实验名称 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析

实验日期 20##年10月25号  实验地点 生化实验室

合作者               指导老师

总分                   教师签名             批改日期

碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

一 实验原理

1、碱性磷酸酶的分离纯化

     AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

2、碱性磷酸酶的比活性测定

     根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg??pr）来表示。因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

     在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表示：                   

式中：Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数；V代表反应的起始速度。

①  当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。

②  Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。

③  Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-Burk双倒数作图法。此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。方程式与图如下：

本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图计算其Km值。实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。

二、实验材料

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定

１、样品

　兔肝

２、试剂

①  0.5mol/L乙酸镁溶液

②  0.1mol/L乙酸钠溶液

③  0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液

④  0.01mol/L　Tris－0.01mol/L乙酸镁PH８.８缓冲液

⑤  丙酮（分析纯）

⑥  95%乙醇（分析纯）

⑦  正丁醇（分析纯）

⑧  0.04mol/L底物液

⑨  １mg/ml分标准液

⑩  0.5mol/LＮａＯＨ

?  0.3% 4－氨基安替比林

?  0.5%铁氰化钾

?  0.1mg/mL蛋白标准液

?  碱性铜试剂

?  酚试剂

３、仪器与器材

①  研钵

②  刻度离心管

③  刻度吸管

④  电动离心机

⑤  玻璃漏斗和玻璃棒

⑥  托盘天平

⑦  恒温水浴

⑧  可见分光光度计

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

１、样品

兔肝匀浆液

２、试剂

①  0.04mol/L底物液

②  0.1 mol/L碳酸盐缓冲液PH10（37℃）

③  碱性溶液

④  0.5%铁氰化钾

⑤  0.3% 4－氨基安替比林

⑥  酚标准液（0.1mg/ml）

３、仪器与器材

①  恒温水浴锅

②  可见光分光光度计

三、实验步骤

（一）AKP的提取

　

　　　　　　　　　　　　　AKP提取实验步骤

(二) AKP的比活性测定

1、AKP的活性测定

AKP活性测定实验步骤

2、蛋白质含量测定

蛋白质含量测定实验步骤

（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

1、底物浓度对酶促反应速度的影响

将新鲜兔肝用PH10.0 0.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可

酶曲线绘制步骤

2、酚标准曲线的绘制的绘制

酚标准曲线的绘制的绘制步骤

注意事项

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定

1、在纯化过程中，各步加入的有机试剂要计算精确。

2、加入有机试剂混匀后应立即离心，不宜放置过久。

3、在测定酶活性时，每加入一种试剂须立即混匀，避免浑浊。

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

1、血清取量要准确。

2、标准曲线必须是过原点的一条直线。

3、在酶促反应中，每管加入后立即计时，保证各管反应时间一致。

 

第二篇：实验报告

实验二    加热条件对于鱼糜制品凝胶特性的影响

(一) 实验原理

在鱼糜制品的加工过程中,蛋白质的凝胶特性对于产品的得率、组织特性、持水性、黏结性以及感官质量具有重要的影响，因此，它是鱼糜制品生产过程中关键的控制指标之一。

目前一般认为，鱼肉蛋白质形成凝胶的过程主要经过三个阶段，即：凝胶化，凝胶劣化和鱼糕化。其间肌球蛋白和肌动蛋白逐渐形成一个较为松散的空间网状结构，由溶胶变为凝胶，之后发生断裂，最终转变为有序、非透明状、具有较高凝胶强度的鱼糕。加热条件是影响这一过程的关键工艺因素，尤其是加热温度和加热速度，对于产品最终的凝胶特性具有显著的影响。

利用流变仪或食品质构仪，可以测定鱼糜制品的硬度和弹性，计算其凝胶强度，并由此分析工艺条件对于蛋白质凝胶特性的影响。

（二）试剂和设备

市售鲜活海水鱼，天然肠衣，食盐，山梨醇，蔗糖，三聚磷酸钠，焦磷酸钠。

NRM—2003J流变仪，低温冰柜，灌肠机，擂溃机，恒温水浴。

（三）实验步骤

1.  鱼糜的制备

称取约5kg原料鱼,去鳞、内脏、头、尾，用清水洗去黏液和血污，采肉并称重，然后用5倍质量的清水（〈10℃〉漂洗4次，以滤布挤压脱水，依次加入4%山梨醇、4%蔗糖、0.2%三聚磷酸钠和0.1%焦磷酸钠。若不能立即使用，于—18℃冷冻贮藏。

