实验一 革兰染色法、细菌的特殊染色法

实验目的：掌握细菌革兰染色的原理与方法；

掌握细菌芽孢染色的基本原理与方法；

熟悉普通光学显微镜的油镜使用与保养方法。

实验材料：菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

试剂：结晶紫、碘液、95%乙醇、番红花红、孔雀绿

实验内容：

1.革兰染色

染色方法：革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师Gram创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）后，用脱色剂（酒精或丙酮）脱色，再用复染剂染色。如果细菌不被脱色而保存原染液颜色者为革兰阳性菌(G＋)；如被脱色，而染上复染液的颜色者为革兰阴性菌(G-)。此染色法可将所有具有细胞壁的细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

染色原理：现在认为细菌对革兰染色的不同反应主要是革兰阳性菌和阴性菌的细胞壁结构与化学组成不同。革兰阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量多，且交联度大，脂类含量少，经95％乙醇脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，与细胞结合的结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细胞仍保留初染时的颜色。而革兰阴性菌的细胞壁较薄，含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少，乙醇脱色时溶解外层类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染的颜色。

染色过程：涂片（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（结晶紫染色1min）→媒染（碘1min）→水洗→95%乙醇脱色（1min）→复染（番红花红染色1min）→干燥→镜检（油镜）

注意事项：

（1）菌种应选用对数期的菌种；

（2）涂片不易过厚，涂片薄而均匀为好；

（3）脱色不足或脱色过度均会造成革兰染色的假阳性或假阴性，脱色时间

取决于涂片厚度、室温等。

2.芽孢染色

芽孢是某些细菌在生长发育的后期在细胞内形成的圆形或椭圆型的抗逆性比较强的休眠体，是细菌的一种特殊构造。

染色原理：芽孢是利用细菌细胞不同部分与染料的亲和力不同，用特殊染色法使之显示出不同的颜色，籍以显微观察。芽孢具有厚而致密的壁，折光性强，通透性低，不易着色，用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（呈无色透明）。芽孢色法就是根据芽孢具有既难以染色而一旦染上色后又不易脱色的特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个原则，既除了用着色力强的染料外，还需要加热或延长染色时间等，促进标本着色。然后使菌体脱色而芽孢上的染料仍保留。经复染后，菌体和芽孢呈不同的颜色，这里采用孔雀绿染色法。此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用沙黄进行复染，此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色，使之呈现不同的颜色，以便显微镜观察。

染色过程：涂片（枯草芽孢杆菌）→干燥→固定→初染（孔雀绿染色

20-30min）→水洗→复染（番红花红染色1min）→干燥→镜检

注意事项：

（1）涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，

（2）水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。

（3）涂片在干燥过程中，不易在火焰远端加热干燥。

3.显微镜油镜的使用与保养

使用方法：

（1） 在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转

换油镜时，从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而

又不以压破载玻片为宜。

（2） 用双眼观察目镜，并慢慢转动粗调节器至出现模糊物象，然后用细

调节器至物象清晰为止。

（3） 如果不出现物象或者目标不理想要重找。

（4） 油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许乙醇将镜头上和标本上的香柏油

擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。

注意事项：

（1） 持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手提取，以免零

件脱落或碰撞到其它地方。

（2） 轻拿轻放，不可把显微镜放置在实验台的边缘，以免碰翻落地。

（3） 保持显微镜的清洁，光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭，切忌口吹

手抹或用布擦，机械部分用布擦拭。

（4） 水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台，如果沾污应立即擦净。

放置玻片标本时要对准通光孔中央，且不能反放玻片，防止压坏玻片或碰坏物镜。（5）（5）不要随意取下目镜，以防止尘土落入物镜，也不要任意拆卸各种零件，以防损坏。

（6） 使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：取下标本片，

转动旋转器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈，推片器回位，盖上外罩，放回实验台柜内。

（7） 最后填写使用登记表。(注：反光镜通常应垂直放，但有时因集光器

没提至应有高度，镜台下降时会碰坏光圈，所以这里改为平放)

4.示教内容

（1） 革兰染色过程

（2） 显微镜的使用方法及保养

 

第二篇：革兰染色实验报告

实验原理：

1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。

2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。

实验步骤：

一、标本的制备：

1、涂片：

　　取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。

2、干燥：

     目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。

3、固定：

     手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。

二、染色

1、初染：

将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。

2、媒染：

加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。

3、脱色：

在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。

4、复染：

用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。

5、镜检。

实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。

实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，成为假阳性。

还有一些组将葡萄球菌染成红色，这又可能是由于脱色时间过长，冲洗的时间过短所导致的。

G⁺葡萄球菌（100*）

G⁺链球菌（100*）

G^—大肠杆菌（100*）

G^—霍乱球菌（100*0