2012-2013学年第一学期物理学实验A、物理学实验B、物理学实验C考试安排

考试时间：1月4日晚6:30-7:00

 

第二篇：基因分子生物学实验报告第一次实验报告

基 因 分 子 生 物 学

实  验  报  告

实验名称：     RNA的制备、鉴定及RT-PCR        

实验类型：  验证型□  综合型√  设计型□

实验室名称： 分子细胞遗传实验室

指导教师：­­­­­­____________王欣______________________

班级：     周二           组别：       3        

姓名：              姜仁涛                      

学号：             S2011008044                  

成绩：                                         

实验起始日期：         20##-2-28                

一．仪器设备型号

SIGMA高速冷冻离心机2K15

SANYO制冰机SIM-T-124

高压消毒锅YX-280

Biometra  PCR仪T-1

恒温水浴箱

通达涡旋振荡仪TDX-1

Tanno凝胶成像仪Gis-2010

一恒恒温干燥箱DHG-9070A

DYY-6C型电泳仪

Eppendorf生物分光光度计AG22331

二. 实验材料

HEK293细胞

Trizol试剂

氯仿

异丙醇

无Rnase水

75%乙醇（无水乙醇75ml，DEPC水或高压灭菌双蒸水25ml）

10*上样缓冲液（聚蔗糖2.5g或40%聚蔗糖：5ml，溴酚蓝25mg，二甲苯青25mg，0.5M EDTA 20ul，DEPC水10ml）

10mg/ml EB（EB 0.1g，DEPC水10ml）

琼脂糖

1*TAE

GAPDH上下游引物

TRANS^TM第一链cDNA合成试剂盒（EasyScriptRT/RI Enzyme Mix，2*ES Reaction Mix，Random Primer，Anchored Oligo（dT）₁₈ Primer，Rnase-free water）

三．实验方法

RNA提取

   1）观察培养细胞，10cm平板内约80%密度，生长良好；吸尽培养液后，立即将Trizol直接加入培养板中裂解细胞，不断摇动。每10cm²面积加入1mlTrizol。用一次性针管，吹吸几次，转移到一EP管中，室温静置5分钟。

   2）加0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置3分钟。12 000rpm 4℃离心15分钟。

   3）将上层水相转移到另一EP管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温静置20-30分钟；10 000rpm 4℃离心10分钟，弃上清。

   4）加入1ml75%乙醇（DEPC处理的水配制），剧烈涡旋洗涤沉淀（将沉淀击碎），6000rpm 4℃离心5分钟，弃上清，室温晾干沉淀（大约5分钟左右）。

   5）RNA的溶解：用100ul无Rnase水溶解沉淀。55-60℃孵育10分钟，分装样品，（30,30，40ul），其中一管30ul做RNA电泳。另两管待用。

   6）取1ulRNA溶液，稀释至100ul。测RNA浓度、260nm/280nm、260nm/230nm。

RNA琼脂糖电泳

1）配胶：琼脂糖1g，1*TAE 100ml 微波加热融化，冷却至60℃，灌胶。

2）电泳，向水平电泳槽中加入1*TAE至恰好浸没凝胶1mm左右，每孔加入10~20ul样品，100V电泳15分钟，紫外灯下观察RNA分离情况，比较28S rRNA和18S rRNA的含量。

      RT-PCR

1)反转录合成cDNA：

取一支0.2ml EP管加入

  Components                                Volume（ul）

  Total RNA                                  2(50ng~5ug)

  Random Primer（N9）（0.1ug/ul）              1

  2*ES Reaction  Mix                          10

  EasyScriptRT/RI Enzyme Mix                   1

  Rnase-free Water to                            20

 

