实验三 琼脂糖凝胶电泳技术

［实验目的］通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

［实验原理］DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称 CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。

[仪器、材料与试剂]

一、仪器

1.恒温培养箱

2.琼脂糖凝胶电泳系统

3.台式离心机

4.高压灭菌锅

5.紫外线透射仪

二、材料

1.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

2.硼酸

3.乙二胺四乙酸(EDTA)

4.溴酚蓝

5.蔗糖

6.琼脂糖

7.溴化乙锭

8.DNA marker

[实验步骤]

(一) 制备琼脂糖凝胶

电泳槽及用胶量：称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化取出摇匀，则为1%的琼脂糖凝胶液。

冷却至60℃, 加入适量EB, 混匀。

（二）胶板的制备

1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。

2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐

3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4. 待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。

5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三）加样, 用移液器将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。

（四）电泳

1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。

2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。

（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。

问题讨论

1）在细胞内质粒DNA是共价闭环DNA（covalently closed circular DN A，cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA（open circular

DNA，ocDNA）；若两条链在同一处或其附近断裂，则变成性状D N A分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：cccDNA＞直线DNA＞ocDNA，因此在本次实验中琼脂糖凝胶电泳上的自制质粒呈现3条带。如果你不小心在溶液II（实验二）加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。

2）琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基质，其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在这种基质中。于电场的作用下向阳极移动。核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：①DN A的分子大小；②琼脂糖的浓度；③DNA的构象；④所加电压；⑤电场方向；⑥碱基组成与温度；⑦嵌入的染料；⑧电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影响是：一定大小的DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同；在一定浓度的琼脂糖凝胶能够分辨的核酸片段大小范围内，核酸片段的迁移率与其相对分子质量大小相反。

3）溴化乙啶的化学名称是3， 8－二氨基r－乙基－6一苯基菲锭溴盐（3，S－diamino－5－ethyl－6－phenyl－phenanthridinium bromide，简称EthidiumBromide或EB或EtBr），由于溴化乙锭分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔黄色的荧光，便于检测。EB能插人DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA结合（超螺旋DNA与EB结合能力小于双链闭环，而双链闭环DNA与EB结合能力小于线状双链DNA），DNA所吸收的260nm的紫外光（UV）传递给FE，或者结合的EB本身在3O0nm和360nm吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以590nm波长发射出来。EB染色具有以下特点：①操作简便快速，室温下染色15mm～20mm；②不会使核酸断裂；③灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；④可以加到样品中，随时用紫外吸收追踪检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶（或一次性塑料）手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上。凡是沾污溴化乙啶的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或弃去。

 

第二篇：琼脂糖凝胶电泳实验

 琼脂糖凝胶电泳实验
20##-11-03 09:43:56   来源：生物秀   评论：0   我要评论

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凝胶加样缓冲液

    使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品密度；以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利，含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速 率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%～1.4%的范围内，这些对应 关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。