除皮肤上的化学药品，并用大量干净的水冲洗，再用消除这种有害药品的特种溶剂处理。

A．              如被碱类灼伤，需立即用大量的水洗涤，然后用醋酸溶液（20g/l）冲洗或撒硼酸粉。

B．              如被酸类灼伤，需立即用大量的水冲洗，然后用NaHCO3的饱和溶液冲洗。

C．              如果眼睛受到化学灼伤，最好的方法是立即用洗涤器的水流洗涤，避免水流直射眼球，也不要揉搓眼睛。用大量的细水流冲洗后，如果是碱灼伤，再用20%硼酸溶液淋洗；如果是酸灼伤，则用3%碳酸氢钠溶液淋洗。

 第五节  质量保证的基础知识

一．       各英文缩写的意义

1．     QA： quality  assurance   质量保证

2．     QC:   quality  control     质量控制

3．     GMP:  good  manufacturing  practice   优质生产规范

4．     GLP:  good   laboratory   practice      优质实验室规范

5．     HACCP:   hazard  analysis  and  critical  control  point        危害分析与关键控制点

6．     IDF:  international  dairy   federation    国际乳品联合会

7．     UHT：ultra  high  temperature   超高温

8．     AQL: accept  quality  level    产品可接受质量水平

9．     AQL的定义：在超高温产品生产中，最重要的产品质量缺陷是由各种微生物原因引起的产品坏包。因此，产品可接受质量水平在实际生产中被定义为特定规格的产品在正常的连续生产中所得的由微生物残留引起的坏包数量和生产成品总量之间的比例，即可接受的最大坏包率。

二．       实验室的相关理论

1．     药品的分级：

A．作为标定的基准物质，必须为优级纯，简称GR；

B．分析纯试剂：简称AR，为理化检验常用试剂；

C．化学纯试剂：简称CR，可用于微生物检测中；

D．              实验试剂：简称LR，由于纯度较低，一般较少采用。

三．标准：

1．国家标准：GB/T、GB

2．地方标准：DB

3．商业标准：SB

4．企业标准：QB

第六节   牛乳的理化检验方法

一．几种常见的指示剂的变色范围

二．几种常用的洗涤液的配制

三．脂肪的检测：

1．盖勃法：

A．原理：盖勃法是一种容量法。用硫酸把乳制品中以酪蛋白钙盐形态存在的酪蛋白转变为可溶性的重硫酸酪蛋白化合物与不溶性的硫酸钙，溶解脂肪球膜，把脂肪释放出来。异戊醇的加入是促进脂肪的分离。

B．仪器和设备：

乳脂计、乳脂计胶塞、乳脂计架、10.75ml的移液管、10ml的刻度吸管、1ml的刻度吸管。

C．试剂：

1）硫酸：密度为1.820—1.825g/ml

2）异戊醇：分析纯（空白试验为0）

D．测定步骤：

1）在乳脂计中加入10ml硫酸；

2）移取10.75ml的液体乳样缓慢放入乳脂计中，使乳样浮在硫酸上面，不和硫酸发生混合；

3）加入1ml异戊醇，旋好塞，混合时，乳脂计会变得很热，为防止烫手，可用毛巾包着混合，直到没有奶块；

4）将乳脂计塞朝下放入离心机中，离心4—5分钟；

5）取出乳脂计，放入水浴锅中水浴5分钟后读数。读数时要将脂肪柱的下弯月面放在与眼同一水平面，观察时可移动胶塞使脂肪柱的下弯月面与某一大格刻度相吻合。

E．结果表示：脂肪的含量为乳脂计刻度管中脂肪柱上下弯月面的读数差，两次测定的结果误差不得超过最小刻度值的一半。

F．说明：

1）在酸法盖勃法测定脂肪中，应注意硫酸浓度。其密度为1.820—1.825，浓度为90—91%。如果硫酸浓度过高会使蛋白碳化，读数困难。硫酸浓度过低，水相与脂肪相之间分离不好，脂肪就测不出来。所以硫酸的比重一定要掌握好。

2）异戊醇的作用一是促进磷脂从蛋白质中分离，二是有利于游离脂肪从水相中分离。若异戊醇中存在杂质，可能会导致结果偏高。可以蒸馏水代替牛奶来进行空白试验：在乳脂计中摇匀后，将脂肪计静止24小时，如果在乳脂计内上部没有油层或油珠析出，证明此异戊醇可使用。

3）硫酸浓度较大，使用时要注意安全。

2．罗兹—哥特里法：

  这是一种基准方法，属仲裁法。

A．原理：用氨水来处理牛乳，使酪蛋白钙盐成为易溶解的盐，促进脂肪球—乙醚的作用，加入乙醇，使一系列的能被酒精浸出的物质留在水相中，利用乙醚将脂肪从牛乳中抽出，加入石油醚使乙醚不被水饱和。将醚层倒入收集瓶中，后使乙醚和石油醚挥发掉，就可以得出剩在脂肪收集瓶中的样品的脂肪的重量。

B． 仪器设备：

1）分析天平

2）离心机：可以500—600r/min，80—90 g加速离心毛氏抽脂瓶，使毛氏瓶的外顶端的离心加速度为80—90 g。

3）振摇器：以80—120下每分的频率摇混毛氏抽脂瓶中的液体。

4）蒸馏或挥发设备：使脂肪收集瓶中的醚和乙醇能在低于100℃的条件下挥发掉。

5）烘箱：带合适温度计，箱内工作空间内温度控制在102±2℃。

6）毛氏抽脂瓶：形状要符合要求并需配软木塞。软木塞平常要一直浸泡在蒸馏水中，所用水要每天更换。第一次使用的软木塞需用乙醚至少浸泡60分钟，再浸泡在水中。

7）毛氏抽脂瓶架。

8）吹瓶：适于使用混合醚。

9）脂肪收集瓶：125—250ml锥形并或250ml左右、直径80—100毫米、高约为50毫米的平底不锈钢皿。

10）  刻度吸管：2ml、5ml、10ml、25ml。

C．试剂：所有试剂都应是分析纯的，所用水至少应是蒸馏水。使用新试剂测定前，应进行空白试验以检验试剂的质量。空白试验中的残留物不得大于0.5mg。若大于0.5mg，则需对100ml的乙醚和100ml的石油醚分别测试。分别测试中的残留物不得多于0.5mg。

