实验单向免疫扩散(Single immunodiffusion)

一、基本原理

免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。　单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，单向免疫扩散实验常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。因此通常是把抗体先混合在琼脂中，以不同稀释度的抗原在琼脂中扩散。将定量抗体与熔化的含缓冲液的琼脂均匀混合，倾注平板，凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入待检抗原溶液，放室温或37℃让其自由扩散，24-48h后，可见孔的周围出现沉淀环。抗原在一定范围内，沉淀环的直径与抗原的量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。单向免疫扩散试验是一种定量试验，主要用于血清中免疫蛋白（IgG、IgM、IgA）含量的测定。

单向免疫扩散示意图

二、材料与器材

(一)抗体：标准羊抗人IgG单价抗血清（抗体）（商品有售）。

(二)抗原：①工作标准参考蛋白（IgG，含量10mg/ml）（参考血清）（商品有售），

②人全血清（作为待测血清），

(三)生理盐水（采用0.9%的生理盐水），

(四)其他用品：打孔器（孔径3mm），微量加样器（10微升），小离心管、载玻片、湿盒、量尺、水浴箱等。

三、实验方法

（一）标准曲线的制备：

（１）制备含抗体的琼脂凝胶板：

A、制胶：用生理盐水配制1.5%琼脂糖凝胶，微波炉中煮沸熔化至澄清后，移置56℃水浴箱中保温备用。量取56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入氨苄青霉素（200μl/ml），和羊抗人IgG抗体（1︰60，v/v）充分混合，继续保温于56℃水浴中备用。

另再制备不加抗体与氨苄青霉素的1.5%琼脂凝胶50ml，煮沸熔化至澄清。亦保温于56℃水浴备用。

C、铺胶：用针管吸取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于干净的载玻片上，厚度约为1.5mm。室温冷却凝固。（每小组制备3～4块胶板）。

D、 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3.5mm，孔距10～12mm（载玻片分三份，每份中央打孔，见下面示意图）。在同一直线上用打孔器打孔。挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔的边缘。

E、 封底：用微量移液枪于各小孔中加入未加抗体与氨苄青霉素的琼脂少许（5-10μl/），以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。

打孔方案

（2）稀释工作标准参考蛋白：用小离心管将标准参考蛋白用生理盐水稀释成1︰10、1︰16、1︰20、1︰32、1︰40。

（3）加样：用微量加样器将已稀释的五个稀释度的工作标准蛋白以及空白（生理盐水）依次加样，每个加两孔， 每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头；加样时毛细滴管尖端不要划破琼脂。同时注意不要产生气泡，以加满为度（但不要溢出）。加少了，影响反应程度，加多了，易溢出，也影响反应结果。）。

（4）扩散：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时。

（5）绘制标准曲线：测量出并记录各份标本的沉淀环直径Φ，并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（mg/ml）为横座标，绘制成标准曲线。

（二）待测血清中IgG水平值的测定：

（１）稀释待测血清：用小离心管将待测血清用生理盐水稀释成1︰2、1︰6、1︰10、1︰20、1︰30、1︰40。

（２）加样：用微量加样器分别取稀释的待测血清标本以及空白（生理盐水）加入琼脂胶板各孔中，每孔10μl。

（３）温育扩散：加样完毕，将作好标记的琼脂板平放放入湿盒中，垫湿纱布或海绵以防干燥，湿盒置37°C温箱，24～28小时后观察结果。

（4）结果观察与分析：测量并求出每份检样两孔的沉淀环平均直径Φ，并按照标准曲线计算出待检血清IgG含量。写出较完整的实验报告。未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。

四、实验结果

免疫球蛋白的含量用mg/ml表示，不同批号的参考血清其免疫球蛋白含量不一。

沉淀环的大小与抗原的浓度基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关，而且和琼脂中抗体的浓度有关。相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一侧。

标准抗原浓度（mg/100ml）标准曲线图

从标准曲线上可查得待检血清相应的IgG含量乘以稀释倍数，即为待见血清中IgG的实际含量。

五、思考题：分析试验结果并探讨试验要点。

六、注意事项

ü  琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉,若用普通的琼脂条,应事先进行净化精制。

ü  制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。

ü  制备琼脂板应在水平台上进行,防止产生厚薄不匀。板的厚度要求一致。 浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。

