实验六：放线菌的形态观察

     

姓名:戈奕文

学号：201005140022

系别：2010生物基地

组别：周一下午第一组

试验日期：20##年11月5日

同组成员：孟亚平 宋宁 褚鹏程

【摘要】

配制高氏I号培养基用来培养青色链霉菌和弗式链霉菌，本实验运用插片法观察放线菌的形态，初步地了解放线菌的基本结构和形态。更直观的了解，基内菌丝、气生菌丝以及气生菌丝分化而成的孢子丝以及孢子。

【关键词】

青色链霉菌（Streptomyces glaucus） 弗氏链霉菌（Streptomyces microflavus）

高氏I号培养基    插片法

【前言】

放线菌（actinomycetes）是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。广泛存在于自然界中，土壤中最多，主要以孢子繁殖，至今发现的共有五六十属，它与人类的关系极为密切，根据1978年的统计，在当时已发现的5128种抗生素中，有3165种为各种放线菌所产生，链霉菌属又占放线菌中的首位（占放线菌产生的抗生素中的87.5％）；有的放线菌还可用于生产维生素、酶制剂等；少数会引起人类、动物、植物的疾病。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其孢子丝的形态多样，而且性状较稳定，是对它们进行分类、鉴定的重要指示。因此学习如何培养和观察它们不仅对科学研究有很大的意义，对实际生活应用也有很大的帮助。本实验采用合成培养基进行培养，采用插片法取菌观察，不仅可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的放线菌形态，除此之外还可以采用玻璃纸法、印片法进行观察。链霉菌属（Streptomyces）共约1，000多种，它们具有发育良好的菌丝体，也是实验中选取它们观察的重要原因。

一、   实验目的

1、掌握放线菌观察方法——插片法;

2、了解放线菌的基本形态。

二、   实验原理

1．   高氏I号培养基

高氏I号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将二种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏I号培养基中的FeSO₄?7H₂O的量只有0.00l ％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的 FeSO₄?H₂O贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。

2．   放线菌

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝 （简称“基丝”），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝 （简称“气丝”），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。

在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。在油镜下观察，放线菌的孢子有球形、椭圆、杆状或柱状。能否产生菌丝体及由菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。

3．   插片法

将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。

                     图2 插片法

三、   实验材料

1.菌种

青色链霉菌（Streptomyces glaucus）；弗式链霉菌(Streptomyces fradiae)。

2.培养基

灭菌的高氏Ⅰ号琼脂。

3.仪器和用具

显微镜；酒精灯；载玻片；盖玻片；接种环；镊子；培养皿

    

四、   实验内容

1、高氏I号培养基的制备（200ml）

1)   按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉尽量溶解，再加入沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶解。

2)   称取其他各成分依次溶解。由于条件限制，对于微量成分FeSO4·7H2O，直接用分析天平称量，加入即可。

3)   待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积，进行pH 调节到7.2～7.4。

4)   材料灭菌：将所配溶液装在三角烧瓶中并加棉塞，棉塞外包一层牛皮纸，并用麻绳捆好，用记号笔标记组号。取十个培养基，用牛皮纸包好，用记号笔标记大小面。同理盖玻片也用牛皮纸包好，再在盖玻片上加盖一层牛皮纸纸，用牛皮纸包好后，用记号笔标记，镊子也包好一起灭菌。将上述物品放入密封的加压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌121℃、20分钟。

2、插片法进行链霉菌的观察

1)        倒平板：取融化并冷至大约50℃的高氏I号培养基分装到6个培养皿中，倒平板时尽量使培养基厚一些，凝固待用。　

2)        接种：待培养基冷却凝固后，无菌操作，用接种环挑取菌种在平板上密集划线接种。

3)        插片：以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片以大约与培养基成45°角插入平板内，并与划线垂直，每个平板至少插入3个盖玻片。

4)        培养：将平板倒置，28℃下培养7天。

5)   镜检：用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，将无菌面朝上放在载玻片上，直接镜检。观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察，必要时可用油镜观察。

