实验一
显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

一、实验目的

1、了解显微镜的基本构造和使用方法

2、掌握油镜的原理和使用方法

3、了解细菌的三种基本形态

二、显微镜的基本构造

三、油镜使用的原理             

油镜，即油浸物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量和显微镜的分辨率从而使物象更加清晰。

四、实验器材

1、细菌三态装片

2、显微镜

3、香柏油

4、擦镜纸等

五、操作步骤

1. 放置好显微镜

2. 调节光源

3. 低倍镜观察

4. 高倍镜观察

5. 油镜观察

6. 清洁和还原显微镜

显微镜观察细菌涂片（细菌三型涂片、枯草杆菌涂片）使用油镜：
低倍镜（10× ）          高倍镜（40× ）         油镜 （100× ） 

1.  放置好显微镜

       置显微镜于平稳的实验台上。镜检者姿势要端正。

      （不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录

2. 调节好光源

       接通电源，打开光源。

3. 低倍镜的观察

     观察任何标本都必须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野范围大，容易发现观察目标，确定观察部位。

     将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，调节标本移动螺旋，使观察的目的物处于物镜的正下方。

调节粗调螺旋，使物镜（10×）与标本靠近，眼睛在测向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。

张开双眼向目镜里观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细准焦螺旋调节，至目的物清晰为止。

通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部分，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

4.高倍镜的观察

（1）用低倍镜找到标本并调节清晰后，将欲放大的观察部位用推进器调到视野中央。

（2）.旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。

5.油镜的观察

（1）如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。

下降载物台，在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中，缓慢调节粗调螺（2）旋使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。然后再用细准焦螺旋微微向上调（切忌用粗准焦螺旋）即可。

（应特别注意不要在升降载物台时用力过猛，或者调焦时误将粗调节螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片）

6. 清洁显微镜和还原显微镜

.    观察结束后，调节光源到最小再关掉电源开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最低，取下玻片。

.   把油镜转离光轴，擦镜纸擦1～2次，去油，用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，再用擦镜纸擦 1～2次，顺镜头直径方向擦，不要圆周擦和来回擦。擦干净镜体，罩上防尘罩，然后放回原处。

.   用擦油镜头的方法擦玻片。

六、显微结构图的绘制  

n  严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察细菌装片，并绘出其形态图。

n  生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表示出形态构造的特点，绘图注意事项如下：

(1)  绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用 2H 铅笔为宜。

(2)  图的大小及在纸上分布的位置要适当。

 (3)  画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符的线条。线条要清晰，比例要准确。

(4)  绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这些现象绘上。

(5)  图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要点成小撇。

(6)  整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。

七、思考题

1、使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？

2、油镜使用原理是什么？

3、绘出细菌三型图。

实验二   细菌的简单染色

虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

2．巩固显微镜的使用方法。

二、基本原理

1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

三、器材

1、活材料：培养24小时的大肠杆菌、葡萄球菌。

2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、番红、蒸馏水、无菌水、二甲苯、香柏油等。

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

四、操作步骤

（1）涂片：取干净载玻片一块，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂直径约0.5-1cm的均匀薄膜。如果从斜面或平板上取菌，用无菌环挑取少量菌体，涂在预先滴有一小滴无菌水的载玻片上，使其薄而均匀。

（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加一滴草酸铵结晶紫染色1-2min

（5）水洗：用洗瓶或滴管缓慢冲洗涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。

（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

（8）改用番红染色，重复以上过程。

实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，

a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。

b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。

c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。

五、注意事项

（1）要有对数生长期的菌种

   菌龄过小或过大均影响细菌的正常形态，菌龄太小还没有分化完整，而菌龄过大，往往会发生自溶。

（2）涂片不宜过厚，以免造成菌体重叠， 不利于观察形态。

（3）火焰固定不宜过热，否则会使细菌变形。

六、实验报告

1．结果

绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图。

2．思考题

简单染色应注意哪些，为什么？

实验三  细菌的革兰氏染色

一.目的要求

1.初步掌握细菌涂片方法

2.学习并掌握革兰氏染色法步骤

二.革兰氏染色的基本原理

革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。

根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和G-.

