荧光光谱的基本原理和测试方法

一、       实验目的

1．了解荧光光谱仪的基本构造和各组成部分的作用

2．了解荧光光谱仪的工作原理

3．掌握激发光谱、发射光谱的测定方法。

二、       实验原理

原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为荧光。

(1)激发光谱

是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。

激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定。激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。

(2)发射光谱

是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长，纵坐标为发光相对强度。

(3)荧光强度与荧光物质浓度的关系

用强度为I₀的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度I_f用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度I_f与浓度有下面的关系：I_f=KC。

三、       测试仪器

 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器 照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。
光源发出的紫外-可见光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后 发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。

四、样品制备
1. 薄膜样品
薄膜试样可以直接在样品台上进行测试

2. 液体试样
液体试样应放入专用的液体样品槽中，固定到样品座中。

五、       测试过程

1. 发射光谱的测试 
第一步：参数设置。
(1) 设置光谱类型。选择“Emission”发射光谱
(2) 设置激发波长。输入激发波长
(3) 设置发光波长范围。输入扫描的起始波长和终止波长（对于未知样，也可选择可见光全波段400~760nm）
(4) 设置记录范围。输入纵坐标的最小和最大显示值
(5) 设置扫描速度。

(6) 设置狭缝宽度。可分别选择 激发和发射狭缝 宽度，对于发光较弱的样品，测试时可以适当增大狭缝宽度。
(7) 参数设置完成后，点击“OK”。
第二步：光谱测试。
点击屏幕右下角“Start”按钮，开始发射光谱测试。测试完成后，保存数据。
注意：这种保存只是临时保存，关机后将消失。永久保存需使用 File / Save as，选择存储路径和文件夹，点击“Save As”保存。保存后的文件，扩展名是“.SPC”，只能用测试软件程序打开。若想将测试结果转换为数据，以利于使用其他软件作图和编辑，需进行数据转换

2. 激发光谱的测试

基本操作同发射光谱，只是在设置光谱类型项选择“Excitation”激发光谱。

六、       样品测试

1．            数据记录

测试荧光聚氨酯、荧光碳纳米颗粒、荧光染料罗丹明B或罗丹明6G溶液的荧光和激发光谱，保存好所测试样的发射和激发谱数据。

2．            数据处理和分析

利用Origin软件将所得数据作图，标记最大激发波长和发射波长。

七、       思考与讨论

1.      是否可以用荧光光谱仪来进行聚合物的定性分析？试解释其原因？

2.      荧光物质为什么能产生荧光？

 

第二篇：分子荧光光谱法实验报告

实验二、分子荧光光谱法实验

 

一、    实验目的

1.掌握荧光光度计的基本原理及使用。

2.了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用。

3.掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。

4.了解影响荧光产生的几个主要因素。

5.学会运用分子荧光光谱法对物质进行定性和定量分析。

二、    实验原理

原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。

具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S₁的最低振动能级回到基态S₀各振动能级所产生的光辐射。

(1)激发光谱

是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。

激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λ_em不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。

(2)发射光谱

是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。

发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。

发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的λex不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以I为纵坐标，λem为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱;从曲线上找出最大的λem。

(3)荧光强度与荧光物质浓度的关系

用强度为I₀的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度I_f用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度I_f与浓度有下面的关系：I_f=KC。

三、    实验试剂和仪器

试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙醇。

仪器：Fluoromax-4荧光分光光度计；1cm比色皿；spectrofluorometer分析软件。

荧光分析仪器结构：它主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成。光源发出的紫外-可见或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被检测样品上，样品收到该激发光照射后，发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。荧光分析仪器结构示意图如图1：

图1.荧光分析仪器结构示意图

四、    实验步骤

1.样品制备。配置不同浓度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液，分别为10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度。

2.打开荧光分光光度计和电脑，预热半个小时。

3.打开spectrofluorometer分析软件，进行相关参数的设置。首先检测罗丹明B的激发光谱，此时固定发射波长为560nm，检测并保存激发光谱。然后根据所检测的激发光谱中的最大峰值541nm来设置检测罗丹明B的荧光光谱的激发波长，检测并保存所得的荧光光谱。

4.检测1-萘酚的荧光光谱。方法同步骤3。

5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide标准溶液进行与2中相同的步骤，找到最大激发波长与最大发射波长，之后选定单点检测模式，并设置成刚选择的最大激发波长与最大发射波长，分别对10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml进行检测，记录数据，绘制工作曲线。

6.对未知浓度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide进行检测，记录数据，并根据工作曲线求出浓度。

五、    数据记录和处理

1．            数据记录

(1)罗丹明B的测定

图2.罗丹明B的激发光谱

图3.罗丹明B的荧光光谱

(2) 1-萘酚的测定

图4. 1-萘酚的激发光谱

(3) 3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide的测定

图5. 1-萘酚的荧光光谱

图6. 3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide激发光谱

图7. 3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide荧光光谱

(4) 3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide单点扫描结果

2.数据处理和分析

(1)由罗丹明B和1-萘酚的扫描光谱图可知，前者激发波长为541nm，后者的激发波长为296nm，二者不同且相差很大。这说明这两种物质的分子结构和结构中的电子排布不同，可以用荧光光谱的方法对物质进行定性分析。

(2)由3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide的扫描光谱图知，其发射波长为610nm，激发波长为579nm。

(3)将3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide单点扫描结果进行excel作图，得以下结果，如图7.

 

图7. 3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide的荧光强度与浓度的关系曲线

由该曲线可得，3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide的荧光强度与浓度的函数关系为I_f=42428C，将未知浓度的荧光度代入可得未知浓度为22μg/ml。

六、    思考与讨论

1.      影响荧光分析的几个主要因素有哪些？ 

答：影响荧光分析的因素主要有以下几个：

(1)样品温度的影响：降低体系温度可以提高荧光量子产额。

(2)样品的光化反应：光化反应使荧光强度降低。

(3)杂散光干扰：散射光来自激发光溶剂分子的散射（瑞利散射）或被小颗粒或气泡的散射。通过在发射单色仪前和激发单色仪后插入相应的短波截止滤光片来消除。

(4)溶剂的影响：增加溶剂的极性，有利于荧光的产生。

(5)溶剂的拉曼散射光：当溶剂具有拉曼活性时，在激发光长波边会出现类似荧光的拉曼散射峰。

(6)样品浓度效应：浓度高时荧光强度下降，需要校正。

样品污染的影响：轻微的污染都会影响测量的准确度。

(7)溶解氧的影响：溶解氧对一定样品有明显的荧光消光效应（猝灭）。 

(8)pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱。

2.激发光谱与发射光谱有什么关系？

答：发射光谱与激发光谱没有直接的关系，但是发射光谱一般要比激发光谱波长长。

3.如何进行多组分混合物的荧光分析？

答：(1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定。可分别在各自的l_荧波长处测定，求出它们的含量。

(2) 如果两组分的荧光峰相互干扰，但激发光谱有显著区别，在某一激发光下一个组分产生荧光峰，另一组分不产生荧光；可选用不同的激发光进行测定。

(3)如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰，利用荧光强度的加和性(F=F₁+F₂+F₃+…)，在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解。