五、   实验结果

1、培养基中菌落形态观察：弗氏链霉菌为圆形，暗黄色，表面略凸

2、镜检结果：

表1. 显微镜下菌丝及孢子丝形态观察

弗氏链霉菌孢子丝直或柔曲。孢子椭圆形，长圆形，表面光滑。

附图：

                       

                       图1 弗式链霉菌（10×40倍）

              

 

              图2弗氏链霉菌（10*40）            图3弗氏链霉菌孢子丝（10*40）

 

        图4 弗氏链霉菌（10*100油镜）                图5 弗氏链霉菌气生菌丝放大

绘图：

 

          

六、   实验分析与讨论

1、由图可知，放线菌呈分枝丝状，分支较多交错在一起，由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三部分组成，基内菌丝为透明，有较多的分枝；气生菌丝较暗。两种菌丝在不同的焦平面上，可以调节细准焦螺旋分别进行观察。

2、由菌落特征，放线菌的细胞有基内菌丝和气生菌丝的分化，气生菌丝到成熟时又会分化成孢子丝并产生成串的干粉状孢子，这些气生菌丝或孢子丝伸展在空气中，菌丝间一般都不存在毛细管水。这就使放线菌获得其特有的与细菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，菌落和培养基的连接紧密，难以挑取菌落。

七、             实验总结

1、接种时划线要密，插片时要有一定的角度且与划线相垂直，这样较容易使菌丝长在盖玻片上。

2、镜检时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，再换高倍镜观察。菌面应该朝上，不然，菌体会被压扁，不好观察。

但是用油镜观察时，应使有菌面向下，否则会污染油镜镜头

3、链霉菌的孢子特征：孢子的形状多样，有球状、椭圆状、杆状、圆柱状、瓜子状、梭状和半月状等。孢子的颜色十分丰富，且与其表面的纹饰有关。孢子表面的纹饰在电子显微镜下清晰可见，除表面光滑者外，还有褶皱状、疣状、刺状、发状和鳞片状。刺又有粗细、大小、长短和疏密之分。目前发现，凡直或波曲的孢子丝，都产生表面光滑的孢子（尚未发现带刺或毛发状的），若孢子丝为螺旋状的，则其孢子表面会因种而异，有光滑、刺状或毛发状的。

八、     思考题

1.镜检时如何区分放线菌基内菌丝、气生菌丝及孢子丝？

答：气生菌丝直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，是指从基质伸向空气中的菌丝体。菌类的菌丝体多是匍匐在基质上，或是贯通基质而伸长的。真菌和放线菌的营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外并伸向空间的菌丝称为气生菌丝。它叠生于营养菌丝上，以致可以覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下，颜色较深，直径比营养菌丝粗，直形或弯曲，有的产生色素。有些气生菌丝发育到一定阶段分化成繁殖菌丝，产生孢子。

九、     参考文献

【1】沈萍、陈向东 《微生物学实验》高等教育出版社 第四版  P18～20 P70～73 P241

【2】沈萍、陈向东  《微生物学》 高等教育出版社  第二版P372～374

附表：高氏I号培养基（200mL）

 

第二篇：微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)

细菌形态观察

细菌分布

消毒灭菌

细菌形态观察

一、实验目的

1. 掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护
2. 掌握细菌的三种形态
3. 掌握临床常见细菌的形态及染色
4. 掌握细菌的特殊结构
5. 了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点

二、实验原理

1. 普通光学显微镜（油镜）的使用

1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头

2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰

3. 根据需要调节显微镜亮度

2. 普通光学显微镜的维护

1. 移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前
2. 油镜用毕后， 要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头
3. 镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内
4. 做好使用记录