三.实验材料

（一）菌种：

1.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)斜面培养物

2.大肠杆菌(E.coli)培养物

（二）仪器与其他用品

显微镜、酒精灯、火机（火柴）、接种环、载玻片、擦镜纸、香柏油、二甲苯，无菌牙签等。

（三）革兰氏染色液

①草酸铵结晶紫染色液

②革氏碘液

③95%乙醇

④0.5%番红染液

四.革兰氏染色的过程– 制片

1、取干净的载玻片，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约0.5-1cm的均匀薄膜。若从斜面或平板上取菌，用无菌接种环取少量菌体，涂在预先滴有一小滴无菌水的载玻片上，使其薄而均匀。

革兰氏染色的过程– 染色

2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

3. 媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约20－30秒，使流出的酒精不再有紫色为止，后立即用流水冲洗。

5. 复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

6. 镜检：观察染色结果。

注意事项

（1） 革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。

（2）革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。

  （3）菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

五、实验报告

1、你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？

2、进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色出现什么问题？

3、乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？

 

第二篇：微生物实验室设计规划

环保技术公司微生物实验室

设计规划

环保技术公司技术部 二零一一年十二月十八日

目 录

微生物实验室建设 ................................................................................. 3

微生物学实验室的主要设备 .................................................................. 7

微生物实验室管理 ............................................................................... 15

微生物实验室建设

微生物实验室准备室、灭菌室、无菌室、恒温培养室和普通实验室五部分组成。这些房间的共同特点是地板和墙壁的质地光滑坚硬，仪器和设备的陈设简洁，便于打扫卫生。微生物实验室基本要求如下：

（一）准备室

准备室用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。

准备室还要用于洗刷器皿等。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等。

（二）灭菌室

灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。

（三）无菌室

无菌室也称接种室，是系统接种、纯化菌种等无菌操作的专用实验室。在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯种，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，很易造成污染，对接种工作干扰很大。

1. 无菌室的设置

无菌室应根据既经济又科学的原则来设置。其基本要求有以下几点：

（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。最小内间面积2×2.5＝5m2，外间面积1×2＝2m2，高以2.5m以下为宜，都应有天花板。

（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。

（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。

（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。

2. 无菌室内设备和用具

（1）无菌室内的工作台，不论是什么材质、用途的，都要求表面光滑和台面水平。

（2）在内室和外室各安装一个紫外灯（多为30W）。内室的紫外线灯应安装在经常工作的座位正上方，离地面2m，外室的紫外线灯可安装在外室中央。

（3）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。

（4）内室应有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70%的酒精棉球、工业酒精、载玻璃片、特种蜡笔、记录本、铅笔、标签纸、胶水、废物筐等。

3. 无菌室的灭菌消毒

（1）薰蒸：这是无菌室彻底灭菌的措施。无菌室使用了较长时间，污染比较严重时，应进行薰蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺薰蒸。

（2）喷雾：在每次使用无菌室前进行。喷雾可促使空气中微粒及微生物沉降，防止桌面、地面上的微尘飞场，并有杀菌作用。可用5%石炭酸喷雾。

（3）紫外线照射：在每次使用无菌室前进行。紫外线有较好的杀菌效果。通常应开启紫外线灯照射30～60min。

4. 无菌室工作规程

（1）无菌室灭菌。每次使用前开启紫外线灯照射30min以上，或在使用前30min，对内外室用5%石炭酸喷雾。

（2）用肥皂洗手后，把所需器材搬入外室；在外室换上已灭菌的工作服、工作帽和工作鞋，戴好口罩，然后用2%煤酚皂液将手浸洗2分钟。

（3）将各种需用物品搬进内室清点、就位，用5%石炭酸在工作台面上方和操作员站位空间喷雾，返回外室，5～10min后再进内室工作。

（4）接种操作前，用70%酒精棉球擦手；进行无菌操作时，动作要轻缓，尽量减少空气波动和地面扬尘。

（5）工作中应注意安全。如遇棉塞着火，用手紧握或用湿布包裹熄灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用浸润5%石炭酸的抹布包裹后，并用浸润5%石炭酸的抹布擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。

