实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳(4学时)
实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
实验原理
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA
核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;而pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。
影响核酸分子泳动率的因素主要是:
1、样品的物理性状
即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。
2、支持物介质
核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成,其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。
琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子,而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶,可以分离不同大小范围的DNA分子。
3、电场强度
电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过4V/cm。而对于大片段电泳,甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
4、缓冲液离子强度
核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时,会使DNA污染磷酸盐,影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。
在缓冲液中加入EDTA,可以鳌合二价离子,抑制DNase,保护DNA。 缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度最高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA损伤不是很大,所以也比较适用。
使用溴化乙锭对DNA样品进行染色,可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中,可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况,但是如果要测定核酸分子大小时,不宜使用以上方法,而是应该在电泳结束后,把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10~30min进行染色。BE见光分解,应在避光条件下4℃保存。
材料、试剂及器具
1、材料
1kbMarker(分子量标准);DNA样品
2、试剂
加样缓冲液(6x):0.25%溴酚兰,40%蔗糖;琼脂糖;溴化乙锭(EB);酶液(10mg/ml)。
3、器具
(1)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。
(2)紫外透射仪。
操作步骤
1、按所分离的DNA分子的大小范围,称取适量的琼脂糖粉末,放到一锥形瓶中,加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液。冷却至60℃左右,在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。
2、取有机玻璃制胶板槽,有透明胶带沿胶槽四周封严,并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。
3、水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。
4、.待胶凝固后,小心拔起梳子,撕下透明胶带,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。
5、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面
6、把待检测的样品,按以下量在洁净载玻片上小心混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。
1μl加样缓冲液(6×)+5μl待测DNA样品
〔+0.5μlEB液(10mg/ml)(注:若胶内未加EB,可选用此法)。〕
7、接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5V/cm,开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。
8、观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处,可停止电泳。
9、染色:把胶槽取出,小心滑出胶块,水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上,放进EB溶液中进行染色,完全浸泡约30min。
10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯(360nm或254nm),通过观察孔进行观察。
注意事项
1、电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。
2、预先加入EB时可能使DNA的泳动速度下降15%左右,而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB,染色步骤可省略;若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加EB,也建议增加此步。
3、加样进胶时不要形成气泡,需在凝胶液未凝固之前及时清除,否则,需重新制胶。
4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时,溴酚兰在0.5%~1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度,而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。
实验报告
1、记录所观察的电泳图谱,注意每条带的相对位置及浓淡等。
2、判断实验37提取的质粒的相对分子量的大约数值,分析解释实验结果。
思考题
如何通过分析电泳图谱评判基因组DNA、质粒DNA等提取物的质量?
实验十五 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳
【原 理】
琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术,可用于分离,鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。
【操作步骤】
1、将凝胶成形模具两端用医用胶布封好,水平放置,将选好的梳子放好,梳子底部与模具之间留1mm空间。
2、称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧杯中,加入100ml 1×TAE缓冲液,混匀后,将烧瓶置于电炉上,加热煮沸,直至琼脂糖完全溶解。
3、关闭电炉,取下三角烧瓶,将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受),再加入溴化乙锭(10mg/ml)5μl,混匀后,即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。
4、室温下待凝胶完全凝固,需时约30分钟,揭去二端胶布,拔出梳齿,将胶板放入电泳槽中。
5、在电泳槽中加入1×TAE缓冲液,以高出凝胶表面2mm为宜。
6、取EP管三支,标号,如下表所示准备电泳样品。
样品
6×点样液123 λDNA/HindⅢ
10μl(lr)
2μl 未酶解质粒
2μl10μl(~2r) 酶解质粒
2μl10μl(~2r)
7、将上面三管样品置震荡器上混匀,短暂离心。
8、用加样器吸取样品。依次分别加入三个点样孔中,注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中,不可刺穿凝胶,也要防止将样品溢出孔外。
9、接通电源,调节电压至50伏,电泳90分钟后,将凝胶板取出,在紫外灯下观察结果。
注:1、细菌噬菌体DNA全长49.01kb,其序列及酶切位点已研究清楚,它经不同的限制性内切酶消化后可产生不同的电泳带图谱。因为每条区带的DNA长度是已知的,所以被选为基因工程中常用的DNA分子大小标准,与其进行比较计算,即可得到待测DNA片段的长度,λDNA经HindⅢ消化后产生7条区带,依次为23.7;9.46;6.75;4.26;2.26;1.98;0.58(kb)。
2、溴化乙锭为一种有毒试剂,使用时一定要戴手套操作,注意防护。
【仪器与器材】
1、电泳仪
2、水平式核酸电泳槽
3、紫外灯
【试剂与材料】
1、琼脂糖
2、6×点样缓冲渡:0.25%溴酚兰、40%蔗糖
3、DNA分子量标准:λDNA分子量标准:λDNA/HindⅢ
4、50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升
242g Tris
57.1ml 冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
1×缓冲液浓度:0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA
5、0.8%琼脂糖:0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解
6、10mg/ml EB 1.0g 溴乙锭
100ml 三蒸水
【附 注】
影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素:
1、DNA分子的大小:线性DNA分子的迁移率与其分子 量的对数值成反比。
2、琼脂糖浓度:一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶浓度0.7
1.0
1.5
1.75
2.0 0.4可分辨的线性DNA片段大小(kb)琼脂糖凝胶浓度 0.8~10 0.4~6 0.2~4 0.2~3 0.1~3 5~60可分辨的线性DNA片段大小(kb)
3、DNA分子的形态:在同一浓度的琼脂糖凝胶中,超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快,线性DNA分子比开环DNA分子快。
4、电流强度:每厘米凝胶电压不超过5V,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。
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