大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

一、          实验目的

（1）熟悉蒽醌类成分的提取分离方法

（2）掌握pH梯度提取法的原理和操作技术

（3）学习蒽醌类化合物鉴定方法

二、          实验器材

材料及试剂：大黄粗粉、浓硫酸、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、浓盐酸、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、普通滤纸、薄层层析硅胶板（2.5 cm×10 cm）、广泛PH试纸、剪刀、铅笔、尺子、点样毛细管、样品管等。

仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管（30cm）、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸（广口瓶）、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。

三、          实验原理

大黄为蓼科植物,味苦,性寒,具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经等功效。其主要成分为为蒽醌化合物，含量约为3%~5%，大部分与葡萄糖结合苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。其中，大黄酸具有羧基，酸性最强；大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；大黄素甲醚和和大黄酚的酸性最弱。根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离。

大黄酸            R1=H                R2=COOH

大黄素            R1=CH3              R2=OH

芦荟大黄素        R1=CH2OH            R2=H

大黄素甲醚        R1=CH3              R2=OCH3

大黄酚            R1=CH3              R2=H

四、          实验内容

大黄素的提取、分离流程图

具体操作步骤

1. 游离蒽醌的提取

（1）酸水解：称取大黄粗粉10g，加20%H2SO4水溶液150mL，在水浴上加热1小时，放冷，抽滤，滤饼用NaOH溶液洗至近中性（pH约为6），于70℃干燥后，研碎，置250mL圆底烧瓶中，加入乙醚150mL回流提取1小时（调45℃，回流即可），得到乙醚提取液。

（2）蒽醌类成分的提取：乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶—CMC粘合板，展开剂为石油醚（60～90℃）：乙酸乙酯（7：3）近水平或直立展开，在可见光下，可看到四个斑点。其中最上面黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物,在此条件下,不能分开,其余3个斑点依Rf值（由大到小）的顺序是大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点），记录图谱并计算Rf值。

2. PH梯度萃取分离

（1）将乙醚提取液加入250mL分液漏斗中（使用前先检漏），以35 mL 5 % NaHCO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层层析检查（展开剂同上），指示已提尽大黄酸后，合并三次NaHCO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH 2-3左右，析出大黄酸沉淀。（注意：加酸时应缓慢加入，以防酸液溢出，如出现分层现象，需将上层乙醚蒸去才能析出固体）。抽滤后，刮下颗粒并称重。

（2）经5% NaHCO3水溶液萃取后的乙醚层，继以35 mL 5 % Na2CO3水溶液萃取三次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽大黄素后，合并三次Na2CO3萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出大黄素沉淀。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。

（3）经5% Na2CO3水溶液萃取过后乙醚层以35 mL 0.25% NaOH水溶液萃取四次，乙醚层经薄层检查（展开剂同上），指示已提尽后，合并三次 NaOH萃取液，用浓盐酸酸化至PH2-3左右，析出芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚沉淀混合物。（酸化时注意操作同前）。抽滤后，刮下颗粒并称重。

3. 样品鉴定

(1) 碱液试验  分别取各蒽醌结晶数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml，观察颜色变化。凡有互为邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。

五、          注意事项：

（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。

（2）pH梯度萃取分离时，以保证提取充分，可以用薄层色谱作监测。

（3）注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。

六、          数据记录、结果讨论与分析：

分别取各上述沉淀（蒽醌结晶）数毫克置于样品管中，加2%氢氧化钠溶液1ml后，观察到各样品管中溶液均呈红色、但第1根管中颜色略淡。

七、          思考题

1、  简述大黄中5种游离羟基蒽醌化合物的酸性与结构的关系。

答：

A大黄酸            R1=H                R2=COOH

B大黄素            R1=CH3              R2=OH

C芦荟大黄素        R1=CH2OH            R2=H

D大黄素甲醚        R1=CH3              R2=OCH3

E大黄酚            R1=CH3              R2=H

酸性：A＞B＞C＞E≈D

2.pH梯度萃取法的原理是什么？如何利用该方法分离大黄中的5种游离羟基蒽醌化合物？

答：pH梯度萃取法的原理是由于溶剂系统pH变化而改变了它们的存在状态（游离型或解离型），从而改变了他们在溶剂系统中的分配系数。

由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离他们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差异，用柱色谱分离之。

