质粒DNA的提取、纯化及验证

姓名：肖风      学号：201000100122      20##级生物工程

一、【实验目的】

1、 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

2 、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。

3 、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。

二、【实验原理】

1、碱变性提取法

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2、琼脂糖凝胶电泳

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：

(1)样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。

(2)DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1iner DNA，L DNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。

(3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。

(4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 V／cm。

(5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。

 (6)温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0．5％时，凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。

三、【实验材料】

恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，水浴锅；1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器等。

菌体：E.coli DH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19

微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管，刀片，塑料薄膜等。

酶切后的DNA样品或其他待分离纯化的DNA样品；琼脂糖，TAE缓冲液，溴化乙锭（EB），6×上样缓冲液，DNA相对分子质量标准物DNA Marker λ/Hind III，5 mol/L pH5.2的醋酸钠，无水乙醇。

四、【实验步骤】

（一）、实验前准备

    1、LB培养液+1%葡萄糖

按照附录所示配方配制LB培养液，并添加1%葡萄糖，115℃灭菌30min，分别分装于100mL锥形瓶中20mL，300mL锥形瓶中50mL；同时配制固体培养基用于活化菌株。

2、枪尖：1000μL（蓝色）、200μL（黄色）、20μL（白色），灭菌备用

3、离心管：1.5mL离心管于500mL锥形瓶中，50mL离心管2支，灭菌备用

4、吸管：10mL吸管，灭菌备用

（二 ）、质粒提取

1、细胞培养

在含有氨苄青霉素的LB平板上挑去携带有质粒pUC19的E.coli 单菌落，接种于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养液吸取2—3mL接种到50mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养4—6h，即到达菌体生长的对数晚期。

 2、 质粒提取

2.1. 取30mL菌液于50mL灭菌离心管中，在7000r/min条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体细胞。空管质量为15.570g。

2.2. 向离心管中加入5mL冰箱预冷的溶液Ⅰ，加入溶液I主要是为了打散菌体，使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬液，为下一步破碎菌体做准备，可剧烈振荡，此时细胞尚未破裂，不用担心染色体断裂。为节省时间，可在漩涡振荡仪上混匀。通过步骤（1）离心，弃去上清液，将离心管倒置，使上清液全部流尽，用吸水纸擦干，称量菌体质量，为15.742-15.570=0.172g。

2.3. 按湿菌体质量：溶液I体积=100mg：1mL的比例加入用冰箱预冷的溶液I（2mL），剧烈振荡，使细菌完全分散，将离心管置于碎冰中冰浴5min

2.4. 以2倍体积加入新配制的溶液Ⅱ（4mL），轻摇轻加，至半透明溶液形成。此步是DNA变性的关键步骤，加入溶液II后，菌悬液pH上升到12左右，为强碱性，破坏大肠杆菌（G-）细胞壁，此时，溶液变粘稠、透明，无菌块残留，因为染色体DNA与质粒DNA均变性溶解于强碱溶液中，蛋白质也溶于溶液中，但质粒DNA双链不完全分离。因此步染色体DNA释放，故动作必须轻柔，不能剧烈震荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解于溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。可缓慢上下颠倒离心管数次，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。

2.5. 以1.5倍溶液I体积量加入冰箱预冷的溶液Ⅲ（3mL），轻加轻摇，慢慢颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上10min，此时有白色絮状沉淀物。此步是质粒DNA复性的关键步骤。动作要轻柔，理由同上。同时可减少对质粒DNA的破坏，使其保持超螺旋闭环结构。

2.6. 12000r/min离心15min，将上清液轻轻转移到另一洁净离心管中，向上清液中加入1/10体积的 3mol/mL 的NaAc和2倍体积的冰无水乙醇，混匀，-20℃下静置30min，沉淀DNA。

2.7. 如（6）中离心15min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有的液体流出。

2.8. 向沉淀物中加入70%乙醇3mL，不打散沉淀洗涤一遍。12000r/min离心5min，弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥。