1）   氨水：NH3的质量浓度为250g/l。

2）   乙醇：体积分数不低于94%。

3）   刚果红：将1g刚果红溶于水，稀释到100ml。

4）   乙醚：不含过氧化物，不含抗氧化剂或含量低于2mg/kg，满足试剂空白试验的要求。

5）   石油醚：沸程30—60℃，满足试剂空白试验的要求。

6）   混合醚：等体积乙醚和石油醚混合，不可久存。

D．测定步骤：

1）脂肪收集瓶的准备：将干净的脂肪收集瓶在烘箱中至少烘1小时。取出脂肪收集瓶在天平室内冷却至室温（要防止灰尘，玻璃瓶至少要冷却1小时，金属皿至少要冷却半小时）。冷却时为避免不完全冷却，脂肪瓶要放在干燥器中，称取脂肪收集瓶的质量，准至0.1mg。称量时要带手套或使用夹子。

2）样品的称取和抽提准备：

a.用10ml或10.75ml吸管将样品移入置于分析天平上的毛氏抽脂瓶内，直接称取10—11g，准至0.1mg。

b.          加入2ml250g/l或更浓的氨水，在小球内混合均匀。加完氨水后，应将实验一直作完，不得停顿或延误。

c.将抽脂瓶放入65±5℃水浴中保温15—20分钟，不时摇晃，然后取出，用自来水冷却至室温。

3）空白试验：在测定的同时进行空白试验，用10ml水代替样品，其他同样品测定。

4）加入10ml乙醇，混好。允许流体在小球和大柱之间流动，只是要避免液体过于接近瓶口。加入两滴刚果红溶液，混好。（刚果红的加入是为了使醚层和水层更易于分辨，不加也可以）。

5）加入25ml乙醚，塞紧塞后，以小球朝上的位置放置于振摇器上摇混1分钟，或两手分握抽脂瓶的两端，以相同位置和振幅摇混1分钟。小心地拔掉塞子，用少量混合醚淋洗塞子和瓶口，使淋洗液都流入瓶内。

6）加入25ml石油醚，塞塞，在振摇器上摇半分钟。

7）把毛氏抽脂瓶带塞离心1—5分钟。如果没有离心机，则可将抽脂瓶置于支架上放置30分钟以上，至醚层和水层完全分开。

8）小心地拔掉塞子，用混合醚淋洗塞子和瓶口，让淋洗液流入瓶内。如果醚层和水层的分界面低于小球的上接口面，需沿瓶壁缓慢地加水，使界面上升。

9）拿住抽脂瓶的小球，小心并尽可能完全地将醚层倾入已称好重的脂肪收集瓶中，要避免将水层的液体倾入收集瓶中。用混合醚淋洗抽脂瓶口的外部，让淋洗液流入收集瓶中。

10）  在抽脂瓶中加入5ml乙醇混好。用15 ml乙醚，１５ml石油醚进行第二次抽提，加入后分别振摇１分钟和半分钟。然后如7、8、9那样分层、倾倒。

11）  重复10的操作，只是不再加入乙醇，进行第三次抽提。脂肪含量低于0.5%的液体样品的第三次抽提可以免去。

12）  用混合醚淋洗脂肪收集瓶的瓶口和内壁后，将收集瓶内的醚和乙醇尽可能地挥发掉。

13）  把脂肪收集瓶置于102±2℃烘箱内烘1小时，冷却1小时后称量，然后再将脂肪收集瓶置于烘箱烘中烘半小时，再取出冷却半小时后称量，重复此操作，直至两次称量的差值小于0.5mg。

14）  为验证抽提出的物质是否完全溶解，在收集瓶中加入25ml石油醚，稍稍加热、旋动至脂肪完全溶解。如果抽提出的物质完全溶解于石醚中，则就第13步获得的质量与空瓶的质量差作为抽提出的脂肪的质量。如果抽提出的物质不能完全溶于石油醚中，或怀疑不溶于石油醚中，需用石油醚将收集瓶中的脂肪完全抽提出来，共抽提三次，每次待石油醚分层后，倾出醚层，保留不溶物，用石油醚淋洗瓶口。最后一次，还要用混合醚淋洗瓶口外部。挥发瓶中残余的醚，再将收集瓶在102±2℃烘箱内烘1小时，冷却称重。

E．结果的表示：

脂肪的含量以质量分数表示为：

式中：w：样品脂肪的质量分数，%

      m0：称取的样品量，g

      m1：脂肪收集瓶和抽提出的物质的量，g

      m2：空脂肪收集瓶的重量，或第15步测得的瓶加不溶物的重量，g

      m3：空白试验中收集瓶和抽提出的物质的量，g

      m4：空白试验中收集瓶的重量，或第15步测得的瓶加不溶物的重量，g

结果准至0.01%。重复性：同一分析人员在短时间内对同一样品进行的两次测定结果差不得超过0.02%。

注意事项：

1．提纯用乙醚和石油醚是影响结果的关键因素，应对每一瓶试剂进行纯度检验，或干脆对所有乙醚和石油醚用封闭的旋转蒸发器进行提纯。

2．抽脂瓶用塞子一定要用软木塞。软木塞要软硬合适，大小合适。每次使用完后一定要浸泡在蒸馏水中，浸泡塞子用水要每天更换。

3．水浴保温时，每隔3—5分钟要摇混一次，以保证充分反应。

4．下列情况下无法得到真实的脂肪含量结果：

1）液体已出现了脂肪分离；

2）能闻到游离脂肪酸味；

3）样品准备过程中或准备以后，瓶壁上有白色颗粒或油滴浮在液体样品表面。

四．蛋白质的检测：(凯氏定氮法，此法为标准分析方法)

1.原理：牛乳中加入浓硫酸加热消化，硫酸分解为亚硫酸、水和氧，有机物质被氧氧化为二氧化碳和水，初生氧将氧化蛋白质，最后生成硫酸铵。（具体如下：样品中含氮有机物经浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水，然后，有机物炭化生碳；碳将硫酸还原为SO2，本身则变成CO2；SO2使氮还原为NH3，本身则氧化为SO3，而消化过程中生成的氢，又加速了的NH3形成。在反应过程中，生成物水和SO3逸去，而NH3则与硫酸结合成硫酸铵，留在溶液中）硫酸铵在碱性条件下，释放出氨，用硼酸吸收。用标准酸液滴定，计算出总氮量，进而计算出蛋白质。

2．仪器： 

a.通风橱

b.  凯式定氮瓶

c.  凯氏定氮蒸馏装置

3．试剂：   a.硫酸铜—硫酸钾（1：15）：分析纯

          b.2%硼酸溶液

          c.0.1%甲基红乙醇溶液

          d.0.5%溴甲酚绿乙醇溶液

          e.40%氢氧化钠溶液

          f.0.05N盐酸溶液

4．操作步骤：

   消化：精密吸取10ml液体样品称重，移入干燥的500ml定氮瓶中，加入3.2g硫酸铜—硫酸钾（1：15）混合催化剂及25ml硫酸使样品全部浸泡在消化液中，防止样品粘附瓶颈上部。稍摇匀后，将瓶以45度角斜支在电炉上，微火加热，小心瓶内泡沫冲出影响结果。当样品炭化变黑产生泡沫时要减小火力，勿使黑色物质上升到凯氏定氮瓶颈部，当泡沫完全停止，消化液均匀沸腾后，加大火力，直至瓶内容物的颜色逐渐成透明的淡绿色后继续消化0.5-1hr，若凯氏烧瓶壁上粘有炭化粒时进行摇动，或待瓶内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下继续消化0.5hr直至完全透明为止，放冷，加蒸馏水约10ml放冷后，移100ml容量瓶中加水至刻度，混匀备用，同时作空白试验（除不加样品外其余消化步骤一致）