（6）工作结束，立即将台面收拾干净，将不应在无菌室存放的物品和废弃物全部拿出无菌室后，对无菌室用5%石炭酸喷雾，或开紫外线灯照射30min。

（四）恒温培养室

1. 培养室的设置

（1）培养室应有内、外两间，内室是培养室，外室是缓冲室。房间容积不宜大，以利于空气灭菌，内室面积在3.2×4.4＝14m2左右，外室面积在

3.2×1.8＝6m2左右，高以2.5m左右为宜，都应有天花板。

（2）分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。

（3）为满足微生物对温度的需要，需安装恒温恒湿机。

（4）内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。

2. 培养室内设备及用具

（1）内室通常配备培养架和摇瓶机（摇床）。常用的摇瓶机有旋转式、往复式两种。

（2）外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。

3. 培养室的灭菌、消毒

同无菌室的灭菌、消毒措施。

小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。

（五）普通实验室

进行微生物的观察、计数和生理生化测定工作的场所。室内的陈设因工作侧重点不同而有很大的差异。一般均配备实验台、显微镜、柜子及凳子。实验台要求平整、光滑，实验柜要足以容纳日常使用的用具及药品等。

微生物学实验室主要设备

（一）净化工作台

净化工作台是一种局部层流装置，能在局部形成高洁度的工作环境。它由工作台、过滤器、风机、静压箱和支撑体等组成，采用过滤空气使工作台操作区达到净化除菌的目的。室内空气经预过滤器和高效过滤除尘后以垂直或水平层流状态通过工作台的操作区，由于空气没有涡流，所以，任何一点灰尘或附着在灰尘上的杂菌都能被排除，不易向别处扩散和转移。因此，可使操作区保持无菌状态。

与无菌室和接种箱比较，使用净化工作台具有工作条件好、操作方便、无菌效果可靠、无消毒药剂对人体危害、占用面积小且可移动等优点。如果放在无菌室内使用，无菌效果更好。其缺点是价格昂贵，预过滤器和高效过滤器还需要定期清洗和更换。

（二）高压蒸汽灭菌锅

高压蒸汽灭菌锅是一个密闭的、可以耐受一定压力的双层金属锅。锅底或夹层内盛水，当水在锅内沸腾时由于蒸汽不能逸出，使锅内压力逐渐升高，水的沸点和温度可随之升高，从而达到高温灭菌的目的。一般在0.11MPa的压力下，121℃灭菌20~30min，包括芽孢在内的所有微生物均可被杀死。如果灭菌物品体积较大，蒸汽穿透困难，可以适当提高蒸汽压力或延长灭菌时间。

高压灭菌锅有卧式、立式、手提式等多种类型，在微生物学实验室，最为常用的是手提式和立式高压蒸汽灭菌锅。和常压灭菌锅相比，高压灭菌锅的优

点是灭菌所需的时间短、节约燃料、灭菌彻底等。其缺点是价格昂贵，灭菌容量较小。

（三）培养箱

培养箱是培养微生物的专用设备。制热式培养箱是由电炉丝和温度控制仪合成的固定体积的恒温培养装置，大小规格不一。微生物实验室常用的培养箱工作容积有450×450×350mm3或650×500×500mm3，适用于室温至60℃之间的各类微生物培养。目前，随着科学水平的发展，培养箱设备的完善程度和价格有很大差别。有各种结构合理、功能齐全的培养箱，如恒温培养箱、恒温恒湿培养箱、低温培养箱、微生物多用培养箱和二氧化碳培养箱等。有的用计算机控制，可选择多条时间线变换温差，从而克服了环境温度的影响，一年四季均能达到培养要求的温度。

