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通过实验让学生理解影响凝胶过滤层析的因素

作者：林 珊

来源：《职业·下旬》20xx年第08期

在生物化学实验中,凝胶过滤层析,也称分子筛层析、排阻层析,是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术。笔者现将凝胶层析的用途及通过实验让学生理解掌握影响凝胶过滤层析的两种因素阐述如下。

一、凝胶层析的应用广泛

凝胶层析的应用非常广泛,最主要的应用有以下四种。

1.脱盐

高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质,可以用凝胶层析除去,这一操作称之为脱盐。

2.用于分离提纯

凝胶层析已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强吸附力,可用于除去无离子水中的致热原制备注射用水。

3.测定高分物质的分子量

用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内,在同一条件下层析、记录每一分钟成分的洗胶体积;根据物质的洗胶体积,在标准曲线上查出其分子量。

4.高分子溶液的浓缩

二、通过葡聚糖凝胶柱层析实验,让学生理解影响凝胶过滤层析的两种因素

学生通过实验,掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。对于凝胶过滤层析的理论学习,学生普遍感到抽象、难理解。通过实验,可以让学生在实验的过程中,变抽象为直观,变难懂为易懂。在实验开展的进程中,学生可以亲眼观察到凝胶的选择和层柱大小、长短的不同均会对实验结果产生影响。

1.凝胶的选择,根据实验目的不同,选择不同型号的凝胶

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目前,市售凝胶主要包括:价格便宜的凝胶葡聚糖G-10,分离范围

在实验中,学生可以清楚地认识到:第一,选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个适中的分离范围,根据分离范围来选择合适型号的凝胶。如果分离范围选择过小,则某些组分不能得到分离;如果分离范围选择过大,则分离率较低,分离效果也不好。第二,选择凝胶颗粒的太小。颗粒小,分辨率高,但相对的流速慢,实验时间长,有时会造成扩散现象严重;颗粒大,流速快,分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时,要依据分离的具体情况而定。例如,样品中各个组分差别较大,则可以选用大颗粒的凝胶,较快达到分离的目的;如果有个别组分差别较小,则要考虑使用小颗料凝胶以提高分辨率。

2.层析柱的大小、长短对分离结果的影响

在该实验中,样品量较小,只有0.6ml的混合样,柱粗可采用1CM,再采用两根长短不同的层析柱进行分离。对比两者分离效果,层析柱1(1×20CM),蓝色葡凝糖2000和溴甲酚蓝明显在柱中分层,在540nm处吸光度检查,分别在12管和26管出现峰值,说明两者得到较好地分离。层析柱2(1×20CM):蓝色葡聚糖2000和溴甲酚蓝在柱中没有出现明显的分层,在540nm处吸光度检查,在第8管和10管中出现相似的峰值,说明两者出柱的时间较接近,难以分离。

另外,层析柱的长度对层析效果会产生直接影响。在实际的工作中,常常通过系统实验来选择规格适合的层析柱。为了满足高分辨率的要求,通常采用L/D(长度/直径)比值高的柱子。但是,增高柱长虽然能提高分辨率,但会影响流速和增加样品的稀释度。在该实验中,由于葡聚糖2000和溴甲酚蓝分子量差别较大,一般认为直径与高度的比为1:20为宜,柱高以20cm为准。该柱高不但满足两种样品的分离,柱上能表现明显的分层,且能缩短分离时间。

(作者单位:海南省高级技工学校)

 

第二篇：实验十四 凝胶层析