实验1   培养基的配制和灭菌

一、目的要求

1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。

4.每2人一组，每人一份实验报告。

二、实验材料

1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、1N HCl、1N NaOH

2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。

3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。

三、实验内容

(一) 培养基的配制

1．培养基的配制方法和步骤

1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。

2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。

3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。

4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。

5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。

6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。

7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。

2．培养基的配制

A.富集培养基（液体）：

海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。

B. 2216E 斜面（固体）：

海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。

C. 无菌生理盐水和保种液：

生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。

每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。

保种液：生理盐水，加25%甘油

D. 碳源优化培养基：

以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，

人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。

(二) 分离培养微生物常用器皿的准备

1) 清洗一些玻璃仪仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿等。

2) 制作8层纱布，酒精棉。

3）Tip 头（0.2，1ml，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）；保种管；药勺；长竹签。

4）卫生（308 实验室超净台，实验台面）

(三) 培养基和玻璃器皿的灭菌方法

1、加压蒸汽灭菌法。其步骤如下：

1)灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。

2)接通电源，进行加热。

3)排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2 时再打开排气阀，待压力回复到将近零时，再关闭排气阀。

4)当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时,此时灭菌锅内的温度为121℃,维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。

5)灭菌时间一到，切断电源。待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。

2、紫外线灭菌

一般使用30W 灯管，9m3空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此上适用于空气表面杀菌。

3、化学药剂消毒灭菌

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。

四、思考题

1.固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？

答：1）加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。

2）受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。

3）加热完毕后，要在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。

2.培养基中加琼脂的作用是什么？

 答：充当固化剂，起支持作用

3.如何检查培养基灭菌是否彻底？

答：把灭菌后的培养基，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果培养基出现了杂菌菌落，说明灭菌不彻底；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明已彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

实验二   产碱性蛋白酶海洋细菌的分离筛选

一、目的和要求

根据一定的实验目的如酶类的生产，建立合适、精确的筛选模型，并从特定的样品如海泥中筛选出高产菌株。

目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。

二、仪器与试剂

1. 仪器设备：灭菌锅，培养箱，摇床，玻璃仪器（每组需用量）（已准备）

2. 需准备的培养基

A.富集培养基（液体）：

海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，陈海水1L，pH7.6。取50mL 分装250mL 三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸， 115℃高温灭菌30min。

B. 2216E 斜面（固体）：

海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入5mL，115℃高温灭菌30min，灭菌后摆斜面。

C. 无菌生理盐水：

NaCl 0.85% 去离子水配制。每支试管加入4.5mL，盖上试管帽、包扎、115℃高温灭菌30min。

D. 碱性蛋白酶筛选培养基：海水2216E-脱脂奶粉平板：A：4%脱脂奶粉，蒸馏水；B：海水2216E 液体培养基中加4%琼脂粉，pH10.0。A 和B 115℃高温灭菌30min 后稍冷却，将A在无菌超净台中倒入B中，摇匀后倒入无菌平板。（B瓶要大）

三、实验方法

3.1 样品富集

取少量海泥样品加入富集培养基中，28℃，150rpm 振荡培养24小时。

3.2 稀释涂平板

摇匀富集后的富集培养液，用无菌生理盐水作梯度稀释（注意：在管上做好标记。），至10-5、10-6后各涂1个筛选平板， 在28℃培养48 小时。

3.3 产蛋白酶菌株的筛选

观察筛选平板上所产生的水解圈，拍照。每组选取1株水解圈大而明显的菌株，接在斜面上培养。

四、实验结果

五、思考题

1 分析本实验中富集培养的原理。

 答：它的原理是利用不同微生物间生命活动特点的不同制定特定的环境条件使得仅适用于该条件的微生物旺盛生长。本实验中的富集培养基就可以实现这一目的，能够抑制其他微生物的生长而仅使产碱性蛋白酶海洋细菌富集生长。