微生物多用培养箱是集加热、制冷和振荡于一体的微生物液体发酵装置。工作室的温度在15~50℃范围内任意选定，选定后经温控仪自动控制，保持工作室内恒温。同时设有可控硅调速系统，振荡机转速可在1~220rpm范围内任意调控。

（四）干燥箱

干燥箱是用于除去潮湿物料内及器皿内外水分或其它挥发性溶液的设备。类型很多，有箱式、滚筒式、套间式、回转式等。微生物学实验室多用箱式干燥箱，大小规格不一。工作室内配有可活动的铁丝网板，便于放置被干燥的物品。制热升温式干燥箱也是有电炉丝和温度控制仪组成，可调节温度从室温至300℃任意选择。有的干燥箱采用导电温度计为敏感元件，配合晶体管和继电器组成自动控制系统，克服了金属管型热膨胀控制的缺点。

此外，还有真空干燥箱(配有真空泵和气压表)，可在常压或减压下操作。

（五）摇床

摇床又称摇瓶机，它是培养好气性微生物的小型试验设备或作为种子扩大培养之用，常用的摇床有往复式和旋转式两种。往复式摇床的往复频率一般在80~140次/min，冲程一般为5~14cm，如频率过快、冲程过大或瓶内液体装量过多，在摇动时液体会溅到包扎瓶口的纱布或棉塞上，导致杂菌污染，特别是启动时更容易发生这种情况。

旋转式摇床的偏心距一般在3~6cm之间，旋转次数为60~300rpm。

放在摇床上的培养瓶（一般为三角瓶）中的发酵液所需要的氧是由空气经瓶口包扎的纱布(一般8层)或棉塞通入的，所以氧的传递与瓶口的大小、瓶口的几何形状、棉塞或纱布的厚度和密度有关。在通常情况下，摇瓶的氧吸收系数取决于摇床的特性和三角瓶的装样量。

往复式摇床是利用曲柄原理带动摇床作往复运动，机身为铁制或木制的长方框子，有一层至三层托盘，托盘上有圆孔备放培养瓶，孔中凸出一个三角形橡皮，用以固定培养瓶并减少瓶的振动，传动机构一般采用二级皮带轮减速，调换调速皮带轮可改变往复频率。偏心轮上开有不同的偏心孔，以便调节偏心距。往复式摇床的频率和偏心距的大小对氧的吸收有明显的影响。

旋转式摇床是利用旋转的偏心轴使托盘摆动，托盘有一层或两层，可用不锈钢板、铝板或木制板制造。在三个偏心轴上装有螺栓可调节上下，使托盘保持水平。这种摇床结构复杂，造价高。其优点是氧的传递较好、功率消耗小、培养基不会溅到瓶口的纱布上。

（六）显微镜

微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察清楚它们的个体形态和细胞结构。因此，在微生物学的各项研究中，显微镜就成为不可缺少的工具。

显微镜的种类很多，根据其结构，可以分为光学显微镜和非光学显微镜两大类。光学显微镜又可分为单式显微镜和复式显微镜。最简单的单式显微镜即放大镜（放大倍数常在10倍左右），构造复杂的单式显微镜为解剖显微镜（放

大倍数在200左右）。在微生物学的研究中，主要是复式显微镜。其中以普通光学显微镜（明视野显微镜）最为常用。此外，还有暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、紫外光显微镜和倒置显微镜等。非光学显微镜为电子显微镜。

