培养基的常规配置程序

一、目的要求

1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。

2. 掌握培养基的配置原则和方法。

3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。

二、基本原理

营养琼脂培养基：

是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。

高压蒸汽灭菌：

主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。

三、实验材料

1. 药品：营养琼脂、蒸馏水。

2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿等。

3. 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。

四、操作步骤

（一）玻璃器皿的洗涤和包装

1．玻璃器皿的洗涤

将玻璃器皿浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。再置于烘箱中烘干后备用。

2．灭菌前玻璃器皿的包装

（1） 培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，用报纸按传统包月饼的方法，将几套培养皿包成一包，准备灭菌。

（2） 移液管的包扎：

先将报纸裁成宽约5cm的长纸条，然后将移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧。在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。

（3）无菌水的制备：往两支洁净的试管中分别加入10ml蒸馏水，用试管塞塞好，准备灭菌。

（二）固体培养基的配制过程

1．培养基配制

（1）称取4g营养琼脂，溶于125ml的蒸馏水中，加热使其完全溶解。

（2）培养基的分装

分装时，将4支洗净的试管放置在试管架上，用5ml的移液管分别移取适量的上述溶液于试管中（装入量不宜超过试管高度的1/5）；将剩余溶液倒入锥形瓶中（装入量以锥形瓶总体积的一半为限度），用橡皮塞塞好瓶口。

（3）试管、锥形瓶的包扎

将上述所有试管（包括盛装无菌水的试管）捆成一捆。然后，将捆好的试管与锥形瓶标明组别与日期。

（4）培养基的灭菌

将包扎好的玻璃器皿与捆好的试管与锥形瓶在高压灭菌锅中常压，121℃条件下灭菌20min。

（5）斜面的制作

将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度（斜面长度不超过试管长度l／2为宜），凝固后即成斜面。。

（6）平板的制作

在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部，左手同时用小指和手掌将塞子打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，将装在锥形瓶中已灭菌的培养基，待冷至50℃左右分别倾入10~12mL培养基，于2个无菌培养皿中，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。

五、实验过程原始记录

营养琼脂：4g

1、4g黄色营养琼脂粉，完全溶于125ml蒸馏水后，得到橙黄色的，透明的胶体溶液。

2、将营养琼脂液按实验步骤操作，冷却至室温后，即得到无色（略带黄色）的胶状培养基。

六、结果及讨论

（一）实验结果

成功的制备出了斜面和固体培养基，使后续细菌接种试验顺利进行。但仍存在些缺陷，有待改进。

1、理论上，培养基分装于试管后，应用棉塞封好试管口，且棉塞的质量好坏直接影响试验结果。但试验时，使用试管塞封口，由于试管塞一般不透气，在灭菌的升温和降温过程中，试管内外压力会有差异，当管内压力大于管外压力时可能使塞子飞出或试管爆裂。而棉花塞透气，能保持内外压平衡，且阻止细菌进入。

2、动手能力差，有时不知所措；且操作粗心大意，损坏玻璃器皿。

（二）、注意事项：

1、在琼脂加热溶解的整个过程用玻棒不断搅匀，防止琼脂粘在烧杯底部而使烧杯破裂；同时也使其充分溶解，避免培养基制作失败，必要时可补足因蒸发而失去水分至总体积。

2、一般情况下在配制固体培养基时，溶解的琼脂液无须过滤。必要时，可趁热用4—5层纱布过滤。

3、根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染，如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。

4、平板制作时，将已灭菌的培养基待冷至50℃时倾入培养皿；若温度过高时，则皿盖上的冷凝水太多；反之，培养基易于凝固而无法制作平板。

5、灭菌时，以灭菌最彻底而营养破坏最少，且方法最简便为原则。加压之前，冷空气一定要完全排尽，以提高灭菌效果；恒温灭菌时，最好等自然使表压减至“0”以后，才能打开灭菌锅盖。

（三）思考题回答

1、霉菌时，塞试管的棉塞是否可以用橡皮塞代替？为什么？

答：不可以，因为橡皮塞不透气，在灭菌的升温和降温过程中，试管内外压力会有差异。当管内压力大于管外压力时可能使塞子飞出或试管爆裂。而棉花塞透气，能保持内外压平衡，且能阻止细菌进入。

2、如何检查所配置的培养基无菌？

若没有灭菌，一定有菌。而有灭菌，则置于37℃恒温箱中培养，两三天观察表面有无菌落形成。若无，证明培养基无菌，反之亦然。

 

第二篇：培养基配置

. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂)

Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g

NaCl 5g Agar (琼脂) 15g

Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2

[Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added .

It is favorable to promote spore formation .

适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌

营养肉汤培养基

牛肉膏 0.3克

蛋白胨 1.0克

NaCl 0.5克

水 100毫升

pH 7.0～7.2

在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，加热溶化后，调节pH值至7.0～7.2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。常用于培养细菌。

2.营养琼脂培养基

在营养肉汤培养基中增加20克琼脂即成。常用于培养细菌

营养琼脂成分

蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15～20g 蒸馏水 1000mL制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121℃高压灭菌15min

改良马丁培养基

Martin Medium,Modified

改良马丁培养基产品价格

用途：用于药品及生物制品霉菌无菌检验 配方：（g/L）

蛋白胨 5.0

磷酸氢二钾

硫酸镁

酵母粉

葡萄糖

pH值6.4 ± 0.2 1.0 0.5 2.0 20.0 25℃

(琼脂 14g)

原理：

蛋白胨提供碳源和氮源；酵母粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；磷酸氢二钾为缓冲剂；硫酸镁提供必须的微量元素。

用法：

称取本品 28.5g ,加热溶解于1000ml 蒸馏水中,分装 ,115℃高压灭菌 20 分钟,备用。

玫瑰红钠琼脂

Rose Bengal Medium

玫瑰红钠琼脂产品价格

用途：用于霉菌、酵母菌计数 配方：（g/L）

蛋白胨

磷酸二氢钾

玫瑰红钠

硫酸镁

葡萄糖

琼脂

原理：

蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氢钾为缓冲剂；硫酸镁提供必须的微量元素；玫瑰红钠作为选择性抑菌剂可抑制细菌的生长，并可减缓某些霉菌因生长过快而导致菌落漫延生长；琼脂是培养基的凝固剂。

用法：

称取本品 31.5g,加热溶解于1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌 15 分钟备用 5.0 1.0 0.0133 0.5 10.0 14.0

营养琼脂培养基

Nutrient Agar Medium

营养琼脂培养基产品价格

用途：用于药品中细菌总数计数

配方：（g/L）

蛋白胨

牛肉粉

氯化钠

琼脂

PH值

原理：

蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂。

用法：

称取本品3.3 克，加热搅拌溶解于100ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟备用 10.0g 3.0g 5.0g 15.0g 7.3±0.1