无菌试验操作规程

1．目的

建立无菌检查的标准操作规程，确保检验结果的准确性、可靠性。

2．范围

本规程适用于本公司质检部对本厂生产的一次性血路导管的无菌检验。

3．引用标准

   《中华人民共和国药典》2010版第二部附录XI H无菌检查法

《中国药品检验标准操作规范》20##年版 无菌检查法

 GB/T14233.3-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第二部分：生物学

4．仪器设备和试剂

4.1 仪器设备

   无菌室、无菌服、口罩、手套、超净工作台、电子天平、pH计、、光学显微镜、生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电热干燥箱、微生物限度仪器、接种环、酒精灯、试管、试管塞、试管架、培养皿、三角瓶、玻璃棒、酒精棉。

4.2 试剂

   75%医用级乙醇、质量浓度为0.9%无菌氯化钠溶液、传1代金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌、黑曲霉。

培养基：平板：营养琼脂培养基

        需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐流体培养基

        真菌培养基：改良马丁（琼脂）培养基

5．试验前准备和方法

5.1 试验前准备

5.1.1 器具灭菌

与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭

菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃ 30 min，或置电热干燥箱内160℃ 2h。

  5.1.2 无菌室要求

无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数，方法如下：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在30~35℃培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好30~35℃培养48h后取出检查。3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个。

5.1.2 培养基无菌性检查（每配置一批培养基检查一次）

  每批配置的培养基均应进行无菌性检查。检查时，每批随机抽取不少于5支，培养14天，应无菌生长。

5.1.3 培养基灵敏度检查（每购进一批培养基检查一次）

5.1.3 供试品抑菌性验证试验

  对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验前，应按照《中国药典》二部附录中“无菌检查法”的规定进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或可以忽略不计。

 5.2 试验方法

  5.2.1 供试品数量

同一批号3个~11个单位供试品。

  5.2.2 浸提介质

质量浓度为9g/L的无菌绿环溶液或其他符合《中国药典》要求的稀释液和冲洗液。

5.2.3 供试液制备

  优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗涤供试品的浸提表面。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。

管类器具：按管内表面积每10cm²流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10mL/min.

5.2.4 接种、培养和观察

  （1）洗脱液与培养基无菌检验：无菌试验前3天，于需-厌氧培养基中各接种1ml 洗脱液，分别至30~35℃与20~25℃培养72h，应无菌生长。

（2）阳性对照管菌液制备：试验前一天取金黄色葡萄球菌（CMCC 26003）新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取生孢梭菌（CMCC 6494）的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1环接种于相同培养基内，30~35℃培养16~18h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml备用。取白色念珠菌（CMCC 98001）真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1环，接种于相同培养基内，20~25℃培养24h，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释10cfu/ml~10cfu/ml备用。

（3）培养：将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于30～35℃培养5天。霉菌培养管与阴性对照管于20～25℃培养7天。

4、

根据供试品具体特性选择《中国药典》二部附录中“无菌检查法”的规定的适宜接种方式，以无菌操作法进行。

供试品的培养和观察按《中国药典》二部附录中“无菌检查法”的规定。

6. 结果判定

   按《中国药典》二部附录中“无菌检查法”的规定。结果判定为阳性对照在24h内应有菌生长，阴性对照无菌生长，需-厌氧培养管及霉菌培养管无菌生长，可判为灭菌合格。 如需-厌氧培养管及霉菌培养管中任何1管显混浊并证明有菌生长，应重新取样，分别复测2次，如各管无菌生长仍可判为灭菌合格。

7. 试验报告

   试验报告中宜给出下列信息：

   a 供试品名称；

   b 生产批号和（或）灭菌批号；

   c 供试液制备方法；

   d 接种方式；

   e 每日观察结果；

   f 结果判定。

附表1:  产品无菌检验报告

8. 注意事项：

（1）在洁净度100级区域中进行，严格无菌操作。

（2）采样后送检时间不得超过6h，样品保存于4℃，则不超过24h。

（3）如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂。

（4）采样面积，100cm2。

（5）设好阳性、阴性对照。

附表1:  产品无菌检验报告

 

第二篇：无菌实验规程

无菌实验操作规程

1. 目的： 规范无菌检查操作

2. 范围：无菌检查操作

3. 责任： 无菌检验员

4.无菌检查依据GB/T14233.2—2005 成品无菌试验方法，中国药典20##年版附录无菌试验方法

准备:

1 无菌检查在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的隔离系统中进行。本公司无菌检查操作环境地点为生物检验室。

2. 设备

 超净工作台   恒温培养箱    压力蒸汽灭菌锅  电热干燥箱  

3. 培养基

  硫乙醇酸盐流体培养基  改良马丁（真菌）培养基

4. 培养基制备

4.1制备好的培养基4℃保存， 15天内用完。

4.2硫乙醇酸盐流体培养基装量应符合培养结束后氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。接种前培养基氧化层（粉红色）高度不超过培养基深度的1/5,否则，需经100℃水浴加热至粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

培养基氧化层（粉红色）高度超过培养基深度的1/5

 

100℃水浴加热后

5.无菌室检查

       无菌室消毒后与试验过程中，应检查沉降菌数。平皿暴露空气中30分钟，营养琼脂平皿沉降菌数平均不超过3个，单只平皿细菌数不超过4个。

试验过程中，应在试验开始时，开盖暴露所处试验环境中，至试验结束，同法培养，应符合上述要求。

6.所有器具、试剂、培养基应置压力蒸汽灭菌器内121℃30分钟

7.  供试品检查

9.1  同一批号至少5个单位供试品

9.2    制备及接种应按无菌超作法进行。优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投入培养基内培养。

接种后的培养基

9.3. 供试品包装应完好无损，尤其是只有一层包装的样品。进入无菌检验室的样品若有两层（或两层以上）包装的，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。

操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。供试品的无菌检查

10. 硫乙醇酸盐流体培养基每管装量≥15mL，

改良马丁培养基每管装量≥10mL。

接种后，硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃（细菌）至少培养14天，

霉菌（真菌）培养基23～28℃至少培养14天。

11.结果判定

阳性对照管混浊（24小时后）有细菌生长，阴性对照管与样品管均为澄清，样品合格。

样品管任何一管混浊并确定有菌，判定样品不合格。

除阳性管外，其余各管均不得有菌生长，否则判定样品不合格。

12.记录

  无菌检验记录

生测检验培养基台帐

培养基验证检查记录表

微生物菌种制备、传代、使用记录

无菌检验室清洗、消毒记录