发酵工程实验

紫外线对淀粉酶产生菌的诱变效应

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实验二 紫外线对淀粉酶产生菌的诱变效应

摘要: 研究了紫外线处理对产α － 淀粉酶的影响。结果表明: 采用30W 紫外线照射90s获得较好的突变效果; 利用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛，筛选得到1 株理想的突变株UV － 12，其酶活为3418. 8U/mL，比出发菌株提高了59. 7%。

关键词: α － 淀粉酶; 紫外线; 诱变

Abstract: The UV mutagenesis influenced on α － amylase yield from the producing strain bacterial has been studied. The results showed that the optimal conditions was irradiated 90s with 30W UV. A high and stable yield mutant was achieved by Screened with discolored zone and fermented in shake flask， and named UN － 12. The α － amylase activity of UN － 12 was 3418. 8 U/mL，which increased 59. 7% compared

with the original strain.

Key words:α － amylase; UV; Mutagenesis

α － 淀粉酶能以随机方式切断淀粉分子内的α － 1，4葡萄糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、低聚糖、含α － 1，6键的糊精［1］因此它在淀粉深加工、酒精、食品、饲料、医药等领域有广泛的应用前景［2 － 3］。目前α － 淀粉酶大多来源于微生物，产α － 淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌和曲霉［4］。国外已有利用黑曲霉发酵生产α － 淀粉酶的报道［5］。本实验以从土壤中筛选出的产淀粉酶的菌株为出发菌株，进行紫外线诱变育种，旨在探索诱变条件，提高菌株产酶能力，为实现α － 淀粉酶工业化生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

土壤中筛选出的产淀粉酶的菌株

1.2 主要仪器和设备

培养皿、移液管、刮铲、显微镜、紫外灯、磁力搅拌器、细胞计数平板等。

1.3 培养基( 1) 牛肉膏蛋白胨斜面培养基［6］; ( 2) 固体鉴别培养基: 可溶性淀粉5. 0g，蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g，琼脂10. 0g，pH7. 0，水1000mL; ( 3) 液体发酵培养基: 可溶性淀粉10. 0g，蛋白胨5. 0g，Na2HPO4 ·12H2O 4. 0g，KH2PO4 0. 3g，pH7. 0，水1000mL。

1.4 实验方法

1.41菌悬液制备

将筛选到的产酶能力较强的菌株从斜面接种到液体培养基中37℃振荡培养2d,吸菌液以1:10的接种量转接到液体培养基中继续培养1d后的菌液用于紫外诱变。

1.4.2 稀释

培养后的菌液通过细胞计数计算其中菌浓度，并用生理盐水将其稀释到1000—2000个/ml，备用

1.4.3紫外线诱变及筛选

将紫外线灯开关打开预热约10分钟。取直径6cm无菌平皿2套分别加入上述菌液5ml并放入无菌搅拌棒于平皿中。将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，一个平皿作为对照，不用紫外处理；另一平皿置于30W紫外灯下30cm处间歇照射90秒，每个时间段涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。然后用黑布包好置于37℃恒温培养箱中培养1d。注意每个平皿背面要标明处理时间。将培养1d后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。计算出紫外线处理后的存活细胞数及其致死率。

存活率=处理后菌落数/对照菌菌数*100%

致死率=（对照活菌落数-处理后活菌落数）/对照活菌落数*100%

将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加卢戈氏碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值、HC值等。与对照平板进行比较，根据结果说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上进行保存。

2结果与分析：

2. 1 诱变条件的选择

对出发菌株分别用紫外线诱变处理，得到致死曲线见图1。由图1 可知，出发菌株对紫外线比较敏感，而且致死率与诱变剂剂量存在正相关。当紫外线照射时间为90s 时，致死率为72. 8%，进一步提高照射时间，则致死率随之上升，当照射120s 时，致死率为92. 6%。一般认为，进行紫外诱变时，致死率为70% 左右时突变效果最好。因此，紫外线诱变的最适剂量为采用30W 紫外灯照射90s。

图1

2. 2 筛选结果

与出发菌株相比，经过紫外线诱变处理的菌株大部分酶活力有所提高，而且大部分致死率 大的菌株其酶活也高。但也有 致死率高而酶活较低的现象，如处理90s，120s的菌株。其中经过紫外线处理45s和60s的菌株的酶活力最强。透明圈最大，已使整个平板的淀粉完全分解，而经过15s处理的菌株其酶活力出现了倒退，低于出发菌株。结果如图。

图一45S处理 图二15S处理

图三45S（2）处理 图四60S处理

3 结论

研究了紫外线处理对从土壤中分离产α－ 淀粉酶的影响。出发菌株采用30W 紫外线照射后，涂布于固体鉴别平板上，再利用变色圈法进行筛选，得到理想的突变株，发现经过紫外线照射45s与60s从而获得的突变株淀粉酶活性最强。明显高于出发菌株。紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用。

4 注意事项

1 紫外诱变时注意将超净工作台玻璃拉下，避免紫外照射对人体会造成伤害，并将其他未诱变细菌盖上，诱变结束后马上打开红光灯，阻止细菌DNA复性；

2 血细胞计数板在用前和用后需要洗净，防止杂志或上一次计数未洗净的细胞影响计数的准确性；

3 大头针在用前在酒精灯上灼烧灭菌，凉后放入菌液中；

4 实验遵循严格的无菌操作，所用器具军需高温蒸汽灭菌；

5 超净工作台在使用前需要紫外灭菌，灭菌后打开风扇，使用过程中须关闭紫外灯，实验员进入超净工作台前必须用酒精将守擦洗干净，并擦拭操作台面；

6 高温蒸汽灭菌锅灭菌结束后不能直接打开，避免造成所灭液状物质喷溅；

7 细胞计数时，菌液吸取前必须吹打。

5 实验意见

本实验中计算致死率使用的是将诱变后的菌液和未诱变的菌液分别涂于平板上，培养后分别观察统计平板上生长出的单菌落数。致死率=诱变产菌落数/未诱变产菌落数*100%。由此结果作为紫外线处理的致死率。由于在实验过程中所涂平板个数有限，紫外线处理使长出菌落数减少，加上实验室条件限制容易出现杂菌污染是菌落不易区分，这些种种因素都是统计过程中的样本个数严重减少，不可避免的出现偶然误差，影响统计结果准确性。因此我建议，在以后实验中，致死率应当用血细胞计数的方法求得。具体做法：诱变过后染色用血细胞直

接计数（也可取少量经过适当稀释后再染色计数）致死率=诱变后细菌个数/未诱变细菌数*100%。这样做是直接统计存活细胞数和死亡细胞数，减少由菌落数间接测致死率过程中的偶然误差。

6 参考文献

［1］张丽苹，徐岩，金建中. 酸性α － 淀粉酶的研究与应用［J］. 酿酒，2002，29( 3) : 19 － 21.

［2］Growth of submerged Mycelia of Aspergillus kawachii in Solid － StateCulture［J］. Journal of Fermentation and Bioengineering: 1995: 79( 3) : 252 － 256. ［3］欧阳平凯. 化工产品手册( 第三版) ［M］. 北京: 中国轻工业出版社，1999.

 

第二篇：紫外线诱变实例