3． 微生物知识

1． 细菌按形态分类：

球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等）

杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等）

螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等）

2． 细菌的基本结构

    细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体

3． 细菌的特殊结构

    荚膜：如肺炎双球菌

    鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌

    菌毛

    芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌

4． 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。

    原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体

    真核类：真菌、原生动物、显微藻类

    非细胞类：病毒、亚病毒

5． 真菌

    单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌

    多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。如：霉菌

6． 白假私酵母菌（白念）

    生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落

厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定

致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、 内脏感染、CNS感染

微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝

7． 新型隐球菌

    生物学性状 ：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）

致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢性脑膜炎

微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体外围有宽厚荚膜为阳性

三、实验材料

记号笔：1支；大镊子：1支；火柴： 1盒；蜡笔：1支；试管架： 1个；酒精灯：1个；接种环： 1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个

四、实验内容

1. 观察细菌三种形态

1）球菌

链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌

2）杆菌

破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌

3）螺形菌

弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌

2. 观察细菌的特殊结构

芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌

3. 绘图

葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)

五、实验结果

绘8幅细菌镜下图，已交。

六、思考与讨论

1． 显微镜高倍镜使用时看不清楚的常见原因

（1） 未滴加镜油

（2） 镜头不干净

（3） 标本放置反了，所以达不到对焦平面

（4） 制片问题：标本太厚、染色误差等

细菌分布

一、实验目的

1. 掌握固体培养基的制备

2. 掌握机体常见部位及环境中的细菌采样、培养、及初步鉴定

3. 掌握革兰氏染色方法及结果判定

二、实验原理

1. 培养基：

1． 细菌生长所需营养物质：水、碳源、氮源、无机物和生长因子

2． 培养基分类：

（1）根据营养物质：营养培养基、选择培养基、鉴别培养基

（2）根据物理性质：液体培养基、固体培养基和半固体培养基

3． 细菌在培养基中的生长状况：表面生长、均匀浑浊生长、沉淀生长

2. 革兰氏染色：

革兰阳性细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，通道弯曲，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后孔径仍可使结晶紫与碘的复合物通过，因而将染料洗去而被脱色。

三、实验材料

咽拭子、羊血培养皿：1套/人；大号普通培养皿：1块/2人；载玻片：1片/人； A、B菌：6套/桌；NS：1份/人；滤纸：1张/人；消毒液：4套/桌；三角瓶、电天平、营养琼脂、称药纸、称药勺、量筒：1套/桌