2 筛选平板上的透明圈是否能准确表示蛋白酶活的大小？

 答：不可以。透明圈是由菌株产生的蛋白酶将底物水解而呈现出来的，酶活力的大小还与菌落的大小有关。透明圈的直径与菌落的直径之比才能够准确的表示蛋白酶活力的大小。

实验3    微生物接种和菌种保藏

一、实验目的和内容

目的：了解并掌握微生物接种和菌种保藏的常用方法及其优缺点。

内容：1、学习斜面传代保藏方法。

2、学习-80℃甘油保藏方法。

二、实验材料和用具

1.菌种：实验2中分离得到的海洋细菌

2.培养基：海水2216E 培养基

3.试剂：陈海水甘油、NaCl、无菌水

4.材料：无菌试管、无菌吸管(1mL 及5mL)、无菌保种管、接种环

三、操作步骤

(一) 斜面传代保藏法

1.贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm 处。

2.斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上。

3.培养海洋细菌28℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

4.保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。海洋细菌16℃生化培养箱保存。管口应用牛皮纸或保鲜袋包扎。

(二) -80℃甘油保藏法

将筛选后的菌株（筛选平板上）接种于2216E 斜面上，28℃培养12～18h，用无菌保种液洗下（用到振荡器、无菌操作），移液器加入保种管，写好标记，保存于－80℃超低温冰箱（2 份/菌）。

四、思考题

1. 写实验报告并讨论各种菌种保藏方法的优、缺点。

答：斜面传代保藏法：可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。因此，要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。

-80℃甘油保藏法：对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，甘油可以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象，但此方法设备和操作都比较复杂。

实验4     菌种的紫外诱变筛选

一、实验目的

1、学习菌种的诱变育种（物理诱变）基本技术。

2、通过诱变技术筛选出高产蛋白酶的菌株。

二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。紫外线诱变一般采用15W 或30W 紫外线灯，照射距离为20~30cm，照射时间依菌种而异，一般为1~3 min，死亡率控制在50％~80％为宜。

被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态，要求培养至对数生长期为最好。

本实验以紫外线处理产蛋白酶的海洋细菌，通过透明圈法初筛，选择蛋白酶活力高的菌株。

三、实验材料

1、菌种实验二筛选得到的产蛋白酶菌株。

2、器材装有15W 或30W 紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL 离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。

3、培养基和试剂

1) 无菌生理盐水、75%酒精

2) 筛选培养基：脱脂奶粉培养基

3) 海水2216E 液体培养基

四、实验步骤

（一）出发菌株菌悬液的制备

1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，28℃培养24h；

2. 将活化后的菌株接种于液体2216E 培养基，28℃ 150rpm 振荡培养过夜（约12h）；

3. 取1ml培养液于5ml离心管中，10000rpm 离心5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述 步骤用1ml生理盐水恢复成菌悬液；

4. 将1ml上述菌悬液倒入无菌空平板中，再加入10ml无菌生理盐水，磁力搅拌1min。

（二）UV诱变

1. 将紫外灯打开，预热30min；

2．打开无菌平板盖，紫外照射处理60s，照射完毕后先盖上平板盖，再关闭搅拌和紫外灯；

3.取处理过的菌悬液0.1ml涂布1个筛选平板；

4.将诱变菌液在黑暗中培养过夜（28℃），然后在红灯下稀释涂菌进行初筛（避光培养），观察在菌落周围出现的透明圈大小。

五、思考题

1．试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。

答：1）紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

2）由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以进行紫外线诱变育种时，只能在红光下照射及处理照射后的菌液；

前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。

紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％—80％为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好.

紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。

2．为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？

答：把菌悬液打散是为了使菌种分散，与培养液充分混合，有利于菌种复苏生长，进入对数生长期；另外也使菌液均质，有利于紫外光的均匀分布处理，让菌株均匀的接触紫外诱变，提高诱变的效率，并可减少不纯种的出现；培养一段时间可提高菌株的数量，使其达到对数生长期，这样诱变成功的几率才会变大，因为细胞发生突变的概率很小。

附1：蛋白酶活性的测定

采用Folin 酚法（周德庆，1986）：1ml 酶液（上清液）在40℃下水解1.0 ml2％（w/v）的酪蛋白（底物）30 min,在上述条件下每min 释放1μg 的酪氨酸所需的酶量为一个单位(U)。