   蒸馏：检查定氮装置各连接部分不漏气，在水蒸汽发生瓶内装水约2/3加硫酸使水呈酸性目的使水中的NH3不致蒸出，加数粒玻璃珠以防爆沸，加热煮沸定氮蒸汽蒸馏瓶的水。吸取10ml样液于定氮蒸气蒸馏瓶中，用洗瓶冲洗管壁将塞用水封好，在冷凝器的下端入置一个盛有10ml硼酸、2滴混合指示剂的250ml锥形瓶。使冷凝器下端的玻璃管正好在液面下，一切准备好后将约10ml140%氢氧化钠慢慢加入蒸馏瓶，一切准备好后，通入蒸气进行蒸馏，蒸馏至锥形瓶内液体内液体在约100-125ml时即用蒸馏水冲洗冷凝管下端，将洗液一并收集于锥形瓶内，蒸馏途中不得停火断气，否则发生倒吸。

   滴定：使用微量滴定管以0.05N的盐酸溶液滴定锥形瓶中的溶液，使之由蓝绿色滴定至紫色为止，同时做空白试验。

5．计算：X=[（V-V0）*M*0.014/（m*10/100）]*F*100

       X---样品中蛋白质的含量

       V---滴定时样品消耗盐酸标准溶液的体积ml

       V0---滴定时试剂空白消耗盐酸标准溶液体积ml

       M---盐酸标准溶液的当量浓度

       F---氮换算为蛋白质的系数    牛乳：6.38

   清洗：蒸馏前，要将蒸馏装置清先至少3次，实验完毕后也要清洗3-4次

五.蔗糖含量的测定（参照GB5413-85）

1．原理：

   根据糖的还原性的测定法，叫做还原糖法。此法可用来测定葡萄糖、果糖、麦芽糖和乳糖等还原糖。蔗糖是非还原糖，须经过盐酸水解后用还原糖法测定。常用的试剂是费林试液，用此试剂测定糖的方法称莱茵—埃农氏法。此法为标准分析法。

   乳糖是还原糖，它与费林氏甲乙液混合溶液中的酒石酸钾钠铜反应，以次甲基蓝作指示剂，最终生成乳糖降解物（还原糖降解物）和红色的氧化亚铜沉淀。稍过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色的隐色体。为了避免隐色体被空气中的氧所氧化，而又显示蓝色，必须使整个过程在沸腾着的溶液中进行，以便驱除液体中的空气。

2．仪器：1）250ml三角瓶（蒸馏水洗净烘干）

         2）酸式滴定管（0-50ml、0.1ml精确度）

      3）250ml、100ml容量瓶

      4）5ml、50ml移液管

3．试剂

3）      20%的乙酸铅溶液，取20g乙酸铅溶解于100ml水中

4）      草酸钾-磷酸氢二钠溶液，取草酸钾3g，磷酸氢二钠7g溶解于100ml的水中

5）      费林试液（甲液及乙液）：a）甲液，取34.639g硫酸铜溶于水中，加入0.5ml浓硫酸加水至500ml；b）乙液，取173g洒石酸钾钠及50g氢氧化钠溶解于水中，稀释到500ml，静止两天后过滤

6）      1%次甲基蓝溶液

7）      1：1盐酸

8）      30%氢氧化钠溶液

9）      0.2%甲基红-乙醇溶液：取0.2g甲基红溶于100ml20%乙醇溶液中

4．费林试液的标定

    1）用乳糖标定

       称取预先在95℃烘箱干燥2hr的纯乳糖约0.75g（准确至0.2mg）用水溶解稀释至250ml，用10ml费林试液甲液、乙液各5ml）按5.2)和5.3)操作,最后用乳糖液滴定至终点按式8和9求出测乳糖时费林试液的校正值(fl)

  Al=V1*gl*1000/250=4*V1*gl……8

  Fl=4*V1*gl/Al1………………….9

  式中:A1---实测乳糖数mg

   V1---滴定时消耗配制乳糖液量ml

   gl---称取乳糖重g

   Al1---由乳糖液滴定毫升数,查表4所得的乳糖数mg

 2)用蔗糖标定

称取105℃烘箱中干燥2hr的蔗糖约0.2g(准确到0.2mg)用50ml溶解并洗入100ml容量瓶中,按10.4.2)操作,得出滴定10ml费林试液(甲、乙液各5ml)所消耗的转化糖量，按式10和11求出测蔗糖时费林试液的校正值（f2）

  A2=V2*g2*100/（100*0.95）=10.5263*V2*G2…10

  F2=10.5263*V2*g2/Al2………………………….11

  式中:A1---实测转化糖数mg

   V2---滴定消耗转化糖量ml

   G2---称取蔗糖重g

   Al2---蔗糖液滴定毫升数,查表4所得的转化糖数mg

5．乳糖的测定方法

 1）样品处理

       取20g样品（准确至0.01g）用100ml水分数次溶解并洗入250ml容量瓶中，加入4ml乙酸铅溶液，4ml草酸钾-磷酸氢二钠溶液，每次加入试剂是都要途徐徐加入，并摇动容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，静置30分钟，用于干燥滤纸过滤弃去最初25ml，所得样液作滴定用

2）预备滴定

在50ml滴定管中注入上述待测液至刻度，取费林试液10ml（用甲、乙液各5ml）于250ml三角烧瓶中，置电炉上加热，使其在2min内沸腾，沸腾后关小火焰，保持沸腾状态15S，加入次甲基蓝3滴，徐徐滴入样液。样液至蓝色完全褪尽为止，读取所用样液的亳升数。

3）精密滴定

 取10ml费林试液（甲、乙液各5ml），一次加入比预备滴定量少0.5-1.0ml的样液,置于电炉上,使其在2min内沸腾,沸腾后关小火焰,维持沸腾状态2min,加入3滴次甲基蓝液,一滴一滴地滴入样液,待蓝色褪尽即为终点,以滴定定量作为计算的依据(在同时测定蔗糖时,此即为转化前滴定量)

计算:     