四、实验内容

1. 培养基制备

1）按产品要求称取营养琼脂

2）每实验桌制备200ml

3）高压蒸汽灭菌后，在洁净工作台内倒平皿

4）所制备的普通平皿用于空气培养

2. 机体不同部位的细菌采样、培养

1）咽部正常菌群的采样、培养

咽拭子擦拭咽部，平行划线法接种于羊血平皿。

2）手指消毒前后细菌的采样培养

未消毒手指平行划线法接种于普通平皿；同一手指碘酒、酒精消毒后平行划线法接种于普通平皿。

3. 环境中细菌采样培养

1）空气培养

将培养皿打开暴露于空气中，20分钟后盖好平皿盖儿

2）流通纸币（或硬币）的细菌采样培养

将硬币正反面分别在培养基上充分接触

3）采样结束后，将培养皿底部朝上放入铁丝筐，统一置培养箱：37℃ 18-24小时

4. A、B、C菌鉴定（革兰氏染色法）

1）. 细菌涂片制备程序：

（1）取一干净玻片，火焰上方缓缓通过三次去油

（2）蜡笔画线将玻片分割为A、B、C三区域

（3）接种环取生理盐水分别滴入A、B两区域各一滴

（4）分别取少许A、B 、C菌 ，与生理盐水充分混匀成菌液，风干后形成菌膜

（5）固定（火焰上方缓缓通过三次）

（6）革兰氏染色

（7）滤纸吸干水分，油镜观察

2）. 革兰氏染色：

（1）细菌涂片、火焰固定

（2）结晶紫初染 1min

（3）卢戈氏碘液媒染 1min

（4）95%乙醇脱色 30-40s   

（5）沙黄复染 1min

五、实验结果

A：G+，球菌，推测为金黄色葡萄球菌；

B：G-，短杆菌，推测为大肠杆菌；

六、思考与讨论

1． 影响革兰氏染色的因素：

（1）细菌本身因素：

     菌龄：如果菌龄太大，可能出现假阴性

（2）操作因素

     涂片：取菌应适量，涂片要均匀，如果某个部分菌层太厚，可能在脱色时达不到，会导致局部假阳性

     固定：固定温度太高或时间太长都会导致细菌结构破坏而出现假阴性；但是固定不够，细菌会在水洗时被冲掉

     初染：初染时间虽然说是1分钟，但是可以适当延长，时间太短会出现假阴性；染色滴加不均匀可能出现半阴半阳

     媒染：和初染一样

     脱色：脱色时间不能过长，基本上用酒精滴过之后马上水冲就可以了，否则容易出现假阴性

     复染：复染时间需足够长，否则可能会染不上

消毒灭菌

一、实验目的

1. 了解实验室常用消毒灭菌方法及其原理

2. 掌握实验中所用仪器的使用方法

3. 掌握机体常见部位及环境中的细菌培养物的初步鉴定

4. 强化革兰氏染色技能

二、实验原理

1． 口咽部及皮肤正常菌群

鼻咽部及扁桃体：葡萄球菌、类白喉杆菌、肺链、溶血及非溶血性链球菌、奈瑟菌等

口腔：链球菌多见、放线菌、螺旋体、G-杆菌等

皮肤：表皮葡萄球菌、丙酸杆菌、类白喉杆菌、铜绿假单胞菌

2．溶血类型

α溶血：现象：草绿色溶血环

常见菌种：机会致病菌（甲链、肺链 ）

原理：细菌产生过氧化氢将血红蛋白氧化成深绿色的高铁血红蛋白

β溶血：现象：透明溶血环

常见菌种：致病菌（乙链 )

原理：细菌释放溶血素使红细胞破裂，血红蛋白释放

三、实验材料

咽拭子培养物：1套/人；空气、纸币、手指消毒前后培养物：1套/2；载玻片： 1片/人；NS：1支/人；滤纸：1张/人

四、实验内容

1. 常用消毒灭菌方法：（示教讲解）

1）．热力灭菌：

（1）干热灭菌法：焚化、烧灼、干烤（160 ℃ ，2小时）

（2）湿热灭菌法：煮沸（2%Na₂CO₃，105 ℃）；高压蒸汽灭菌（103.4kPa，20分钟，121℃，临床运用最广的灭菌方法）

2）. 紫外线（Ultraviolet radiation)：

波长265nm-266nm(DNA吸收光谱）杀菌能力最强。紫外光穿透力差，一般只用于不耐热物品表面的消毒。

3）. 过滤(filtration)

用物理阻流的方法除去液体或空气中的细菌，用于不耐热物质的灭菌（血清、毒素、抗生素等）

滤菌器：薄膜滤菌器、玻璃滤菌器、石棉滤菌器、素陶瓷滤菌器

4）. 低温

保存菌种（冷冻真空干燥法）

5）．常用的化学消毒剂

6）．实验室常用化学消毒剂：

70-75%乙醇

洁净台消毒：来苏水擦拭

防腐剂：三氯甲烷、硫柳汞、叠氮钠

2． 细菌分布结果鉴定

1）观察菌落

2）取部分菌落的细菌进行革兰氏染色并观察

五、实验结果

1. 咽部正常菌群的采样、培养结果：

在羊血培养皿上出现四种菌落：

（1）       数目多，划线沿线都有；针尖大小；无色、光滑、湿润、透明、圆形。周围出现草绿色溶血环，发生了不完全溶血即α溶血。

（2）       数目较多，划线沿线都有；较小；乳白色、光滑、湿润、半透明、圆形。

（3）       少，只出现在四个点；中型；乳黄色、光滑、半湿润、不透明、形状不规则。在此种菌落下方的培养基出现了透明溶血环，发生了完全溶血即β溶血。

（4）       1个菌落；较大；乳白色、光滑、湿润、半透明、圆形。粘稠。

取（1）、（2）、（3）进行革兰氏染色，结果如下;