ü  加滴孔中的抗原和血清时,孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。

ü  加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。

ü  在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

ü  不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。

ü  加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头。

ü  抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。

 

第二篇：20xx年实验室培训讲义

陕西著名药业集团

药品检验培训讲义

质量技术部

2013

1

第一部分 基本常识

第一章 允许差

一、准确度和误差

1.准确度 系指测得结果与真实值接近的程度。

2.误差 系指测得结果与真实值之差。

二、精密度和偏差

1.精密度 系指在同一实验中，每次测得的结果与它们的平均值接近的程度。

2.偏差 系指测得的结果与平均值之差。

三、误差和偏差

由于“真实值”无法准确知道，因此无法计算误差。在实际工作中，通常是计算偏差（或用平均值代替真实值计算误差，其结果仍然是偏差）。

四、绝对偏差和相对偏差

绝对偏差 = 测得值－平均值

绝对偏差

相对偏差 = 平均值

五、标准偏差和相对标准偏差

1.标准偏差 是反映一组供试品测定值的离散的统计指标。

若设供试品的测定值为Xi，则其平均值为X，且有n个测定值，那么标准偏差为：

1.标准偏差（SD）

(x?x)2

SX = n?1

2.相对标准偏差（RSD）

SX

RSD = 100%

x第二章 有效数字的修约及其运算

一、有效数字

1.在检验分析工作中实际能测量到的数字就称为有效数字。

2.在记录有效数字时， 规定只允许数的末位欠准，而且只能上下差1。

二、有效位数

1.在其它十进位数中，有效数字系指从非零数字最左一位向右数而得到的位数。例如3.2、0.32、0.032和0.0032均为两位有效位数，0.320为三位有效位数、10.00为四位有效位数，12.490为五位有效位数。

2.有效数字的首位数字为8或9时，其有效位数可以多计一位。例如：85%与 115%，都可以看成是三位有效位数；99.0%与101.0%都可以看成是四位有效数字。

三、有效数字修约规则

用“四舍六入五成双”规则舍去过多的数字。

即当尾数≤4时，则舍；尾数≥6时，则入；尾数等于5时，若5前面为偶数则舍，为奇数时则入。当5后面还有不是零的任何数时，无论5前面是偶或奇皆入。

例如：将下面左边的数字修约为三位有效数字

2.324→2.32 2.325→2.32 2.326→2.33

2.335→2.34 2.32501→2.33

四、有效数字运算法则

1.在加减法运算中，每数及它们的和或差的有效数字的保留，以小数点后面有效数字位 2

数最少的为标准。在加减法中，因是各数值绝对误差的传递，所以结果的绝对误差必须与各数中绝对误差最大的那个相当。

例如：2.0375＋0.0745＋39.54 = ？

39.54是小数点后位数最少的，在这三个数据中，它的绝对误差最大，为±0.01，所以应以39.54为准，其它两个数字亦要保留小数点后第二位，因此三数计算应为：

2.04＋0.07＋39.54 = 41.65

2.在乘除法运算中，每数及它们的积或商的有效数字的保留，以每数中有效数字位数最少的为标准。在乘除法中，因是各数值相对误差的传递，所以结果的相对误差必须与各数中相对误差最大的那个相当。

例如：13.92×0.0112×1.9723 = ？

0.0112是三位有效数字，位数最少，它的相对误差最大，所以应以0.0112的位数为准，即：

13.9×0.0112×1.97 = 0.307

3.分析结果小数点后的位数，应与分析方法精密度小数点后的位数一致。

4.检验结果的写法应与药典规定相一致。

第三章 药典、行业标准中有关概念及规定

一、试验温度

1.水浴温度 除另有规定外，均指98～100℃；

2.热水 系指70～80℃；

3.微温或温水 系指40～50℃；

4.室温 系指10～30℃；

5.冷水 系指2～10℃；

6.冰浴 系指约0℃；

7.放冷 系指放冷至室温。

二、取样量的准确度

1.试验中供试品与试药等“称量”或“量取”的量，均以阿拉伯数码表示，其精确度可根据数值的有效数位来确定，如称取“0.1g”，系指称取重量可为0.06～0.14g；称取“2g”，系指称取重量可为1.5～2.5g；称取“2.0g”，系指称取重量可为1.95～2.05g；称取“2.00g”，系指称取重量可为1.995～2.005g。