   式中:V1---滴定消耗样液是ml

        W---样品重mg

  F1---由消耗样液的毫升数查表4所得乳糖数mg

  fl---费林试液乳糖校正值

6．蔗糖测定方法

1)转化前转化糖量的计算

利用测乳糖时的滴定量,自表4中查出相对应的化

   糖量按式13计算

    式中:F2---由测定有乳糖时消耗样液的毫升数查表4所得转化糖的毫克数

         f2---费林试液蔗糖校正值

          V1,W同式12

2)样液的转化及滴定

    取50ml样液于100ml容量瓶中加10ml水,再加入10ml1:1的盐酸,置于75℃水浴锅中,时时摇动,在2min30S至2min45S之间使瓶内升温至67℃后，直达到67℃后继续在水浴中保持5min，于该期间使温度升至69.5℃，取出,用冷水冷却,瓶内温度冷却至20℃时，加酚酞指示剂2滴,用30%氢氧化钠中和呈中性，用水稀释至刻度,摇匀并在此温度下保温半小时后再滴定。

式中:F3---由V2查得转化糖的数mg

     V2---转化后消耗样液量ml

     f3,W同式13

蔗糖量计算:蔗糖(%)=(L1-L2)*0.95……………………15

式中:L1---转化后转化糖的含量(%)

     L2---转化前转化糖的含量(%)

乳糖和转化糖因数表（费林氏液）

   溶液中乳糖,蔗糖共存时,测定乳糖时应在滴定量中加上的校正数见表5

表5    (用10ml费林试液)

六．酸度的检测：滴定酸度指乳由当时的pH值增至pH 8.4时所需加入的碱量多少。

1．牛乳的滴定酸度有下列几种表示方法：

1）吉尔涅尔度（。T）：以酚酞为指示剂，中和100ml牛乳所消耗的0.1N氢氧化钠的溶液的毫升数，通常使用此法表示。

2）乳酸度（%）：以酚酞为指示剂，中和100ml牛乳，用去0.1N氢氧化钠溶液18ml，此牛乳的酸度为0.16%，即1ml0.1NnaOH=0.009g乳酸。乳酸的分子量为90，0.1N时，1000ml牛乳中为9g，即1ml牛乳中含有0.009g，此数相当于0.1NNaOH1ml。

4）索氏列特—格恩克尔度（。SH）：以酚酞为指示剂，中和100ml牛乳所消耗的0.25N氢氧化钠的溶液的毫升数。SH与。T相同，只是NaOH浓度不同，。SH所用的NaOH溶液浓度为0.025mol/l，即。T滴定法时每消耗1ml0.25mol/l，为1度，新鲜牛乳的。SH通常为5—8。SH。

2．换算关系：   。T = 乳酸度% / 0.009   

                    =。SH*10 / 4

              乳酸% = 。SH*0.0225

3．吉尔涅尔度的测定方法：

A．样品制备：在三角烧杯中移入10ml奶样，加入21ml20℃的蒸馏水，混匀。

B． 滴定终点标准色的制备：硫酸钴溶液：称取3g硫酸钴，定溶至100ml，最长使用3个月。测定酸度时取与滴定酸度相度的乳样加入相同的水，加入2ml3%的硫酸钴溶液混匀，制得终点色标准溶液。

C． 在样品中加入0.5ml酚酞指示剂，混匀。

D．用氢氧化钠溶液滴定样品瓶，边滴定边摇混，直到出现与标准色相同的颜色。整个滴定过程要在45S内完成。

4．影响滴定酸度测定结果的因素：

A．指示剂浓度和用量：酚酞用量太大会影响测定结果。

B． 稀释时加水量：加水后影响结果的原因是当牛乳中加入水后，碱性的磷酸三钙的溶解度增加，因此乳的滴定酸度显得略为降低。因此部颁标准规定了要加20ml水就应该执行，以免发生误差。

C． 碱液浓度不同：要执行规定的标准，同时所配的氢氧化钠溶液不应含有碳酸钠，所用蒸馏水应先煮沸，冷却后立即使用。

D．终点确定：酸滴定时，正确的终点应该是PH8.4，必须使用标准色。

E． 测定时的温度：温度对乳的pH是有影响的，因为在不同温度时，乳中微酸性的物质，其离解程度不同，因此也影响乳的滴定酸度。冷的乳，滴定酸度较低，因此温度不宜过高或过低，应在20±2℃时为宜。

F． 滴定速度：根据经验，滴定很慢时，往往消耗较多碱液。全部滴定时间最好在45秒内完成。

G．滴定管的读数：所用碱液越少，滴定管的读数影响越大。

H．避免二氧化碳的影响：若加入乳中的蒸馏水含有二氧化碳，使滴定酸度增高，所以要避免二氧化碳的影响。

七．酒精试验的检测：

1．原理：蛋白质沉淀是有条件的，一是除去蛋白质胶粒所带的电荷，二是破坏胶粒表面的水化作用，前者使胶粒在水中沉淀出。在一般情况下，蛋白质带有相同的电荷。当乳酸化pH值达4.6（即等电点）时，蛋白质胶粒形成数量相等的正负电荷再没有相斥力量，于是胶粒极易聚合成大胶粒从胶液中分离出。当加入强烈的亲水性物质，可以破坏蛋白质胶粒的水化作用，从而满足胶体沉絮的一个条件。酒精、丙酮等都是强烈的亲水性物质，它比蛋白质胶体的水合能力更强，加入后能夺去原来胶粒的水化水分子，使胶粒脱水，从胶粒溶液中沉降出来。

2．牛乳中蛋白质的等电点：酪蛋白等电点：PH4.6—4.7；乳白蛋白等电点：PH4.72；乳球蛋白等电点：PH5.19。

3．检测方法：取等量的牛乳与酒精混合，如出现絮片判定呈阳性。

4．注意事项：

A．酒精至少为医用酒精，不得使用工业酒精及饮用酒。工业酒精与饮用酒含有使蛋白质凝固的杂质，在很低浓度时能使牛乳凝固，造成错误的结论。

B． 配制酒精时不可使用酸性或碱性的水。

C． 牛乳与酒精应等量混合。

5．牛乳具有很强的缓冲作用，因此pH值与酸度并非呈直线关系，滴定酸度与pH值之间的关系见下表：

八．杂质度的检测：

1．定义：根据GB/T5413.30—1997标准中规定测得的500ml液体乳样或62.5g乳粉样品中，不溶于约60℃热水残留于过滤板上的可见带色杂质的数量。

2．测定方法：取液体乳样500ml，加热至60℃。于过滤装置上的棉质过滤板上过滤，用水冲洗附于过滤板上的牛乳。将过滤板置于烘箱中烘干后，在非直接但均匀的光亮处与杂质度标准板比较，即可得出过滤板上的杂质量。当过滤板上杂质的含量介于两个级别之间时，判定为杂质含量较多的级别。