下面以普通光学显微镜为例，简单介绍一下显微镜的结构、原理等。

1. 基本构造

普通光学显微镜由机械装置和光学系统两部分组成（如图1.1）。机械装置由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦装置（粗调焦螺旋和微调焦螺旋）等组成。光学系统包括物镜、目镜、聚光器、彩虹光阑和光源等。

2. 成像原理和性能

普通光学显微镜的成像原理如图1.2所示。将被检物体置于集光器和物镜之间，平行的光线自反光镜折入聚光器，光线经过聚光器穿过透明的物体进入物镜后，即在目镜的焦点平面（光阑部位或附近）上形成一个初生倒置的实像。从初生实像射过来的光线，经目镜的接目透镜而达到眼球。这时的光线已变为或接近平行光，再透过眼球的水晶体时，便在视网膜后形成一个直立的实像。

图1.2 复式光学显微镜成像原理图

显微镜的主要性能包括放大率、工作距离、焦点距离、焦点深度、分辨率、镜像亮度和视场亮度等。

（1）放大率

在显微镜组合中，光线通过物镜先将物体放大为一个左右相反、前后倒置的实像，经目镜再次放大为一个虚像，这一虚像的大小和物体大小的比例，就叫放大率。

显微镜的放大率 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数

= （光学筒长/ 物镜焦距）×（明视距离/ 目镜焦距）

明视距离是已知数，物镜焦距和目镜焦距在说明书上有数据可查，而光学筒长是指物镜上焦平面到目镜下焦平面的距离，一般为160mm。

（2）工作距离

当显微镜调准焦距时，从盖玻片到物镜前透镜表面之间的距离叫工作距离。工作距离的大小和物镜的放大倍数与数值口径有关。物镜放大倍数和数值口径愈大，则工作距离愈小，反之愈大。表1.1表示标准物镜的主要性质。一般油镜的工作距离最短，约0.2mm。因此，要求盖玻片的厚度为

0.17~0.18mm。若盖玻片过厚，就不可能将被检体聚焦，且易引起物镜的意外损坏。

表1.1标准物镜的主要性质

（3）焦点距离（焦距）

它是指平行光线经过单一透镜后集于一点，由这一点到透镜中心的距离。一个物镜通常有几个不同性质的透镜组成。因此，它的焦距的测定比较复杂。一般，显微镜的物镜上都注明焦距的长度。物镜的放大倍数越大，焦距越短。

（4）焦点深度

在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也可看清楚，这个清晰部分的厚度就是焦点深度。焦深与总放大率和数值口径成反比，因此，高放大率和高数值口径的显微镜其焦深就浅，不能看到标本的全厚度。必须调节螺旋仔细地从

上到下进行观察。另外，被检物体周围介质（封片剂）的折射率加大可增大焦深。尤其在显微照相时，更应考虑封片剂的使用。

（5）数值口径（numerical aperture 简写为NA）

数值口径是指物镜与标本间介质折射率（n）和光线投射到物镜上的最大入射角（α）一半正弦的乘积。其计算公式为：

NA=n×sin(α/2)

其中，n=介质折射率，干燥系物镜n=1，油浸系物镜n=1.515；α=光线进入物镜的最大夹角，也称镜口角。

（6）分辨率

显微镜能够分辨物体结构中两点之间的最小距离的能力，就叫分辨率。分辨率与物镜的数值口径成正比，与光波波长成反比。因此物镜的数值口径愈大，光波波长愈短，则显微镜的分辨率愈大，被检物体的细微结构也愈明晰地区分出来。因此，一个高分辨率意味着一个小的分辨距离。显微镜的分辨率是用可分辨的最小距离（D）来表示的：

D=λ /（2 NA）

（7）镜像亮度与视野亮度

镜像亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下观察到的图像的明暗程度。使用时，对镜像亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼。镜像亮度与数值口径平方成正比，，与总放大倍数的平方成反比。