2.9. 将DNA沉淀溶于1mLTE缓冲液中，加入RNase A（终浓度大于50μg/mL）。37℃保温0.5—1h。

3 质粒DNA的纯化

     3.1. 将上述DNA溶液平分在2个1.5mL的微量离心管中，每管0.5mL，分别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液，混匀，7000r/min离心5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。离心后，苯酚位于离心管的最下方，蛋白质层位于中间，溶解有质粒DNA的水层位于最上方。离心管从离心机里取出后，尽量减少晃动，以免蛋白层污染DNA水溶液，使分界面模糊、不清晰，不利于下一步分离。使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时，一定要戴橡胶手套，注意安全。一旦皮肤被苯酚等污染，立即用大量水清洗。

3.2. 加入等体积苯酚:氯仿（1:1）混合液，混匀，7000r/min离心5min，取上层清液到另一洁净微量离心管中。

3.3. 加入等体积氯仿溶液，混匀，7000r/min离心5min，取上层水相到另一洁净微量离心管中。

3.4. 加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc溶液，混合均匀，于-20℃沉淀0.5h以上。沉淀质粒DNA可采用无水乙醇，需在低温条件下静置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类，低温条件可保证DNA水解酶类保持在低活性，以减少其对DNA的降解。用70%的乙醇洗涤质粒DNA沉淀，主要目的是利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入RNase A前洗涤去盐类，可保证酶活不受其影响。

3.5. 12000r/min离心15min，收集沉淀，弃去上清液并干燥。

     3.6. 在沉淀DNA中，加入70%乙醇200μL，不打散沉淀洗涤一次，12000r/min离心1min，小心弃去上清液，将离心管倒置于纸巾上使所有的液体流出，室温干燥。

3.7. 用50μL TE溶液重新溶解DNA，温和震荡几秒钟，备用。溶解沉淀时，为获得最大量产品，应逐滴加入溶剂，边加边摇；尽量少转动离心管，避免过多样品粘于壁上导致损失。

4 DNA纯度检测（0.9%琼脂糖凝胶电泳法）

4.1. 制板

4.1.1. 称量0.36g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入40mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，使琼脂糖融化。

4.1.2. 待凝胶温度降至大约55℃以下（手持瓶子不烫手，即感觉热但能握得住）。

4.1.3. 在模具上插入一个合适的梳子形成加样孔（如果待回收的DNA体积较大时，可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住，使之形成较大的孔）。梳齿的位置应在托盘底面上0.5~1.00mm，这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。

4.1.4. 将凝胶倒入准备好的制胶模具中，等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状（月30min），将梳子轻轻拔出。

4.1.5. 用拇指和食指轻移胶版两侧，将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。

4.2. 电泳

4.2.1. 取3μL质粒样品+1μL电泳载样液，在塑料薄膜上用微量移液管吹吸混匀，加入到凝胶孔中，枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。吹洗法混匀少量液体时需注意避免产生气泡，增加操作难度和误差。用微量移液器吸进液体时应该小心，避免产生气泡；吹出液体时，不要将液体从针尖口完全吹出，要留一滴在针尖口处，可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解，不至于损失。注意，在塑料薄膜上混匀buffer和DNA样品时，枪尖不要太倾斜，以免吹走液滴。

4.2.2. 取适量上样缓冲液和一定量的待分离纯化的DNA样品（如酶切产物、PCR产物等）滴在塑料薄膜上，混合均匀后一同加入到凝胶孔中，样品应沉于孔底（混合液比重大）。此外，在相邻的加样孔中加入合适的DNA Marker（如λ/Hind III 3μL）。

4.2.3. 点样完成后，盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳压（一般是5V/cm）以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA样品从负极向正极移动。

4.2.4. 当前沿DNA接近胶的前端时，切断电源，停止电泳（大约1h，100V），打开槽盖。

4.2.5. 用溴化乙锭染色10min后，用凝胶成像仪观察，记录结果。

六、【实验结果及分析】

实验结果图：

图1  各组质粒DNA电泳条带

结果分析：

1、从胶的左边开始，各条带分别是：（1）pUC19（2）DNA marker（3）-（14）为各组提取的质粒DNA带

2、从左开始第三条带是我们组的电泳带。以左边第二条为例，从上到下依次是：蛋白质，染色体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒DNA带（主带），RNA带。