2.“精密称定”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。

3.“称定”系指称取重量应准确至所取重量的百分之一。

4.“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精密度要求。

5.“量取”系指可用量筒或按照量取体积的有效位数选用量具。

6.取用量为“约”若干时，系指取用量不得超过规定量的±10%。

三、试验精密度

1.恒重 除另有规定外，系指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在0.3mg以下的重量；干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定条件下继续干燥1小时后进行；炽灼至恒重的第二次称重应在继续炽灼30分钟后进行。

2.试验中规定“按干燥品（或无水物，或无溶剂）计算”时，除另有规定外，应取未经干燥（或未去水，或未去溶剂）的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重（或水分，或溶剂）扣除。

3.试验中的“空白试验”，系指在不加供试品或以等量溶剂替代供试液的情况下，按同法操作所得的结果；含量测定中的“并将滴定的结果用空白试验校正”，系指按供试品所耗滴定液的量（ml）与空白试验中所耗滴定液量（ml）之差进行计算。

4.试验时的温度，未注明者，系指在室温下进行；温度高低对试验结果有显著影响者，除另有规定外，应以25℃±2℃为准。

3

四、试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。酸碱度检查所用的水，均系指新沸并放冷至室温的水。

五、酸碱性试验时，如未指明用何种指示剂，均系指石蕊试纸。

六、液体的滴，系在20℃时，以1.0ml水为20滴进行换算。

七、本版药典使用的滴定液和试液的浓度，以mol/L（摩尔/升）表示者，其浓度要求精密标定的滴定液用“XXX滴定液（YYYmol/L）”表示；作其他用途不需精密标定其浓度时，用“YYYmol/L XXX溶液”表示，以示区别。

八、限度

1.标准中规定的各种纯度和限度数值以及制剂的重（装）量差异，系包括上限和下限两个数值本身及中间数值。规定的这些数值不论是百分数还是绝对数字，其最后一位数字都是有效位。

试验结果在运算过程中，可比规定的有效数字多保留一位数，而后根据有效数字的修约规则进舍至规定有效位。计算所得的最后数值或测定读数值均可按修约规则进舍至规定的有效位，取此数值与标准中规定的限度数值比较，以判断是否符合规定的限度。

2.原料药的含量（%），除另有注明者外，均按重量计。如规定上限为100%以上时，系指用本药典规定的分析方法测定时可能达到的数值，它为药典规定的限度或允许偏差，并非真实含有量；如未规定上限时，系指不超过101.0%。

九、溶解度试验法：

除另有规定外，称取研成细粉的供试品或量取液体供试品，置于25℃±2℃一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况，如看不见溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。

十、含量测定必须平行测定两份，其结果应在允许相对偏差限度之内，以算术平均值为测定结果，如一份合格，另一份不合格，不得平均计算，应重新测定。

十一、记录复核

检验记录完成后，应有第二人对记录内容、计算结果进行复核。复核后的记录，属内容、计算错误，复核人要负责；属检验错误复核人无责任。

第四章 药材和饮片取样法

药材和饮片取样法系指供检验用药材或饮片样品的取样方法。

取样时均应符合下列有关规定，

一、抽取样品前，应核对品名、产地、规格等级及包件式样，检查包装的完整性、清洁程度以及有无水迹、霉变或其他物质污染等情况，详细记录。凡有异常情况的包件，应单独检验并拍照。

二、从同批药材和饮片包件中抽取供检验用样品的原则：

总包件数不足5件的，逐件取样；

5～99件，随机抽5件取样；

100～1000件，按5％比例取样；

超过1000件的，超过部分按1％比例取样；

贵重药材和饮片，不论包件多少均逐件取样。

三、每一包件至少在2～3个不同部位各取样品1份；包件大的应从10cm以下的深处在不同部位分别抽取；对破碎的、粉末状的或大小在1cm以下的药材和饮片，可用采样器（探子）抽取样品；对包件较大或个体较大的药材，可根据实际情况抽取有代表性的样品。

