实验二琼脂糖凝胶电泳实验

【实验目的】

（1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；

（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；

（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。

【实验原理】

琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：

       （1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 

       （2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。

        （3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

        （4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

        溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。

        常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。

【试剂与器材】

（一）材料

电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等

（二）试剂

1、 50?TAE(1000mL)：242g      Tris,

       57.1mL    冰醋酸，

       18.6g      EDTA。

2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。

3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、 RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。

5、 5?甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。

【操作方法】

（一）常规的水平式琼脂糖电泳

       制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：

                          琼脂糖的含量（%）                   分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
                                    0.3                                                              60-5
                                    0.6                                                              20-1
                                    0.7                                                              10-0.8
                                    0.9                                                               7-0.5
                                    1.2                                                               6-0.4
                                    1.5                                                               4-0.2
                                    2.0                                                               3-0.1

1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；

3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。

4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。  

（二） 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）

        配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。

        甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加热15min，迅速冰浴，加1μL上样缓冲液和0.2μL的EB。

        步骤：

        1． 用3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。

        2． 胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。

        3． 预电泳：1×甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。电压为5V/cm。

        4． 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。

        5． 观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。

【注意事项与提示】

（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。

（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA大部分已降解，则需重新制备。

【实验安排】

只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。

【实验报告要求与思考题】

1、附上电泳结果的图片并进行正确的标注（如下图）

M：1Kb DNA ladder；1：质粒DNA

2、琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

3、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？

电泳流程图：

 

第二篇：PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳讲义(工艺实验)

 t-PA基因的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验讲义

一、 实验目的

    1、掌握PCR反应的原理和方法；

    2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定DNA的原理和方法。

二、实验原理

    PCR原理：首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，然后在低温下与两个引物进行退火。使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合反应。每经过一次变性，退火，延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过约30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至10000000倍，由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA物增加一倍。

    变性（denaturation）：双链DNA在92－96℃变性成单链DNA。

    退火（annealing）：引物在45-72℃与模板的互补区域相结合。

    延伸（extension）：在72℃条件下DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3’-OH端，DNA链的延伸方向为5’-3’。

    DNA琼脂糖凝胶电泳原理：DNA分子在碱性环境中带负电荷，外加电场用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其由荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（EB）染色；在波长254nm紫外光照射下，DNA呈现橙红色荧光。

    琼脂糖凝胶电泳所需 DNA样品量仅为 0.5-0.1μg，溴乙锭检测 DNA，灵敏度很高，10mg或更少的DNA即可检出。

三、实验仪器

    超净工作台、回转式恒温调连摇瓶机、培养箱、冰箱、深冷冰箱（-70℃）、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、紫外凝胶成像系统、紫外分光光度计、恒温水浴锅、移液器、微波炉。

  四、实验药品

      蛋白陈、酵母粉、氯化钠、琼脂、氯仿、异戊醇、异丙醇、琼脂糖、饱和酚、氯化苄、CTAB、臭酚蓝、醋酸钠、DL2000Marker、TaqDNA聚合酶、Pfu酶、Dntp、Tris、HCl、Tris-HCl、葡萄糖、NaOH、乙醇、乙酸钾、冰乙酸、蔗糖、ddH₂O、EB、EDTA、SDS、引物。

五、实验内容

   本实验为综合性实验，主要从以下几方面开展。

1、设计PCR反应系统

  根据 PCR反应系统的组成和要求，设计 20μL或 50μL的反应体系，可以下表1提供的

50μL的PCR反应体系为参考。

                    

                         

表 1 PCR反应体系

2、进行PCR反应

   PCR反应过程学生自行设计，可参考下列提供的PCR反应条件：94℃，5 min（热启动）；94℃，1min（变性）；52℃，1min（退火）72℃1.5min（延伸）；循环30次；72℃，10min；保温湿度；4℃。

3、对PCR反应产物进行水平板琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定

    将PCR反应产物通过水平板球脂糖凝胶电泳进行分离和鉴定，琼脂级凝胶电泳的具体方法如下：

1）根据所需浓度称取一定量的琼脂糖。加入一定量的1×TAE或其它缓冲液，加热使琼脂糖溶解。

2）溶液冷至60℃时，若需要，则加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/mL（也可以在电泳之后再进行染色。）。

3）琼脂糖倒入制胶模具，凝胶厚度一般为0.3-0.5cm。迅速在模具一端插上梳子，检查有无气泡。

4）室温下放置30-45min后，琼脂糖溶液完全凝固，小心取出梳子将凝胶放置于电泳槽中。

5）加入电泳缓冲液至电泳槽中，让液面高于胶面1mm，凝胶两端的电压与外加电压相等。

6）在DNA样品中加入1／6的上样缓冲液，混匀后，离心聚集液体，使溶液全部汇集于管底部，用移液枪将加样混和液加入样品孔中。

7）接通电泳槽与电泳仪的电源，电压降选择l～5V／cm。

8）根据指示剂迁移的位置来断定是否终止电泳，切断电源后再取出凝胶，未加EB的凝胶需要在含有 EB的缓冲液中浸泡约 20～25min。

9）取凝胶在凝胶成像系统中检测电泳结果。

   t-PA是组织型纤溶酶原激活剂，由527个氨基酸组成。t-PA cDNA大小约1．6kb。

六、实验结果的讨论

1、PCR反应的原理是什么？影响PCR反应的主要因素是什么？

2、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？如何选择琼脂糖凝胶的浓度？EB的作用是什么？