3、由图可见，我们组提取的质粒DNA样品中，染色体DNA、蛋白质带明显比其他一些组和marker带亮，说明抽提的不太干净，含少量杂蛋白，纯度不高。原因是在纯化的过程中未能将蛋白质除尽，吸取上清的时候也可能带进少量的蛋白质。

4、我们提取出的质粒DNA中开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，由亮度可知含量也较少。相对来说，开环质粒DNA的含量比线性的要多一点。而超螺旋质粒DNA带相对于其他组较暗，说明所提取的该质粒含量较少，操作不如其他组规范，损失了部分DNA。

七、【实验总结】

我们组提取的质粒DNA的数量和质量不够理想，掺杂了少量的蛋白质与染色体DNA，而所要提取的超螺旋质粒DNA含量较少，原因是多方面的，其一是在质粒提取的过程中，用碱处理时，染色体DNA可能没有完全被打散；其二是质粒纯化的过程中，吸取上清液时混入了蛋白质，且操作次数少，蛋白可能有部分没有变性。

 

第二篇：实验十一 质粒DNA的提取与纯化

实验十一 质粒DNA的提取与纯化

一、实验目的与原理

质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。

二、材料与试剂

1、材料：大肠杆菌

2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪

3、试剂：

Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)

10 mM EDTA(pH8.0)

50 mM葡萄糖

高压灭菌，4℃保存

Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用

Solution III 5 N KAc pH4.8

高压灭菌，4℃保存

3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌，4℃保存。异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，无水乙醇，70％乙醇，LB培养基，电泳试剂

三、操作步骤

1、细菌繁殖

LB培养基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，摇一摇，过夜

2、离心10 min，5000 rpm, 4℃；弃上淸液

3、沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5000 rpm, 4℃

加入预冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min

4、重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min

5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min

6、加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12000 rpm, 4℃

7、加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min

8、离心10 min，12000 rpm, 4℃

9、取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中

10、加入40 ul，3 M NaAc

11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀

12、离心10 min，12000 rpm, 4℃

13、取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14、电泳检测提取DNA的质量

三、结果与分析

超螺旋结构DNA

四、注意事项

在本实验中，如果不经过RNase处理，在电泳带中，RNA会呈现极亮的带，所以，建议使用RNase处理一下。离心时应注意转速不能太低，太低会导致质粒不纯；也不要太高，否则质粒不易溶解。电泳时应注意电压，电压太高或混有蛋白质杂质时电泳带容易产生偏离和拖尾。在DNA操作中应尽可能轻地操作（尤其是分别加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ轻轻摇），否则质粒容易断裂，从而在观察条带时出现许多杂带。无水乙醇可用于沉淀质粒，如果质粒量比较大的话，一般用异丙醇来沉淀。

整个制备过程一般可分为5个阶段：

①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需进行细胞器的分离）

③提取

④纯化（包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等）

⑤浓缩、干燥及保存。以上5个阶段不是要求每个方案都完整地具备，也不是每一阶段截然分开。

原料的选择主要依据实验目的。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

二、前处理

1

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细

胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

主要方法有：

Ⅰ反复冻融法

Ⅱ冷热变替法

Ⅲ超声波法

Ⅳ加压破碎法

化学及生物化学方法

Ⅰ有机溶媒法

Ⅱ自溶法

Ⅲ酶法

细胞器的分离一般采用差速离心法。细胞经过破碎后，在适当介质中进行差速离心。利用细胞各组分质量大小不同，沉降于离心管内不同区域，分离后即得所需组分。细胞器的分离制备、介质的选择十分重要。最早使用的介质是生理盐水。因它容易使亚细胞颗粒发生聚集作用结成块状，沉淀分离效果不理想，现一般改

用蔗糖、Ficoll（一种蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。

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1. 分离纯化的原则

纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。

主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等

蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。

蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，

提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中

的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先

拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG

频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，

使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢

自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲

磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离

子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。