每一包件的取样量：

一般药材和饮片抽取100～500g；

粉末状药材和饮片抽取25～50g；

贵重药材和饮片抽取5～10g。

四、将抽取的样品混匀，即为抽取样品总量。若抽取样品总量超过检验用量数倍时，可 4

按四分法再取样，即将所有样品摊成正方形，依对角线划“×”，使分为四等份，取用对角两份；再如上操作，反复数次，直至最后剩余量能满足供检验用样品量。

五、最终抽取的供检验用样品量，一般不得少于检验所需用量的3倍，即1/3供实验室分析用，另1/3供复核用，其余1/3留样保存。

第五章 玻璃器皿的使用和清洗

一、玻璃仪器使用注意事项：

1、 轻拿轻放；

2、 加热时应擦净外壁的水滴；

3、 非标准磨口应固定配合使用；

4、 加热面积大时，应垫石棉网；

5、 有准确刻度的容器不能烘干、加热。

6、 不宜长时间接触碱，磨口的不可用于装碱。

二、玻璃仪器的洗涤方法

（1）一般的玻璃仪器（如烧瓶、烧杯等）：先用自来水冲洗一下，然后用肥皂、洗衣粉用毛刷刷洗，再用自来水清洗，最后用纯化水冲洗3次。

（2）精密或难洗的玻璃仪器（滴定管、移液管、量瓶、比色管、玻璃垂熔漏斗等）：先用自来水冲洗后，沥干，再用铬酸清洁液处理一段时间（一般放置过夜），然后用自来水清洗，最后用纯化水冲洗3次。 一个洗净的玻璃仪器应该不挂水珠。

第六章 分析天平的称量

一. 简述

以杠杆原理构成的天平为机械天平；以电磁力平衡原理，直接显示质量读数的天平为电子天平。

二. 分析天平的使用

1.使用前的准备 根据称取物质的量和称量精度的要求，选择适宜精度的天平。要求精密称定时，当取样量大于100mg，选用感量为0.1mg的天平，在100～10mg选用感量为0.01mg 的天平，小于10mg选用感量为0.001mg天平。

2.检查该天平的使用登记记录，并检查水准器内的气泡是否位于水准器圆的中心位置。 3必要时用软毛刷将天平盘上的灰尘轻刷干净。

4称量前，应先调好零点。

5称量时使用的器皿，应根据称量需要选用大小适宜的称量瓶或称量管。

6使用完毕，应在天平使用登记本上登记。

7电子分析天平的使用时预热至少30分钟以上。

三.注意事项

1天平室空调的冷气/暖气，不宜直接吹入天平室，应由天花板隔离进风。

2分析天平不要放置在空调器下的边台上。搬动过的分析天平必须校正好水平。 3开启或关闭天平的动作应轻缓仔细。

4称量时，不要开动和使用前门，以防呼吸出的热量、水汽和二氧化碳及气流影响称量。取、放被称物体和砝码时，可使用两侧门，关门时应轻缓。

5称取吸湿性、挥发性或腐蚀性物品时，应将称量瓶盖紧后称量，且尽量快速，注意不要将被称物，（特别是腐蚀性物品）洒落在称盘或底板上。

6同一个试验应在同一台天平上进行称量，以免由称量产生误差。

7称量的质量不得超过天平的最大载荷。

8称量物的温度必须与天平箱内的温度相同。

9电子分析天平不能称量有磁性或带静电的物体。

四.分析天平的维护与保养

分析天平应按计量部门规定定期检定，并有专人保管，负责维护保养。经常保持天平内 5

部清洁，必要时用软毛刷或绸布抹净或用无水乙醇擦净。

第二部分 检验方法概论

第一章 滴定分析法

一、滴定分析法的原理与种类

1.原理

滴定分析法是将一种已知准确浓度的试剂溶液，滴加到被测物质的溶液中，直到所加的试剂与被测物质按化学计量定量反应为止，根据试剂溶液的浓度和消耗的体积，计算被测物质的含量。