3．注意事项：本法所测的同一样品所作的两次重复测定，其结果应一致，否则应重复再测定两次。

九．干物质的检测：

1.干燥器中的干燥剂：无水硫酸钙、无水过氯酸镁、无水过氯酸钙、刚灼烧过的氧化钙、无水五氧化二磷、无水浓硫酸以及变色硅，都是较有效的干燥剂。常见的浓硫酸、颗粒状氯化钙等干燥剂，干燥效能较差。通常采用变色硅胶做为干燥器中的干燥剂。变色硅胶无水时为蓝色，吸水后为白色泛微粉色。

2．干物质（水分）的检测：

A．仪器设备：分析天平、干燥器、烘箱（工作空间的温度恒温控制在102±2℃）、沸水浴、平底皿盒（高20—25mm的带盖不锈钢、铝皿盒或玻璃称量皿）、短玻璃棒（长于皿盒的直径，可斜放在皿盒内，不影响盖盖）、石英砂或海砂。

B．石英砂或海砂必须通过以下适用性的测试：

1）将约20g的海砂同短玻璃一起放于一皿盒中，然后敞盖在102±2℃的烘箱中至少烘2小时。把皿盒盖盖好后放入干燥器中冷却至室温后称量，准至0.1mg。

2）用5ml水将海砂润湿，用短玻棒混合海砂和水，将它们再次放入烘箱中烘4小时。把皿盒盖盖后放入干燥器中冷却至室温后称量，准至0.1mg。两次称量的差不应超过0.5mg。

3）如果两次称量的质量差超过了0.5mg，则需对海砂进行下面的处理后才能使用：让海砂在25%的盐酸溶液浸泡3天，经常搅拌。尽可能地倾出上清液，用水洗涤海砂，直到不再有酸。在160℃条件下加热海砂4小时。然后重复进行适用性测试。

D．测定步骤：

1）皿盒的准备：在带盖皿盒中加入约20g干净的海砂和短玻棒，开盖在烘箱中至少烘1小时。盖上盖迅速将皿盒移入干燥器内冷却至室温。连海砂、短玻棒和盖一起称量，准至0.1mg。

2）称样3—5g样品和海砂混合：将海砂斜到一边，在皿盒中没有海砂的一边加入样品，准至0.1mg。

3）搽净皿盒的外部，将皿盒的盖置于皿盒的一边放入烘箱中烘2小时。加盖取出，置于干燥器中冷却至室温，称量，准至0.1mg。

4）再将皿盒开盖放入烘箱中烘1小时，加盖取出，放干燥器中冷却45分钟后称量，准至0.1mg，如此重复，直到两称量得出的质量差小于2mg。

E． 结果表述：         

式中：W：样品中水分的质量分数，%

      m0：皿盒（包括海砂、皿盒盖和短玻棒）的质量，g；

      m1：皿盒和样品的质量，g；

      m2：皿盒和烘干后的样品的质量，g。

      结果保留两位小数。

      重复性：同一分析人员使用同样的设备，在短时间内以内对样品进行双样测定，结果误差要求不大于水分值的1%。

     重现性：在不同实验室工作的两个检验人员对同一样品进行分析，结果误差要求不大于水分值的1%。

第七节   微生物基础知识

第一部分：微生物的基础理论

   

     微生物种类繁多，与食品有关的微生物包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌和病毒等。这些微生物的形态和结构，是研究食品微生物的基本内容之一。下面将一一介绍。

一．细菌：

1．细菌的形态：细菌的形态包括个体形态（如细菌的形状及大小）菌落特征（即在固体培养基上长成一定形状的微生物群体结构）两部分。

1）细菌的个体形状：细菌的形态具有多样性，在环境条件改变时，形态也可以随之而改变，但是在一定的环境条件下，各种细菌经常保持着一定的形态。细菌具有三种基本形态：球状、杆状和螺旋状，称为球菌、杆菌、和螺旋菌。

①球菌：球形的细菌称为球菌，单独存在时为圆形，几个细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌和葡萄球菌。见图1-1。

②杆菌：杆状的称为杆菌。因菌种不同，菌体细胞的长短、粗细和菌体细胞的两端的形状都有差异。 见图1-2。根据杆菌的长度的不同，一般以长杆菌、短杆菌、球杆菌的名称来区分。根据菌体两端的不同形状特点，有些杆菌一端膨大，另一端细小，形如棒状的称棒状杆菌，形如梭状的称为梭状杆菌，排列成对的称为双杆菌，形成链状的称链杆菌，能形成芽孢的称为芽孢杆菌，不能形成芽孢的称为无芽孢杆菌等。

③螺旋菌：菌体略弯，呈香蕉状的称弧菌；菌体弯曲，回转如螺旋状的，称螺菌。见图1-3。

2．细菌的大小：细菌的大小因种类的不同有很大的差异。所有的细菌必须借助于显微镜才能观察。虽然细菌的大小差别很大，但一般都不超过几个微米。大多数球菌的直径为0.5—2.0微米。杆菌一般宽为0.5—1.0微米。长为1—5微米。产芽孢的细菌一般比无芽孢的细菌大些。

3．细菌的菌落特征：细菌的菌落是指细菌接到一定的培养基上，置于一定的温度环境上中，经过一定时间的培养后，在培养基的表面或里面，由一个菌体进行繁殖而积聚了许多菌体细胞，最后形成能被人们肉眼所能看到的一个群体，这群体即称为菌落。不同的菌种有不同的菌落形态。见图1-4。

菌落的大小、颜色、边缘形态、表面形态、粘稠度等形态构造和形成的时间，对于不同细菌种类来说是各有不同的特点。因此菌落的特征可以应用于细菌的鉴定和分类。

4．细菌的细胞结构：细菌的细胞虽然微小，但其内部结构与高等生物的细胞一样，是很复杂的。它的基本结构包括细胞壁、细胞质膜、细胞质、细胞核等。有些细菌还有荚膜、鞭毛和芽孢等特殊结构。基本结构是任何一种细菌都具有的，而特殊结构只限于某些种类细菌才有，因此成为细菌分类鉴定的重要依据。

①细菌壁：细胞壁在菌体的最外层，又称外膜，膜薄无色而透明，厚度均匀一致。细菌细胞壁的化学成分主要是由蛋白质、类脂质和多糖复合物等组成，不同的细菌，细胞壁的化学成分有一定差异。如革兰氏阴性菌的细胞壁中有较高的脂蛋白，革兰氏阳性菌的细胞壁中有磷酸质。

②细胞质膜：紧贴细胞壁的一屋薄膜称为细胞质膜，是具有选择性的半渗透性膜。

③细胞质：是一种无色透明粘稠的胶体，其主要成分是以结合蛋白质为主，还有核酸和脂类等。菌体随着培养时间的长短，细胞质也有明显的变化，在幼龄的细胞中，细胞质稠密均匀，容易染色；在老龄的细胞中出现了许多液泡，而形成多孔状结构。