3.结合本实验，思考设计实验方案所需因素？

答：游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。

八、          参考文献

（1） 吴立军主编，《天然药物化学实验指导》北京；人民卫生出版社，2011

（2）康廷国主编，《中成药薄层色谱鉴别》.北京：人民出版社，1995

（3）徐选明，刘新 大黄中大黄素提取工艺的优化 中国中医药信息杂志 2004，11，5

（4）李乃明，丁宙 大黄素的分离和结构鉴定 广州医学院学报 1985，13，3

（5）朱庆玲，李瑞和 大黄中大黄素的提取工艺研究 时珍国医国药 2006，17，3

 

第二篇：大黄中游离蒽醌的提取与分离和鉴定

实验一 大黄中游离蒽醌的提取与分离和鉴定 实验编号:1

日期:

学时数: 6学时

地点:

任课教师:

实验目的:掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法

实验原理:大黄中有多种游离蒽醌及其苷类,总含量约2-5%。主要有大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚以及它们的葡萄糖苷等。从大黄中提取分离游离蒽醌时,先用20%硫酸加热使苷类水解，保留滤饼，滤饼用乙醚加热回流提取总蒽醌苷元（游离蒽醌），提取液作TLC鉴识。 实验对象:大黄

主要仪器、试剂:电热套、烧杯、20%硫酸、薄层硅胶G 、0.5%CMC-Na。 实验操作步骤: 酸水解：取大黄10g ,粉碎，加20%硫酸水溶液100ml，水浴上加热3-4小时,抽滤,滤饼水洗后自然干燥。

铺薄层硅胶G板: 薄层硅胶G :0.5%CMC-Na(1:3)

实验注意事项: ①加热温度不要太高。 ②溶液保持微沸，防止药渣炭化。 ③不断搅拌。

后记:

实验一 大黄中游离蒽醌的提取与分离和鉴定

实验编号:2

日期:

学时数: 6学时

地点:

任课教师:

实验目的:1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。

2.掌握蒽醌类的色谱鉴别方法。

实验原理:大黄中有多种游离蒽醌及其苷类,总含量约2-5%。主要有大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚以及它们的葡萄糖苷等。从大黄中提取分离游离蒽醌时,先用20%硫酸加热使苷类水解，保留滤饼，滤饼用乙醚加热回流提取总蒽醌苷元（游离蒽醌），提取液作TLC鉴识。 实验对象:大黄滤饼

主要仪器、试剂:电热套、圆底烧瓶、冷凝管、乙醚、硅胶薄层板、石油醚、乙酸乙酯

实验操作步骤: 总羟基蒽醌苷元的提取：取干燥滤饼，放入100ml圆底烧瓶中，加入乙醚50ml,回流提取3－4小时，得乙醚提取液。

乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶G-CMC-Na,展开剂为石油醚（60-90℃）－乙酸乙酯（７：３），直立展开。

实验注意事项: ①加热回流时电热套电压小于50v。

②取石油醚（60-90℃）7ml,乙酸乙酯3ml,混合均匀。。 ③控制点样量，

注意点样斑点位置。④仔细观察斑点、溶剂前沿移动距离。

后记:结论：在可见光下可看到4个斑点，Rf最大的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物，其余3个斑点依Rf由大到小分别为大黄素（橙色斑点），芦荟大黄素（黄色斑点），大黄酸（黄色斑点

实验二 芦丁的提取及鉴定

实验编号:1

日期:

学时数: 8学时

地点: 新校区F楼6楼天然药物化学实验室

任课教师:

实验目的:学习和掌握用碱提取—酸沉淀提取黄酮苷的原理和方法。 实验原理:槐米中有黄酮苷—芸香苷（芦丁）, 芸香苷（芦丁）是由槲皮素与芸香糖连接而成的二糖苷，能溶于热水。本试验采用碱提取—酸沉淀提取芸香苷。

实验对象: 槐米

主要仪器、试剂:电热套、烧杯、石灰水、PH试纸、抽滤瓶 。 实验操作步骤: 1.提取：槐花米—粉碎—碱水提取—加酸沉淀-—放置—粗品芦丁—精制—芦丁(纯品)。

2.粉碎:称槐米40克，粉碎。

3.碱提:在1000ml烧杯中加入500ml蒸馏水，加热煮沸后，将槐米粗粉投入，继续直火 煮沸2-3分钟，在搅拌下，加入石灰乳，调PH8-9，加热保持微沸30分钟，趁热过滤收集，滤渣加160ml蒸馏水, 加入石灰乳，调PH8-9，同上操作再提一次，滤液合并，滤渣弃去。