视场亮度是指显微镜下整个视场的明暗程度。视场亮度不仅与目镜、物镜有关，还直接受聚光镜、光阑和光源等因素的影响。在不更换物镜和目镜的情况下，视场亮度大，镜像亮度也大。

3. 油镜的基本原理

油镜，也称油浸物镜，一般在镜头上标有“HI”和“HO”字样，或在镜头下缘刻有1~2道黑线作为标记。使用油镜时，需将镜头浸在香柏油中进行观

察，这是为了消除光由一种介质进入另一种介质时发生散射，结果不仅提高了放大倍数，还增加了照明度和分辨率。

（1）照明亮度

油镜与其它物镜不同之处在于玻片和物镜之间的介质不是空气，而是一种和玻璃折射率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）。如果玻片与物镜之间的介质是空气（n=1.00），光线通过玻片后发生散射，进入视场的光线显然减少，结果降低了视场亮度。当光线通过玻片又通过香柏油进入物镜就不发生散射，结果，提高了照明度，观察的标本显得更清晰（图1.3）

（2）分辨率强

使用油镜还能增加显微镜的分辨率。由于显微镜分辨率与物镜的数值口径（NA）成反比，与波长成正比。因此物镜的数值口径愈大，光波愈短，则显微镜的分辨率就愈大。人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，加入数值口径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值口径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离为0.22μm。因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体，但大部分细菌直径在0.5μm以上，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态。

4. 注意事项

使用显微镜应注意以下事项：

（1）取拿显微镜时，必须用一手握住镜臂，另一手托住显微镜的镜座，使显微镜保持直立的状态，切忌用单手提拿。

（2）将显微镜放置桌上时，务必要轻轻放下。

（3）显微镜的镜头必须保持清洁，必要时用擦镜纸擦拭镜头，不可使用布或一般的纸，以免损伤镜头。

（4）将显微镜轻轻地放置桌上，镜座后缘位于离桌子边缘约5cm处。

（七）接种箱

接种箱分为固体菌种接种箱和液体菌种接种箱两种。固体菌种接种箱是一个用木料和玻璃制成或由有机玻璃焊接而成的密闭小箱。又分为双人和单人操作箱。箱体可大可小，一般箱体长约143cm，宽86cm，总高154cm，支架76cm。箱的上部左右两侧各装有两扇能启闭的玻璃推拉门，方便菌种进出。窗的下部分别设有两个直径约13cm的圆洞，两洞的中心距离为52cm（同肩宽），洞口装有带松紧带的袖套，以防双手在箱内操作时，外界空气进入箱内造成污染。操作时两人相对而坐，双手通过袖套伸入箱内。箱两侧最好也装上玻璃，箱顶部为木板或玻璃。箱内顶部装有紫外线杀菌灯和照明用日光灯各一支。箱体安装木板或玻璃均可，但要注意密封。

液体菌种接种箱是专为移接液体菌种而设计的。比固体菌种箱窄长，单侧两人操作。内设轨道和紫外线灯，箱两端开有高25cm，宽10cm的长方形出口，方便菌种进出，洞口设有小推门。进出口下处设蒸汽源，接种时用蒸汽封住进出口，以防杂菌进入箱内。箱背面设有液体菌种移接管能进入的小孔。

接种箱灭菌时，用紫外线照射30min。如果没有紫外线灯，可用甲醛和高锰酸钾（甲醛10～14mL/m3+高锰酸钾5～7g/m3空间）熏蒸30min以上。使用时，先将所需物品和工具放入接种箱内，然后进行药剂熏蒸和紫外线灭菌，再按无菌操作进行接种。

接种箱的结构简单，造价低廉，易消毒灭菌，操作方便，而且人在箱外操作，气温较高时也能作业。缺点是进出培养基费工费时，每次接种前都需要进行灭菌。

（八）冰箱

微生物实验室的冰箱主要有两种：普通冰箱和低温冷冻冰箱。普通冰箱一般都具有两个柜子，即鲜藏柜和冷藏柜，温度分别为4℃和－20℃；低温冷冻冰箱温度一般控制在－40～－80℃。它们都可以用于微生物菌种保藏。鲜藏柜