轻轻混匀

25℃孵育10分钟，42℃孵育50分钟

70℃加热15分钟失活EasyScriptRT。

          2）RT-PCR

             取1/10~1/5(2~4ul)的反转录产物作为PCR模板；

             条件（以25ul反应体系为例）：

Components                               Volume （ul）   

 cDNA                                   2              

Forword Primer（10pmol/L）                1              

 Reverse Primer（10pmol/L）                1                

10*Buffer                                 2.5           

2.5mMdNTPs                             1               

Taq(2U/ul)                                0.5            

ddH₂O to final volume                       25            

                      

        PCR循环：

             94℃变性     3分钟

             94℃变性     40秒

             55℃退火      40秒

             72℃延伸      1分钟

               共40个循环

             72℃延伸       10分钟

        DNA琼脂糖凝胶电泳

        以Total RNA及ddH₂O为对照，对新合成的DNA 进行电泳，100V 15~20分钟，Marker 5ul每孔，其它孔4ul样品加1ul Loading Buffer。

        电泳之后，将凝胶浸入0.5ug/ml的EB水溶液中10分钟进行染色，在凝胶成像系统中观察，是否合成了DNA以及Total RNA 中是否有基因组DNA的污染。

四. 实验结果

                    图1.  Total RNA 琼脂糖凝胶电泳图

1）RNA琼脂糖凝胶电泳结果见图1.

   完整的RNA 电泳，其28S与18S的显色强度比约为2:1，在图1中，条带形状不规则，条带之间未明显分开，电泳结果不好，不能用于分析；但可见28S明显比18S处强。可能是在提取RNA过程中，未保证低温环境，以及操作环境中引入Rnase，导致RNA结构不完整。

2）Total RNA 分光光度计测定结果为：

         浓度                 4242. 9 ug/mL

         260nm/280nm         1.77

         260nm/230nm          1.72

   260nm及280nm为核酸分子的吸收峰，230nm为酚类化合物（在Trizol中引入）的吸收峰。 260nm/280nm可反映RNA 的纯度，纯RNA 一般在2.0~2.2之间，260nm/230nm可反映酚类化合物等杂质的污染程度，一般大于2.0。本次试验提取的RNA不纯，且应含有酚类杂质，实验中可适当增加氯仿及异丙醇的提取次数。

3）

                    图2.DNA(RNA)凝胶电泳图

DNA 琼脂糖凝胶电泳结果见图2，从图中可见，ddH₂O孔中没有DNA条带，阴性对照明显，DNA及Total RNA 孔中相同位置出现一明显条带，即所提取的RNA 经RT-PCR所得DNA的条带，Total RNA也存在这一条带，说明所提起的RNA中含有基因组DNA。这与260nm/280nm比值偏低存在一定关联。

五．实验结论

       本次实验提取了RNA，紫外分光光度计测定结果显示RNA不纯（260nm/280nm=1.77＜2.0，260nm/230nm =1.72＜2.0)，浓度为4242. 9 ug/mL；RNA琼脂糖凝胶电泳条带未良好分离，可能在操作过程中引入了RNase，导致了RNA不完整；DNA 凝胶电泳分析，显示提取的RNA 中有基因组DNA，与260nm/280nm=1.77＜2.0相符合。

六．实验中出现的问题

       RNA的提取及处理过程中应尽量在低温环境中进行，但实验中在转移及加取试剂及转移过程时常将RNA置于室温，这课能对RNA 的完整性产生影响，同时也会影响其纯度。

 七．体会及思考

       1）RNA的提取和鉴定应尽量保持洁净环境，同时在处理过程中有很多微小的操作错误都会引入Rnase及其他污染，对RNA的纯度、完整性等产生影响，因此实验操作要严格规范。

       2）凝胶电泳要跑出好的条带，与适当的实验条件以及所需电泳的物质的性质密切相关，比如本次实验中RNA的纯度及完整性都会影响最终的条带，影响定性和定量。

       3）实验中要养成良好的操作习惯，保护好个人安全。本次实验中用到EB，为毒性物质，因此要小心操作，戴手套，但接触仪器时应摘除，方便自己和他人。同时，诸如移液枪的正确使用等也应注意。