④细胞核：细菌的细胞内是否有核，这个问题争论已久，现证实有些细菌有一个细胞核。但有许多细菌具有不固定形态的核质体分散在细胞质内。核质体相当于一般生物细胞的核，虽然没有核膜与细胞质相隔，但核质体的主要成分是脱氧核糖核酸（DNA），这与一般生物细胞核的组成特点是一致的。核质体是细菌遗传的物质基础，与细菌的遗传变异有密切的关系。

⑤内含物：细菌的细胞质内含有各种各样的物质，是细菌生命活动的产物，总称为内含物。

⑥荚膜：有些细菌在其生命活动过程中，在一定的营养条件下，能向细胞壁表面上分泌出一层粘液样的物质而形成较厚的膜称为荚膜。荚膜中含有大量的水分，约占90%左右，其固形物为多糖或多肽的聚合物。荚膜具有保护细菌的作用，寄生在人或动物体内的有荚膜的细菌，不易被白血球吞噬。

⑦芽孢：许多细菌当个体生长到一定时期，繁殖速度降低，菌体细胞内细菌质出现浓缩聚集现逐步形成椭圆形，折光很强的特殊结构，称为芽孢。（亦称内生芽孢或耐久体）当菌体未形成芽孢前称为繁殖体或营养体，在杆菌中只有两属是产生芽孢的，一为芽孢杆菌属，另一为梭状芽孢杆菌属，在球菌中只发现一种尿素八叠球菌是产芽孢的。一般细菌只能形成一个芽孢，由于菌种不同，芽孢形状有球形、椭圆形、卵圆形等。芽孢在菌体内有一定的位置，中央位的如枯草芽孢杆菌、马铃薯芽孢杆菌；近端位的如肉毒梭状芽孢杆菌；极端位的如酪酸梭状芽孢杆菌。芽孢的大小也不同。

A．芽孢的形成过程：细菌在一定环境条件下或处在一定的生活阶段，如果水分缺少或营养物质不足时，或在细菌发育的后或温度发生改变，或培养基里加入某种盐类如锰盐，往往会促使菌体产生芽孢。形成芽孢的因素因菌种而不同，并不是所有的芽孢细菌在生活条件改变时就能形成芽孢。

B． 芽孢的性质：芽孢不需要营养物质。芽孢对高温、低温和干燥有强大的抵抗力，而且对化学物质也有强大的抵抗力，各种消毒剂能使繁殖体杀死，但某些细菌的芽孢依然能够生存。繁殖体转变为芽孢后，它的代谢活动已减弱到极低的程度，处于休眠状态，生存能力很强；有的可在自然环境中生存几十年。

⑧鞭毛：有许多细菌能从菌体内长出细长的丝状物，称为鞭毛。鞭毛非常细，需用特殊染色法染色才能在显微镜下见到。鞭毛主要的化学成分是鞭毛蛋白质，主要作用是细菌的运动器官。

⑨纤毛：用电子显微镜观察时，可发现某些细菌细胞的四周或极端有微细的纤毛。纤毛不是运动器官，有粘附于其它物体的作用。

4．细菌的繁殖：微生物的繁殖方式分为有性繁殖和无性繁殖。细菌进行无性繁殖，以细胞分裂进行繁殖。

二．酵母菌：酵母菌广泛分布在自然界，种类繁多，已知有几百种，是生产中应用较早和较重要的一类微生物，主要用于面包发酵、制造酒精和酿酒。酵母菌可供食用、药用或作为饲料。但另有一些酵母菌能使果汁、果酱、蜂蜜、酒类、肉类等食品变质。

1．酵母菌的形态：酵母菌由单细胞组成，不能运动。基本个体形状有多种，常见的有圆形、椭圆形、卵圆形、柠檬形和香肠形等。菌落形态与细菌相似，但菌落一般较大。在固体培养基上酵母菌形成湿润的菌落，常带粘性，呈白色或粉红色等。培养时间较长的菌落呈皱缩状，并较干燥。在液体培养基中，有些酵母菌能在液体表面上形成一层薄的菌膜，或在容器壁上出现酵母环，还有些能在液体底部产生沉淀。

2．酵母菌的细胞结构：酵母菌的细胞与细菌结构很相似。有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核及内含物等。酵母菌与细菌的一个重要区别在于酵母菌具有明显的核，每个细胞有一个核。核呈圆形或卵形，核的直径一般不超过1微米。

3．酵母菌繁殖：酵母菌的繁殖方式有三种：芽殖、裂殖和产生孢子繁殖。芽殖和裂殖属无性繁殖，孢子繁殖

三．霉菌：霉菌不是分类学上的名词，是真菌的一部分。凡是生长在培养基上而长成绒毛状或棉絮状菌丝体的真菌，统称为霉菌。

1．霉菌的形态：霉菌不同于细菌及酵母，它们绝大多数都是多细胞的微生物，而且霉菌细胞已有了功能上的分化。霉菌细胞的基本构造与酵母细胞相似。也是由细胞壁、细胞质膜、细胞质、细胞核和内含物等组成。菌体内含有丰富的蛋白质和酶。霉菌在一定的培养基上生成的菌落，所呈现的形状、大小、颜色、纹饰以及结构等各种特征，对不同的霉菌来说，有很大的差异，可作为分类的一项依据。菌落可呈蜘蛛网状、棉絮状、丝绒状等。菌落可出现各种颜色，并可使菌落生长的培养基也带有颜色。

2．霉菌的繁殖：霉菌具有无性繁殖和有性繁殖两种。无性繁殖是霉菌的主要繁殖方式。

四．放线菌：放线菌大多数是腐生菌，少数是寄生菌。在自然界分布很广。特别是在比较干燥，弱碱性而含有机质多的土壤里放线菌最多。放线菌是抗菌素的主要产生菌。到目前为止，已知抗菌素中约有三分之二是由放线菌产生的。

1．放线菌的形态：放线菌的菌体是没有横隔的分枝丝状物，所以认为是单细胞的微生物。放线菌的菌落呈辐射状，菌落表面呈紧密的绒状和皱折。

2．放线菌的繁殖：放线菌以无性方式繁殖，主要是借凝聚孢子（分生孢子）和横隔孢子（裂生孢子）进行繁殖。

五．病毒：病毒是目前知道的各种生物中最小的生物。无细胞结构，主要由蛋白质和核酸组成。不能独立生活，不能在人工合成培养基上生长。生活特性是寄生性的，必须在生活的组织细胞内方能生长。可将病毒大致分为噬菌体、植物病毒、人及动物病毒。我们仅介绍噬菌体。