2.滴定分析的种类

（1）直接滴定法

（2）间接滴定法

a 置换法 利用适当的试剂与被测物反应产生被测物的置换物，然后用滴定液滴定这个置换物。

b 回滴定法（剩余滴定法） 用定量过量的滴定液和被测物反应完全后，再用另一种滴定液来滴定剩余的前一种滴定液。

二、滴定液

滴定液系指已知准确浓度的溶液，它是用来滴定被测物质的。滴定液的浓度用“XXX滴定液（YYYmol/L）”表示。

（一）配制

1.直接法

2.间接法

（二）标定

（三）初标 平行试验3份。

（四）复标 由第二人进行再标定, 平行试验3份。

（五）误差限度

1. 初标和复标 初标和复标的平行试验3份的相对平均偏差均不得超过0.1%。

2.结果 初标平均值和复标平均值的相对偏差不得过0.1%。

3.结果计算 如果初标与复标结果满足误差限度的要求，则将二者的算术平均值作为

结果。

（六）使用期限

滴定液必须规定使用期。除特殊情况另有规定外，一般规定为一到三个月，过期必须复标。出现异常情况必须重新标定。

三、含量计算公式

1.直接滴定法

V×F×T

供试品（%）= ———— ×100%

ms

（V样－V空）×F×T

供试品（%）= —————————- ×100%

ms

2剩余滴定法

（V空－V样）×F×T

供试品（%）= —————————- ×100%

ms

6

3标示量及标示量%的计算

1.片剂标示量%计算

V×F×T×平均片重

标示量% = ——————————————— ×100%

供试品的重量/稀释倍数×标示量

2.针剂标示量%的计算

V×F×T

标示量% = ——————————————————×100%

供试品的ml数/稀释倍数×每ml的标示量

四、化学试剂等级

1.优级纯，（符号G.R.），我国产品用绿色标签作为标志。

2.分析纯，（符号A.R.），我国产品用红色标签作为标志。

3.化学纯，（符号C.P.），我国产品用蓝色标签作为标志，。

4.基准试剂 通常专用作容量分析的基准物质。

5.光谱纯试剂（符号S.P.），这种试剂主要用于光谱分析中。

6.色谱纯试剂 用于色谱分析。

7.生物试剂 用于某些生物实验中。

五．滴定管的分类及使用方法

1.滴定管的种类

（1）酸式滴定管（玻塞滴定管）

（2）碱式滴定管

2．使用方法

3．操作注意事项

第二章 水溶液酸碱中和法（中和法）

一、定义

以酸碱中和反应为基础的容量分析法称为酸碱中和法（亦称酸碱滴定法）。

二、原理

以酸（碱）滴定液，滴定被测物质，以指示剂或仪器指示终点，根据消耗滴定液的浓度和毫升数，可计算出被测药物的含量。

+- 反应式： H ＋ OH →← H2O

三、酸碱指示剂

（一）指示剂的变色原理

常用的酸碱指示剂是一些有机弱酸或弱碱，它们在溶液中能或多或少地电离成离子，而且在电离的同时，本身的结构也发生改变，并且呈现不同的颜色。

四、适用范围

（一）直接滴定

-8 1.酸类：强酸、CKa大于10的弱酸、混合酸、多元酸都可用碱滴定液直接滴定。

-8 2.碱类：强碱、CKb大于10的弱碱可用酸滴定液直接滴定。

-7 3.盐类：一般来说，强碱弱酸盐，如其对应的弱酸的Ka小于10，可以直接用碱滴定液

-7滴定；强酸弱碱盐，如其对应的弱碱的Kb小于10，可直接用酸滴定液滴定。

（二）间接滴定

1.有些物质具有酸性或碱性，但难溶于水，这时可先加入准确过量的滴定液，待作用完全后，再用另一滴定液回滴定。

7

2.有些物质本身没有酸碱性或酸碱性很弱不能直接滴定，但是它们可与酸或碱作用或通过一些反应产生一定量的酸或碱，我们就可用间接法测定其含量。

十、允许差

本法的相对偏差不得超过0.3%。

第三章 薄层色谱法

薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。

1.仪器与材料

（1）薄层板

市售薄层板 市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。

自制薄层板 在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2％～0.5％）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。使用涂布器徐布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。