（1）       G+，链球菌，根据不完全溶血推断，为甲型链球菌。

（2）       G-，球菌，细胞个体小，形状像金黄色葡萄球菌，但是染色为阴性。

（3）       G-，球菌。

2. 手指消毒前后细菌的采样培养结果：

1）消毒前：

仅出现2个菌落，较小；乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。

革兰氏染色结果：G-，杆菌

2）消毒后：无菌落出现。

3. 硬币正反面的细菌采样培养结果：

1）正面

三种菌落：

（1）13个菌落；较小；乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。和手指消毒前的菌落一样。

（2）1个菌落；较大；白色、光滑、湿润、近似圆形。

（3）5个菌落；较大；中央乳黄色边缘颜色变浅、光滑、湿润、中间凸、不规则、边缘光滑

取其中（2）、（3）进行革兰氏染色，结果如下：

（2）G-，杆菌。和手指消毒前的细菌一样

（3）G-，链杆菌。形态较大，形状像炭疽芽胞杆菌，但是没有芽孢且染色为阴性。

2）反面

两种菌落：

（1）2个；较大，乳白色、光滑、湿润、有光泽、圆形。

（2）多个，沿硬币边缘线连成一片；针尖大小、无色、光滑、湿润、透明。

4. 空气培养结果

平皿敞开在实验室的窗台上放置了约20分钟，当时阳光照在上面：

平皿出现了五种菌落：

（1）11个；中等大小；白色、光滑、湿润、半透明、圆形

（2）2个；较大；周围白色，中间有一个透明圈，光滑、湿润、中间凹的圆饼状

（3）1个；较大；周围黄色，中间有一个透明的圆形区域，半湿润、没有光泽

（4）1个；较大；边缘橘黄色，中央偏白、明显凸起、干燥、形状不规则

（5）1个；较大；边缘透明，中央乳黄色，光滑、湿润、半透明、圆形

取其中（3）、（4）进行革兰氏染色，结果如下：

（3）G-，杆菌。和手指消毒前、硬币正面菌落（2）的细菌一样

（4）出现三种细菌：

G-，双球菌

G+，双球菌

G-，梭菌

5． 八个取样染色结果

六、思考与讨论

1． 巴氏消毒法的利用

巴氏消毒法是一种低温消毒法，包括：低温维持法：62.8摄氏度维持30分钟；高温瞬时法：71.3摄氏度作用15-30秒。

该法适用于食品的消毒。现主要应用于乳制品。

2． 为什么湿热消毒法的温度比干热消毒法低？

课堂上讲到的干热消毒法温度都比湿热消毒法要高，说明湿热灭菌法可在较低的温度下达到的灭菌效果可以与干热法相同，分析原因如下：

（1）   湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性；

（2）       水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能，在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的

（3）       蒸汽潜热大，每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。

3． 细菌分布试验结果讨论

咽部正常菌群主要为：溶血和非溶血性链球菌、球菌等，不同人由于个体差异和取样部位差异，所得菌种也有所不同

手的消毒是有效的，消毒后细菌明显减少了。同时手上的菌是很多的，所以需要常洗手。手上较常见的是四联球菌。

硬币上的菌也相对较多，因为它经历的环境很多。

在咽部、硬币和未消毒的手上，都得到了一种很像大肠杆菌的革兰氏阴性杆菌，说明这种菌分布非常广泛。

4． 空气培养取样染色时，为什么得到三种菌？

图1 空气培养取样革兰氏染色（10*100）

一般认为，菌落形成是一个菌落到培养基上并增殖而来，但是在空气培养得到的菌落取样染色时，发现了三种形态完全不同的菌（如图1，较大的双球菌和梭菌为革兰氏阴性，较小的双球菌为革兰氏阳性）。可能的原因有：

（1）       取样的污染，该菌落被两次取用，可能遭到污染

（2）       在非常小的概率下，三个不同的菌掉到了同一处，同时这三种菌的生长互不影响甚至互利，于是形成了混合菌群。

（3）       三个菌落在生长过程中由于靠得很近而融合了。