1．噬菌体的形态：噬菌体有三种形状：蝌蚪形、球形和杆形。绝大多数噬菌体是蝌蚪形。菌体分为头、颈、尾。头部事圆形或多角形，尾部由尾髓和尾鞘组成。尾鞘末端附有六边形的基片和数根细长的尾丝。

2．噬菌体的组成与溶菌：噬菌体的主要化学成分是核酸和蛋白质组成。核酸被包围在头部的蛋白质外壳中，约占噬菌体总量的50%。噬菌体的寄生性具有高度的专一性，即一种噬菌体只对于某一种或某一型微生物才有作用。噬菌体在工业生产上有一定的危害性。

第二部分：微生物的检验方法

一、   菌落总数（参照GB4789-84）

    菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。

1．设备和材料

1）   温箱（培养箱）：36±1℃；

2）   冰箱：0-4℃；

3）   恒温水浴：46±1℃

4）   天平：

5）   电炉：可调试；

6）   吸管：容量为1ml和10ml，标有0.1ml单位刻度；

7）   广口瓶或三角烧瓶：容量为250 ml 、500ml；

8）   玻璃珠：直径为5mm；9）

9）   平皿：皿底直径为9cm；10）

10）  试管：18*180mm、15*150mm

11）  酒精灯；

12）  均质器或乳钵；

13）  试管架试管筐；

14）  灭菌刀或剪刀，灭菌镊子；

15）  酒精棉球；

16）  原始记录薄

17）  玻璃蜡笔或玻璃油笔

2.培养基和试剂

1）   营养琼脂培养基；

2）95%乙醇；

3）生理盐水或其他稀释液，定量装于玻璃瓶和试管内，灭菌。

3.检验程序：

   一般保鲜奶成品做原倍或10倍的稀释倍数即可

   果汁饮料做原倍或10倍稀释倍数

4操作步骤

   1）检样稀释及培养

a）   以无菌操作，将检样摇匀，用1ml灭菌吸管吸取检样1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水中，振摇试管混合均匀， 作为1：10稀释液 。

b）   另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。

c）   原辅材料菌落总数选择1：10和1：102两个稀释度来测定，原奶菌落总数的测定选择1：105和1：106两个稀释度，即测定时用1ml灭菌吸管分别移取1ml稀释液于灭菌平皿内。

d）   根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿

e）   稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（可放置于46±1℃的水浴内保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照

f）   待琼脂凝固后翻转平板，置于36±1℃的温箱内培养24±2hr（肉、水产、乳和蛋品为48±2hr）取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克或每毫升样品所含有的菌落总数

2）   规则

a）平均菌落数的选择

选取菌数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，就采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌生长的平板作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平板的一半而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。

   b）稀释度的选择

   应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度乘以稀释倍数报告之

   若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定，若其比值小于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字

   若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之

   若所有稀释度的平均菌落数小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以倍数报告之

   若所有的稀释度均无菌落生长则以＜1乘以最低稀释倍数报告之

   若所有的稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

3）   菌落数的报告及报告方式

a.  报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的，以四舍五入计算，用10的指数来表示。

b.  报告方式：

二、大肠菌群测定

大肠菌群是指一群在37oC，24小时能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性无芽孢杆菌 大肠菌群以每100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

目的：检测成品中是否存在大肠菌群，以证明成品是后期被污染所致。

1.设备和材料

1）   培养箱：36±1℃；

2）   水浴：44±0.5℃；

3）   天平；

4）   显微镜；

5）   温度计；

6）   平皿；

7）   试管；15*150mm、18*180mm、20*200mm、

8）   吸管；容量为1ml和10ml

9）   载玻片

2．培养基和试剂

1）   乳糖胆盐发酵管GB4789.28-84

2）   伊红美蓝琼脂GB4789.28-84中.23

3）   乳糖发酵管GB4789.28-84中3.10

4）   蛋白胨水GB4789.28-84中2.13

5）   靛基质试剂GB4789.28-84中2.13

6）   革兰氏染色液GB4789.28-84中1.2

3.检验程序:

4.操作步骤

1）   检样稀释

a）   以无菌操作将检样25ml或25g放入含有225ml灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先放入适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，以充分振摇或研磨作成1：100的均匀稀释液。固体检样最好用均质器以8000-10000r/min的速度处理1min作成1：10的均匀稀释液。

b）   用1ml的灭吸管吸取1：10的稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成1：100的稀释液。

c）   另取1ml的灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，再递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管

d）   根据食品卫生标准要求或检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管

2）   乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置于36±1℃的温箱内，培养24±2hr，如所有乳糖但盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

    3）分离培养

      将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃保温箱内，培养18-24hr，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色证实实验。

    4）证实实验

       在上述平板上，挑取可疑大肠菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃的温箱内培养24±2hr，观察产气情况，凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

    5）报告

       根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群可能数。

注：以上方法仅限于产品出口时使用，若产品国内销售则采用大肠菌群纸片法，其方法如下：

        取3袋大纸片，每袋接种样品(10倍稀释样品)10ml，6袋小纸片，分别接种样品(10倍稀释样品)1ml及(100倍稀释样品)1ml各3袋，然后37℃培养15小时，根据阳性纸片袋数，查表计算MPN值。