4.酸沉:将滤液在60-70℃，小心加浓HCL，调PH3-4，放6小时以上，析出沉淀。

实验注意事项: ①碱提时加入石灰乳调PH8-9，不要太高。

②溶液保持微沸。

③酸化时将滤液在60-70℃，小心加浓HCL，调PH3-4，不要太低。 后记:

实验二 芦丁的提取及鉴定(精制)

实验编号:2

日期:

学时数: 8学时

地点:新校区F楼6楼天然药物化学实验室

任课教师:

实验目的:粗品芦丁的精制

实验原理: 粗品芦丁能溶于热水，去除不溶性杂质，最后用甲醇重结晶。

实验对象: 粗品芦丁

主要仪器、试剂:电热套、圆底烧瓶、冷凝管、甲醇

实验操作步骤: 精制 ：粗品芦丁放在1000ml烧杯中，加500ml蒸馏水，加热煮沸，至全部溶解，趁热抽滤，滤液放冷，即析出黄色沉淀，待沉淀完全后，抽滤，收集沉淀，干燥。用甲醇重结晶，得精品芦丁。 实验注意事项: （1）用甲醇重结晶时加热回流时电热套电压小于50v。

（2）粗品芦丁全部溶解，趁热抽滤。

（3）重结晶时甲醇的用量应适当，用量过多，则结晶不易析出；用量过少，又会带入较多的杂质。

后记:

实验二 芦丁的提取及鉴定

实验编号:3

日期:

学时数: 8学时

地点:新校区F楼6楼天然药物化学实验室

任课教师:

实验目的:（1）芦丁的水解，鉴定；

（2）掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮苷、苷元和糖的鉴定方法。

实验原理: ，

实验对象: 精品芦丁

主要仪器、试剂:电热套、圆底烧瓶、冷凝管、甲醇、正丁醇、醋酸、葡萄糖、鼠李糖、盐酸、镁粉、醋酸镁、醋酸铅、氧氯化锆、三氯化铝

实验操作步骤: 1.水解 ：取1克芦丁加1%H2SO4100ml与烧杯中，加热微沸，30分钟，开始为澄清，逐渐析出黄色针状结晶，待沉淀完全后，抽滤，收集沉淀，水解母液留作糖的纸层析鉴定。

2. 芦丁、槲皮素的鉴定：

（1）糖的检出——圆形滤纸层析

取水解芦丁的滤液20ml，加Ba(OH)2细粉中和至pH7，滤除生成的BaSO4白色沉淀，滤液在水浴上小心浓缩近干（约1ml）注意防止炭化，加甲醇5ml,作为检识糖的样品溶液。

展开剂：正丁醇-醋酸-水（4-1-5上层）。

对照品：葡萄糖、鼠李糖（各2mg，分别溶于2ml甲醇中） 展开方式：径向展开

显色剂：苯胺邻苯二甲酸盐试剂（或，邻苯甲酸苯胺），喷雾后，105℃加热3～5分钟，有糖处显棕色或棕红色斑点。

（2）化学方法鉴别黄酮类成分

a.盐酸-镁粉反应

b.醋酸镁反应

c.醋酸铅沉淀反应

d.氧氯化锆

e.点滴反应

实验注意事项: ①糖的检出——圆形滤纸层析点样量不要太多。

后记:

实验三 氧化苦参碱的提取分离与纯制

实验编号：1

实验日期：

实验地点：

任课教师：

学时数：2+8

实验目的：掌握渗漉法和离子交换法提取生物碱的方法和原理

实验原理：1.生物碱溶于酸水

2.阳离子交换树脂提取、分离生物碱

实验对象：苦参

主要仪器、试剂：渗漉筒、烧杯、玻璃棒

阳离子交换树脂柱、阳离子交换树脂、pH试纸、培养皿 0.5%盐酸、碘化铋钾、蒸馏水

主要操作步骤：

总碱的提取：

（1）酸水提取：称取250g风干粉碎的苦参中加入适量0.5%的盐酸液，使其浸没药料，充分湿润，放置一小时。将如上酸水浸泡好的药材及溶液装入渗漉筒，待全部加完，继续补充加入0.5%的盐酸液，浸过药面，放置过夜（此步骤在实验前一天提前完成）。