2．鱼香肠的制作

取鱼糜样品进行擂溃，先空擂5min，然后加入3%食盐再擂溃20min，灌肠（d=25mm），然后依照表3-1分别进行加热处理。

                鱼糜制品加热条件对于凝胶特性的影响

加热结束后将样品取出，在冰水中迅速冷却30min,然后于室温放置24h,供测定用。

3．鱼糜制品凝胶强度的测定

将样品切成13mm厚的圆柱体，利用NRM-2003J流变仪进行测定。压头直径为5mm,样品上升速度为6cm/min,压到凝胶破断时的凹陷深度为凝胶的强度值（cm），此时的破断强度为硬度值（g），根据以下公式计算凝胶强度：

                    凝胶强度（g·cm）=硬度值×强度值

4．结果分析

          蓝色：加热20min       红色：加热60min

根据得到的实验室结果，以凝胶强度为纵坐标、以加热温度为横坐标作图，分别讨论

加热温度、时间和加热方式（一段或两段式）对于凝胶特性的影响。

分析:由上数据可以看出，无论哪个加热时间，该曲线都呈现“V”型，当加热时间相同时，凝胶强度从40℃~60℃呈下降趋势，60℃~80℃呈上升趋势；而在一定的温度下(如上图蓝色“V”型内的区域)，凝胶强度随加热时间的增加而增加;而在一定的温度下(如上图蓝色“V”型外的区域)，凝胶强度随加热时间的增加而减少

（四）注意事项

1．由于鱼头及鱼的内脏颜色较深，且内脏中含有蛋白分解酶，鱼头及内脏的残留不但影响鱼糜的感官，而且影响鱼糜制品的弹性。

2．制作鱼糜的原料鱼要求新鲜。捕捞的原料要求冰藏，并在24h内加工完毕。

思考题

1．鱼糜中蛋白质的凝胶机理是怎样的？主要影响因素有哪些？

答：鱼肉中加入食盐进行擂溃过程中构成肌原纤维中的F-肌动蛋白与肌球蛋白，在受热情况下，高级结构发生松散，分子间产生架桥形成了三维的网状结构。自由水被封锁在网目中不能流动，从而形成了具有弹性的凝胶状物。

影响因素：鱼种特异性，鱼的鲜度，温度，pH，离子浓度，氧等

2．鱼糜制备过程中加入山梨醇、庶糖、三聚磷酸钠、焦磷酸钠的作用的什么？

答：山梨醇的作用：保湿剂、防腐剂和甜味剂，提高食品风味以及延长保藏时间

蔗糖的作用：在冷冻鱼糜中作为蛋白质冷变性剂、抑制剂，改善风味。

三聚磷酸钠的作用：品质改良剂，对金属离子有螯合作用，能提高产品胶溶、乳化和分散的作用，防止结块，具有吸湿性。此外还具有缓冲作用。

焦磷酸钠的作用：品质改良剂，改善产品乳化性，可作为螯合剂和缓冲剂。

3．擂溃的目的是什么？为什么中间加入食盐？

答：擂溃的目的是使鱼肉纤维组织进一步破坏，增强凝胶性。鱼肉擂散后，若直接将它加热，虽会凝固，但有多层的游离水，不能成为具有弹性的凝胶。但是加盐后擂溃的鱼糜，一经加热，就可成为具有弹性的凝胶，看不到游离的水分。因为擂溃和加入食盐能促进盐溶性蛋白质（肌原纤维蛋白质）溶出，溶出的蛋白质便形成网状结构，把水分封闭在网状结构中不使它游离，产生保水性，就可制成具有弹性的鱼糜制品，使鱼糜成为粘性很强的溶胶。

4．随加热温度提高，凝胶强度出现了“V”形趋势的原因是什么？

答：在鱼肉蛋白凝胶化过程中，低温凝胶化的效果比高温凝胶化好，原因是低温利于氢键形成。长时间利于激活内源性转谷氨酰胺酶还有其他热变形作用、二硫键、蛋白降解等因素。在70℃-75℃以下加热则弹性很差，尤其是在50℃-60℃下加热，则将成为没有弹性的产品。这是因为已经形成的网状结构遭到破坏，水分游离，变成明胶状的凝胶，超越了所谓“戾”现象而失去弹性。