步骤：

①发酵液摇匀后，取1.5ml于1.5mlEP管中，10000r pm离心5min，得发酵上清液。

②测定组：取0.5ml酶液（上清液）与1ml 2%酪蛋白溶液混合后，40℃反应30min，加入3ml10% TCA终止反应，取1.5ml至1.5ml EP管中，10000r pm离心8min，得上清液。

③对照组：取0.5ml酶液，先加入3ml10% TCA，再加入1ml 2%酪蛋白溶液，40℃条件下反应30min，取1.5ml至1.5ml EP管中，10000r pm离心8min，得上清液。

④取三支大试管，每管分别加入1ml测定组上清液，1ml对照组上清液，1ml 蒸馏水，每管加入0.55M NaCO3 5.0 ml，混匀后，加入Folin-酚试剂1ml，立即混匀，室温下显色15min，以加蒸馏水的试管做空白，650nm处测定测定组和对照组的OD值。

 酶活单位：（OD样—OD对照）*K*V/T/0.5（ug酪氨酸/0.5ml）
OD样：测定组吸光度值650nm

OD对照：对照组吸光度值650nm

T: 时间40min

V: 4.5

K: K=114.7，标准曲线上光吸收为1时，酪氨酸ug数

实验结果：OD样=  0.385                    

OD对照=0.300

酶活单位=2.194 ug酪氨酸/0.5ml

附2：完整实验流程图

出发菌株

↓

斜面活化

↓28℃，24hr

振荡培养

↓28℃，150rpm 过夜

转接

↓37℃，150rpm 4~8hr

取1ml离心收集菌体

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于1ml无菌生理盐水

离心

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于1ml无菌生理盐水

↓

离心

↓10000rpm, 5min

弃上清液

↓

悬浮沉淀于1ml无菌生理盐水

↓

单细胞菌悬液

↓UV 诱变

中间培养

↓

筛选

实验五    单因子实验方法进行碳源优化

一、目的和要求

掌握微生物发酵培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。

目的：筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，确定特定产物发酵的工艺参数。

二、仪器与试剂

1．仪器设备分光光度计、电热恒温水浴槽、天平、电炉。

2．玻璃仪器（每组需用量）

250 ml 三角瓶5 个， 500 ml 烧杯1 个，100 ml 量筒1 个，1mLTip 头1 盒

3. 需准备培养基（实验一）

三、实验方法

(一) 培养基的配制（碳源的优化）

以海水2216E 液体培养基（g/L：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，磷酸铁0.01，

pH 调至7.6-7.8）为基础， 碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、海藻糖和乳糖，每种碳源的添加量为1%。

（二）测定方法

在种子瓶内接入1 环斜面培养基上培养的细胞，28℃，160r/min 振荡培养12h作为种子液，将该种子培养液按2%(v/v)接种量（1mL）接种到含50 mL 液体发酵培养基的250 mL 三角瓶中再次进行摇瓶发酵，摇床转速160 r/min，28℃发酵培养24 h，取培养液测细胞干重。细胞干重测定：取1.5mL 离心管，首先称重M0，然后将发酵液摇匀，移液器取1.5mL 加入离心管，1000rpm 离心5min，小心吸出上清液，保留细胞沉淀，最后将离心管开口放入烘箱中烘干至恒重，再次

称重M，计算差值M-M0。

以细胞干重值为纵坐标，各种碳源为横坐标作图，比较不同碳源对细胞生长的影响，确定最佳碳源。

四、思考题

1. 对实验结果进行分析，讨论不同碳源对菌株生长的影响。

 从上图来看，细胞生长的最佳碳源为葡萄糖，其次为乳糖，利用最低的为柠檬酸钠。

   碳源可以提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分。主要来源为糖类、油脂、有机酸、低碳醇和其它CH化合物（石油类）。其中葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖。

2. 结合已学过的微生物工程理论课，讨论单因子实验方法的优缺点。

  单因子实验是指假设因素间不存在交互作用的前提下，一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考虑的优化方法。由于简单方便，一直都是培养基组分优化的最流行选择之一。其优点为操作起来简单容易；培养基组分的个体效应从图表上很明显的看出来而不需要统计分析；缺点为①忽略了组分间的交互作用，可能会丢失最适宜的条件②不能考虑因素的主次关系③当考虑的实验因素较多时，需要进行大量的实验和较长的周期。