（2）点样器 一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。

（3）展开容器 上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开缸。

（4）显色装置 喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸溃显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。

（5）检视装置 为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。

（6）薄层色谱扫描仪 系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。

2.操作方法

（1）薄层板制备

市售薄层板 临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。

自制薄层板 除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。

（2）点样 除另有规定外，在沽净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线离底边8～10mm。圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为5～10mm。高效板条带宽度一般为4～ 8

8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。

（3）展开 将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。

（4）显色与检视 供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。

（5）记录 薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。

3.系统适用性试验

按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度和重复性要求。

（1）检测灵敏度 用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点．

（2）分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：

R＝2（d2－d1）／（W1＋W2）

式中 d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；

d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；

W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

（3）重复性 同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0％；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0％。

4.测定法

（1）鉴别 取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。

（2）限度检查 采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定检查的斑点数和限量值。

（3）含量测定 照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

5.薄层色谱扫描法

系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于鉴别、检查或含量测定。测定时可根据不同薄层扫描仪的结构特点，按照规定方式扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。

扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf值）和光谱扫描得到的 9

吸收光谱图或侧得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。薄层扫描定量测定应保证供试品斑点的量在线性范围内，必要时可适当调攀供试品溶液的点样量，供试品与对照品同板点样、展开、扫描、测定和计算。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采角线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正多项式回归计算。供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度不得少于2个。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。

第四章张 仪器分析法

第一节 紫外-可见分光光度法

一、原理

紫外—可见分光光度法是通过被测物质在紫外光区的特定波长处或一定波长范围内 的吸光度，对该物质进行定性和定量分析的方法。朗伯-比尔（Lambert-beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：

式中 A为吸光度；

T为透光率；

E为吸收系数；

C为溶液浓度；

L为光路长度。

1%如溶液的浓度（C）为1%(g/ml)，光路长度（L）为cm,相应的吸光度即为吸收系数以E1cm表

示。如溶液的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L），光路长度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。

二、使用范围

凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。

三．测定方法

1.对照品比较法

2.吸收系数法

3.计算分光光度法

四、注意事项

1测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合

2.所测溶液必须澄清，不得有浑浊， 。

3使用的石英吸收池必须洁净。当吸收池中装入同一溶剂，在规定波长测定各吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。

4.测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照。

5取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧。应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，装样品溶液的体积以池体积的4/5为度，

6.在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。

7.一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。

8．使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。

9. 吸收池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸（3：1v/v） 混合液稍加浸泡后，洗净备用。

五、允许差

10

仪器分析方法的误差限度，除另有规定外，其相对偏差应应不大于2.0%。

第二节 高效液相色谱法

一、原理

高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。

二、适用范围

高效液相色谱法是一种分离分析方法，适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物等的定性、定量分析。中国药典主要用于药品的含量测定、有关物质检查、杂质限度检查和鉴别等。

三、仪器组成

高效液相色谱仪主要由输液泵系统、进样器系统、色谱柱、检测器、记录器、显示器及数据处理机等组成。

四、系统适用性试验

2 1.色谱柱的理论板数（n） n = 5.54(tR/Wh/2)

2.分离度（R） 除另有规定外，分离度应大于1.5。

2(tR2－tR1)

R = ————

W1＋W2

3.重复性 测量值的相对标准偏差应不大于2.0%

4.拖尾因子（T） 除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。

W0.05h

T = ——

2d1

五、测定法

（一）内标法

（二）外标法

（三）加校正因子的主成分自身对照法

（四）不加校正因子的主成分自身对照法

（五）面积归一化法

六、高效液相色谱仪注意事项及保养

（一）.对水的要求：

（二）对流动相的要求

（三）进样器的使用及保养：

（四）泵的保养：

（五）色谱柱的保养：

（六）紫外灯的保养：

七、允许差

含量测定的精度，除另有规定外，其相对标准偏差应不大于2.0%。

11