常用于保存斜面菌种，保藏时间在3个月左右。超过3个月，斜面就会变干，因此需要转接菌种。如果要长时间保存菌种，则需要经过处理后，贮藏于普通冰箱的冷藏柜或低温冷冻冰箱中，它们的保藏时间较长，一般都在1年以上。

微生物实验室管理

一、实验室管理制度

1．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理、使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。

2．进入实验室必须穿工作服，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。

3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。

4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出。

5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水电，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。

6．负责人严格执行本制度，出现问题立即报告。

二、仪器配备、管理使用制度

1．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位 pH计、高速离心机。

2.实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经计量部门检定合格方能使用。

3．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，由经理同意填报修理申请、送仪器维修部门。

4．各种仪器（冰箱、温箱除外），使用完毕后要立即切断电源，旋钮复原归位，待仔细检查后，方可离去。

5．一切仪器设备未经设备管理人员同意，不得外借，使用后按登记本的内容进行登记。

6．仪器设备应保持清洁，一般应有仪器套罩。

7．使用仪器时，应严格按操作规程进行，对违反操作规程的因管理不善致使仪器械损坏，要追究当事者责任。

三、药品管理、使用制度

1．依据本室检测任务，制定各种药品试剂采购计划，写清品名、单位、数量、纯度、包装规格，出厂日期等，领回后建立账目，专人管理，每半年做出消耗表，并清点剩余药品。

2．药品试剂陈列整齐，放置有序、避光、防潮、通风干燥，瓶签完整，剧毒药品加锁存放、易燃、挥发、腐蚀品种单独贮存。

3．领用药品试剂，需填写请领单、由使用人和室负责人签字，任何人无权私自

出借或馈送药品试剂，本单位科、室间或外单位互借时需经科室负责人签字。

4．称取药品试剂应按操作规范进行，用后盖好，必要时可封口或黑纸包裹，不使用过期或变质药品。

四、玻璃器皿管理、使用制度

1．根据测试项目的要求，申报玻璃仪器的采购计划、详细注明规格、产地、数量、要求，硬质中性玻璃仪器应经计量验证合格。

2．大型器皿建立账目，每年清查一次，一般低值易耗器皿损坏后随时填写损耗登记清单。

3．玻璃器皿使用前应除去污垢，并用清洁液或2%稀盐酸溶液浸泡24 h后，用清水冲洗干净备用。

4．器皿使用后随时清洗，染菌后应严格高压灭菌，不得乱弃乱扔。

五、安全制度

1．进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。

2．在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行，试验过程中如产生毒气时应在避毒柜内操作。

3．严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方可离开现场。

4．工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用新洁尔灭、过氧乙酸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。

5．实验完毕，即时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理。6．每日下班，尤其节假日前后认真检查水、电和正在使用的仪器设备，关好门窗，方可离去。

六、环境条件要求

1．实验室内要经常保持清洁卫生，每天上下班应进行清扫整理，桌柜等表面应

每天用消毒液擦拭，保持无尘，杜绝污染。2．实验室应井然有序，不得存放实验室外及个人物品、仪器等，实验室用品要摆放合理，并有固定位置。

3．随时保持实验室卫生，不得乱扔纸屑等杂物，测试用过的废弃物要倒在固定的箱筒内，并及时处理。

4．实验室应具有优良的采光条件和照明设备。

5．实验室工作台面应保持水平和无渗漏，墙壁和地面应当光滑和容易清洗。

6．实验室布局要合理，一般实验室应有准备间和无菌室，无菌室应有良好的通风条件，如安装空调设备及过滤设备，无菌室内空气测试应基本达到无菌。

7．严禁利用实验室作会议室及其他文娱活动和学习场所。