三、芽孢总数的测定

概述：

     将少量原奶（5-10毫升）在80℃条件下加热10分钟。这一过程可杀死大多数生长的微生物—仅有耐热的活菌可存活下来。准备对已加热处理的奶样品进行细菌总数测定。

材料：

a）   无菌稀释烧瓶，内装99毫升无菌稀释液。

b）   氯化钠—含0.9%氯化钠的水溶液,用于制备稀释液。

c）   无菌吸管：容量分别为1.0毫升和0.1毫升。

d）   培养皿—或经预先消毒的一次性塑料培养皿，或可多次使用的玻璃培养皿。玻璃培养皿使用前须进行消毒。

e）   用于孢子生长的无菌固体培养基—可使用普通营养琼脂，但最好使用进行孢子计数的专用培养基。

f）   2个水浴锅—1个80℃水浴用于原奶样品的加热（溶解固体琼脂），第2个为40-50℃的水浴，用于冷却琼脂，维持琼脂液体状态以便倒平皿。

g）   1个温度为30-35℃的培养箱。

h）   一个用于煮开水的壶和加热板。溶解固态的无菌营养琼脂。

i）   试管。

j）   10毫升的吸管。

k）   温度计：0-100℃。

l）   高压灭菌器，用于玻璃器械，营养基质的杀菌。

方法：

a）   将一定容量（5-10毫升）的原奶放入一个试管。

b）   在另一试管中加入与奶等量的水。

c）   将两支试管放入80℃水浴。

d）   在加水的试管中插入一根温度计。

e）   温度升到80℃。

f）   再等10分钟。

g）   用冷水冲，使含原奶样品的试管冷却。

h）   将营养琼脂放入沸水中使其融化。

i）   将融化的营养琼脂放入40℃水浴使其冷却—可在加热原奶样品前进行h）和i）操作。

j）   用加热后的原奶样品制备稀释样品，在99毫升无菌稀释液（放入一个无菌稀释烧瓶）中加入1毫升已加热的原奶，并摇动使彻底混匀。

k）   用吸管将样品加入培养皿—每一步骤用一个培养皿，并在培养皿上作出标记。

1：1.0毫升加热的原奶样品

2：0.1毫升加热的原奶样品

3:1.0毫升经稀释的加热原奶样品

   4:0.1毫升经稀释的加热原奶样品

   l) 在每个含原奶样品4 培养皿中分别加入约10毫升冷

      却的无菌液态营养琼脂,转动培养基使样品与液体琼

      脂充分混匀。

   m）直至液体营养琼脂凝固

   n）将培养皿放入培养箱（30-35℃）培养72小时。

评价：

a）   从培养箱中取出已培养的培养皿。

b）   计数培养过程中长出的菌落数。

c）   计算结果：最好仅选用那些最后的菌落计数在30-300个之间的培养皿。用数出的菌落数乘以稀释系数（稀释液l的系数为1，稀释液2的系数为10，稀释液3的系数为100，稀释液4的系数为1000），得出每毫升测试样品中的总孢子数。

四、耐热芽孢的测定

概述：

     目前，对“耐热孢子数”一词没有明确的意义；所使用的程序不同，得出的结果也不同。下面论述的方法的优点在于操作简单：不需要高压杀菌程序，然而，当与不同实验室所做出的耐热孢子数进行比较时，必须注意使用的方法和流程。

材料：

a）   吸量分别为1.0毫升和0.1毫升的无菌吸管。

b）   培养皿—或经预先消毒的一次性塑料培养皿或可多次使用的玻璃培养皿，玻璃培养皿使用前必须消毒。

c）   用于孢子生长的无菌固体营养培养基—可使用普通细菌总数用营养琼脂，但最好使用进行孢子计数的专用培养基。

d）   一个水浴箱：将温度设在40-45℃用以冷却液化的营养琼脂培养基。

e）   一个用煮开水的壶和加热板—用来对原奶样品进行加热处理。

f）   二个培养箱：一个温度调至30-35℃，另一个调至50-55℃。

g）   试管。

h）   10毫升的吸管。

i）   温度计：测量范围为0-100℃。

j）   一个高压灭菌器用于玻璃器械，营养基质的杀菌。

流程：

a）   在煮沸的水浴中将无菌固体营养琼脂融解。

b）   将融解了的无菌营养琼脂放入40-45℃水浴进行冷却。

c）   用吸管吸取一定量（50-100毫升）原奶样品加入一支或几支试管。

d）   在另一支试管中加入与奶量相等的水。

e）   将装有原奶样品和水的试管同时放入一个沸水水浴。

f）   在装水的试管中插入一根温度计。

g）   直至“装水试管”的温度到达100℃。

h）   再等10分钟—如果水不到100℃就沸腾，则等候时间需延长。或在水中加入盐以提高沸点温度—但要避免原奶样品沸腾!

i）   用冷水冲，使含原奶样品的试管冷却。

j）   用吸管分别向两组无菌培养皿中加样，两组培养皿中分别加入

1：0.1毫升加热了的原奶样品

       2：1.0毫升加热了的原奶样品

k）   分别在培养皿上标记样品及稀释情况。

l）   在已加入原奶样品的培养皿中分别倒入约10毫升无菌冷却的液态营养琼脂，转动培养皿使样品与液态琼脂充分混匀。

m）   直至液态琼脂凝固。

n）   将培养皿放入培养箱：一组培养皿放入30-35℃培养箱，另一组放入50-55℃培养箱。

o）   培养72小时。

评价：

a）   分别从两个培养箱中取出培养皿。

b）   计数培养阶段长出的菌落数：30-35℃培养的菌数为耐热适温菌的孢子数，而50-55℃培养的菌落数为耐热嗜热型的孢子数（大多数为嗜热脂肪芽孢杆菌）。

c）   计算结果：最好仅选用那引起最后菌落计数在30-300个之间的培养皿及稀释度。用计数的菌落数乘以稀释系数（稀释液1的系数为1，稀释液2的系数为10），得出每毫升测试样品中的总耐热适温型孢子数及总耐热嗜热型孢子数。

依据：GB5408-85、GB4789.2-84、GB4789.3-84

五．嗜冷菌的检验

1.概述     

  嗜冷菌的繁殖代谢将产声时热蛋白酶和脂肪酶，过多的蛋白酶和脂肪酶将导致UHT奶制品产生凝块，发苦，或者产生脂肪氧化味，从而严重影响产品的货架期。因此原料奶应检测嗜菌。

2.材料及仪器

 1）内装99ml无菌稀释液的少品烧瓶。

  2）0.7%的氯化钠水溶液，用于制备稀释液。

 3）蒸馏水

  4）天平：最大称量为100g，精度为0.05g。

  5）配养皿：可用预先消毒的一次性塑料配养皿，也可使用玻璃配养皿。玻璃配养皿使用前须先消毒。

  6）配养基：可使用用于细菌总数测定的普通营养琼脂。

  7）水浴锅：40-50℃的水浴锅用于冷却琼脂。

  8）高压灭菌锅：用于玻璃器械及营养基质的杀菌。

  9）温度为21oC的培养箱。

  10）开水壶或电炉。

  11）容量为1ml和0.1ml的无菌吸管数支。

 3．方法：

1）  在开水中融化固体的营养琼脂。

    2）将融化的固体营养琼脂放入40-50oC的水浴锅中。

     3）原奶稀释的准备：将1ml原奶样品倒入内装99ml无菌稀释液的烧瓶中并充分摇匀混合（稀释液1）再将1ml稀释液1倒入另一个内装99ml无菌稀释液的烧瓶中并充分摇匀混合（稀释液2）

4）用吸管将样品加入培养皿，每一步骤用一个培养皿，并应在培养皿上做标记。

     （1）1.0ml原奶样品     （2）1.0ml原奶样品   

   （3）1.0ml稀释液1      （4）0.1ml稀释液1 

     （5）1.0ml稀释液2      （6  0.1ml稀释液2

5）在每个含样品的培养皿中加入约10 ml冷却的无菌液态营养琼脂，转动培养皿使样品与液态琼脂充分混合。

6）待营养琼脂凝固后，将培养皿放入培养箱（21oC）中培养25小时。

 7）  在培养25小时后，将平皿从培养箱中取出。

8）数出培养皿中的菌落数

9）计算结果，最好选用那些菌落计数在30-300之间的培养皿。用数出的菌落数乘以稀释倍数，即得出每毫升测试样品中的嗜冷菌。