继续加入0.5%的盐酸液或蒸馏水，（当渗漉液的酸性过大，改加蒸馏水渗漉，将渗漉液的pH控制在3-4之间）以1mL/min的流速进行渗漉，收集渗漉液约3750Ml,到渗漉液生物碱反应微弱为止。

（2）交换：将上述渗漉液pH控制在3-4之间，上柱交换，流速自快至慢，流出液要经常以碘化铋钾检查，如发现有未被交换的生物碱流下时，可调整流速继续进行交换，待渗漉液全部通过树脂后，把树脂倒入烧杯中，用蒸馏水洗涤数次，除去非阳离子杂质，然后滤干，放入大培养皿中自然干燥。

实验注意事项：

装渗漉筒时，药材应压实，尽赶空气，渗漉筒切勿走干。

当渗漉液的酸性过大，改加蒸馏水渗漉，将渗漉液的pH控制在3-4之间。 如发现有未被交换的生物碱流下时，可调整流速继续进行交换。

离子交换树脂柱切勿走干。

后记：（教学体会、学生对教学内容的反应等）

实验二 氧化苦参碱的提取分离与纯制

实验编号：2

实验日期：

学时数： 8

实验地点：

任课教师：

实验目的：学习索氏提取器的使用方法

实验原理：1.生物碱碱化后，溶于氯仿

2.索氏提取器氯仿连续提取将生物碱从阳离子交换树脂上洗脱下来 实验对象：交换了生物碱的阳离子交换树脂

主要仪器、试剂：索氏提取器、烧杯、水浴锅

阳离子交换树脂、圆底烧瓶、冷凝管、漏斗、滤纸 浓氨水、氯仿、丙酮

主要操作步骤：

总碱的提取：

（1） 总碱洗脱：

将晾干后的树脂放入烧杯中，加浓氨水20mL，充分搅匀，使湿润度合适，（树脂充分膨胀，但又无不吸收的过剩水份溢出）盖好， 静置20分钟后，装入索氏提取器中，用300mL氯仿在水浴上回流洗脱，至提尽生物碱为止。回收氯仿，尽力抽干。残剩物用2-3倍量丙酮溶解，尽快出现结晶，放置一定时间，过滤，得氧化苦参碱粗晶，（实际是总碱）用丙酮重结晶一次，得精品。

实验注意事项：

加浓氨水20mL，充分搅匀，使湿润度合适，使树脂充分膨胀，但又无不吸收的过剩水份溢出。

索氏提取器使用时要小心，易碎裂。

后记：（教学体会、学生对教学内容的反应等）

实验二 氧化苦参碱的提取分离与纯制

实验编号：3

实验日期：

学时数： 8

实验地点：

任课教师：

实验目的：学习使用Al2O3薄层、柱层析法分离鉴定生物碱的方法

实验原理：生物碱可以采用Al2O3薄层、柱层析法分离

实验对象：总碱粗品，Al2O3薄层，Al2O3柱层析

主要仪器、试剂：层析柱、棉花、点滴板、试管、玻璃板、毛细管、 Al2O3、碘化铋钾、圆底烧瓶、冷凝管、漏斗、滤纸

甲醇、氯仿、丙酮

主要操作步骤：

氧化苦参碱的分离与纯制：

取一根洗净干燥的1：45的层离柱，在下端塞一点棉花，倒入一些氯仿，使棉花湿润，并放出氯仿液，以赶尽气泡后，缓缓加入30g氧化铝，以氯仿作媒介湿法装柱，最后加入拌有200mg氧化苦参碱精品，薄层检查两个点的少量氧化铝，再放入一点棉花，先用30mL氯仿，后用氯仿:甲醇（99：1）的混合溶剂洗脱，流速控制1mL/min，流分每10 mL收集一份，收集中要经常以点滴板做生物碱显色反应的检查，薄层检识后，相同流分合并，回收溶剂至干，得氧化苦参碱部分用少量丙酮溶解，放置析晶，所得纯品为氧化苦参碱，测mp，并进行薄层检识。

苦参生物碱的薄层层析：

样品:氧化苦参碱标准品，粗品，柱层析中任一流份

展开剂：氯仿：甲醇 19：1或19.5：0.5

显色剂：改良碘化铋钾

实验注意事项：

湿法装柱要尽量赶尽气泡

氯仿:甲醇（99：1）的混合溶剂洗脱，流速控制1mL/min，不能过快。流分每10 mL收集一份，薄层检识后，相同流分再合并。

后记：（教学体会、学生对教学内容的反应等）