上海大学生命科学实验中心
课 程: 学 号:
实 验 预 习 报 告
姓 名: 同组者: 温 度:
日 期:
指导老师: 湿 度:
实验时间:
(一律用A4纸、钢笔书写或打印,不得涂改,经教师签字后方为有效,附在实验报告中一并交。 如无此原始记录或丢失,报告不批示成绩) 实 验 名 称:酪蛋白的制备
1.目的:学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法,并依此加深对等电点概念的印象。
2.原理、仪器设备、材料和试剂:
原理:牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质。其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质。不溶于水、乙醇及有机溶剂,但溶于碱溶液。牛乳在pH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称乳清蛋白。乳清蛋白不同于酪蛋白,其粒子的水合能力强、分散性高,在乳中呈高分子状态。
? 在处于其等电点时,兼性离子/粒子在溶液中的溶解度降低;如果我们将牛奶的 pH 调到 4.7,就可获得酪蛋白沉淀;下一步,用乙醇、乙醇-乙醚混合物、乙醚来洗涤沉淀物,以去除脂溶性杂质,就可得到较纯的酪蛋白。
试剂:95%乙醇;无水乙醚;乙醇—乙醚混合液 (V/V=1∶1) 。 ? 0.2mol/L pH4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL: ? A液:称取NaAc 3H2O 54.44g,定容至2000mL。
? B液:称取优级纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g定容至1000mL。
? 取A液1770mL,B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。 仪器:离心机 ;抽滤装置 ;研钵 ;布氏漏斗 ;容量瓶。
3.操作步骤及现象记录
1.将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃。将20mL牛奶加热至40℃,在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液。
2.用精密pH试纸调pH至4.7,可见溶液变为乳白色悬浮液。待悬浮液冷却至室温,3000rpm离心
1
15min,弃上清,得酪蛋白粗制品。用6mL水洗脱沉淀1次,3000rpm离心10min,弃上清 在沉淀中加入6mL95%乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤
3.用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次,最后用乙醚洗涤沉淀1次,抽干。将沉淀摊开在表面皿上,风干,得酪蛋白纯品。准确称量,计算含量和得率
含量= 酪蛋白
g%) 得率= 测得含量
×100%
4.思考题
2
? 1. 制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?
答: 1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质,故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂,最好在通风橱内操作。3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品,不是纯净牛奶,所以计算时应按产品的相应指标计算。
? 2. 试设计另一种提取酪蛋白的方法。
答:用盐析法,加重金属离子、有机酸、有机溶剂等,都可以使蛋白质沉淀下来。蛋白质沉淀后,离心10分钟(3000r/min)。水洗两次,离心10分钟(3000r/min)。
加入乙醇,搅拌,悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀两次,抽干。沉淀风干,得酪蛋白纯品。加入有机溶剂是除去脂类杂质。
采用3000g,30min离心的方法,最后酪蛋白沉到最下面。
? 3. 用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序是否可以变换?为什么?
答:不能颠倒次序。经过这个次序以后,结晶吸附的溶剂改为乙醚,乙醚沸点低,容易挥散干净,得到纯的结晶。乙醇和乙醚的溶解性能产很远,乙醇实际上介于水和有机溶剂之间,而乙醚是完全的有机溶剂,他们各自去洗涤各自能溶解的物质,从无机(水)到有机(乙醚)。最后用乙醚是因为 它会很快挥发掉 不留痕迹,可得到纯粹的蛋白质。
4. 等电点沉淀蛋白质的原理是什么?
答:在等电点时,蛋白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物
3
酪蛋白的制备
一、目的
1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。
2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。
二、原理
牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白,含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物,等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理,将牛乳的pH调至4.7时,酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物,除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。
三、材料、试剂与器具
(一)材料
新鲜牛奶
(一)试剂
1、95%乙醇 1 200mL
2、无水乙醚 1 200mL 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 300ml 先配A液与B液
A液:0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC·3H2O 54.44g,定容至2000ml。 B液:0.2mol/L醋酸溶液,称优 纯醋酸(含量大于99.8%)12.0g定容至1000ml。
取A液1770ml,B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。
4、乙醇——乙醚混合液
乙醇:乙醚=1 :1(V/V)
(二)器具
1、离心机 2、抽滤装置
3、精密pH试纸或酸度计 4、 电炉
5、烧杯 6、温度计
四、操作步骤
(一)酪蛋白的粗提
100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。
将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3000 r /min)。弃去清液,得酪蛋白粗制品。
(二)酪蛋白的纯化
1、用水洗涤沉淀 3次,离心10分钟(3 000r/min),弃去上清液。
2、在沉淀中加入30mL乙醇,搅拌片刻,将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次,抽干。
3、将沉淀摊开在表面 上,风干;得酪蛋白纯品。
(三)准确称重,计算含量和得率。
含量:酪蛋白g/100 mL牛乳(g%)
式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。
五、注意事项
1、由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质,故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。
2、精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂,最好在通风橱内操作。
3、目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品,不是纯净牛奶,所以计算时应按产品的相应指标计算。
六、实验报告
1、根据实际操作,以流程图形式总结酪蛋的制备方法。
2、合理分析实验所得率
七、思考题
1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么?
2、试设计另一种提取酪蛋白的方法?
PreparationofcaseinIThepurposeandrequirements1Mastertousethecentrifuge2Mast…
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