Western blot 详细步骤

1、 按厂商的说明安装两套灌胶装置。

2、 Histone H3 的分子量为15.4kD，故分离胶浓度为15％，按下表配制10ml：

水 2.3ml

30%丙稀酰胺混合液 5.0ml

4×分离胶缓冲液 2.5ml

10％过硫酸铵 0.1ml

TEMED 0.004ml

3、 迅速混合均匀后，灌胶两块，至适当高度。

4、 以水饱和正丁醇封盖。

5、 室温下聚合（约需30分钟）。

6、 倾去覆盖层，以去离子水轻洗，倾去水，以纸巾小心吸去剩余的水。于界面上用marker笔做好标记。

7、 按下表配制5％积层胶 4ml：

水 2.7ml

30%丙稀酰胺混合液 0.67ml

4×积层胶缓冲液 0.5ml

10％过硫酸铵 0.04ml

TEMED 0.004ml

8、 迅速混匀，加到聚合好的分离胶上，直至加满并排出气泡。分别插入洗净的梳子。室温下聚合。

9、 将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，梳子朝内。

10、 将10×电泳缓冲液以去离子水稀释10倍，需700ml。

11、 将电泳缓冲液从两块胶之间的凹槽中慢慢加入。

12、 将marker 及样品水浴煮沸5分钟，上样（尽量使用中间的泳道，未使用的以1×loading buffer 补上），每孔上样15微升。

13、 接好电源，黑对黑，红对红，积层胶电压为80V。

14、 待溴酚兰跑至分界处，将电压调为120V。

15、 继续电泳，待溴酚兰刚跑出胶时，终止电泳。

16、 小心取下两块胶，其中一块以考马斯亮兰染色。以记号笔在玻璃板上画好标记线，依线小心切去积层胶及两边未加样泳道，并在凝胶底部最靠近左边（第一个上样槽）切去一角，以示电泳方向及加样方向。

17、 同法操作另一块胶（以记号笔在玻璃板上画好标记线，小心切去积层胶及两边未加样泳道，并在凝胶底部最靠近左边（第一个上样槽）切去一角，以示电泳方向及加样方向）。以做western blot。

18、 剪下同样大小的0.2μM 的PVDF膜（蛋白分子量大的话，可用0.45的膜），以甲醇浸泡3分钟。后水洗2分钟。

19、 剪下6张同样大小的whatman纸，与PVDF膜、胶同时以转移缓冲液平衡15分钟。

20、 按转膜装置的说明放置纸、膜、胶、纸（由下往上），转膜电流为0.65 mA/cm2 （经验，蛋白不同所需电流不同），时间约需1.5至2小时。放置时一定要排除气泡，特别是膜与纸、胶与膜、纸与胶之间。

21、 转完后，取出膜，在与胶相同的位置小心剪去一角，标示电泳方向及吸附有蛋白的

膜面。

22、 将转有蛋白的膜用丽春红染色10分钟，标示分子量Marker。

23、 水脱色10分钟。

24、 根据Marker判断β－actin及目的蛋白所在位置，小心剪开。

25、 以5％脱脂奶粉封室温振摇封闭膜1小时。

26、 以1×TBS洗膜三次。

27、 一抗用TBS以1：1000稀释（一般1ml），于杂交袋中加于转有蛋白的膜面，冰箱

孵育过夜。

28、 以1×TBS洗膜三次，每次10分钟。

29、 二抗（碱性磷酸酶标记抗兔IgG）用TBS以1：100稀释（一般1ml），于杂交袋中

加于转有蛋白的膜面，室温孵育2小时。

30、 以1×TBS洗膜三次，每次10分钟。

31、 加入4ml 碱性磷酸酶缓冲液，再加入23微升NBT,13微升BCIP，暗处显色。

32、 以水终止显色。

注：以辣根显色比以碱磷酶显色灵敏度高的多，但需事先联系好凝胶成像仪以照相。故一般事先以辣根显色摸好条件，确定条件后再以辣根显色并成像。

 

第二篇：western blot超详细步骤

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Western印迹法

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转

移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯

亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器

材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 30.29g

蒸馏水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌

后室温下保存。

PH HCl

7.4 约17ml

7.5 约16m

7.6 约15ml

8.0 约10ml

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF

PMSF 0.174g

异丙醇 100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。

0.2mol/L NaH2PO4

NaH2PO4（MW119.98） 12g

蒸馏水至 500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4

Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） 71.6g

蒸馏水至 1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS

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SDS 10g

蒸馏水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺 0.1g

超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8）

Tris (MW121.14) 45.43g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8）

Tris (MW121.14) 15.14g

超纯水 200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：1）

丙稀酰胺（Acr） 37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g

超纯水至 100ml

37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20

Tween20 20ml

蒸馏水至 100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100μg/ml PMSF）：

1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml

NaCl 0.438g

TritonX－100 0.5ml

蒸馏水至 50ml

混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。

0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）

0.2 mol/L NaH2PO4 19ml

0.2 mol/L Na2HPO4 81ml

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NaCl 17g

蒸馏水至 2000ml

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250： 100mg

95％乙醇： 50ml

磷酸： 100ml

蒸馏水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15 mol/L NaCl

NaCl（MW58.44） 0.877g

蒸馏水至 100 ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）

BSA 0.1g

0.15 mol/L NaCl 1ml

溶解后，－20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml） 4％浓缩胶（两块胶，5ml） 超纯水 4.85ml 3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：1） 2.5ml 0.5ml

1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 2.5ml －

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 1.26ml 10％SDS 100 μl 50 μl

10%AP（过硫酸胺） 50 μl 25 μl

TEMED 5 μl 5 μl

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris·HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）

0.5 mol/L Tris·HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）

Tris（MW121.14） 3.03g

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甘氨酸（MW75.07） 18.77g

SDS 1g

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）

甘氨酸（MW75.07） 2.9g

Tris（MW121.14） 5.8g

SDS 0.37g

甲醇 200ml

蒸馏水至 1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10X丽春红染液

丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

蒸馏水至 100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液（100mmol/ L Tris·HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）

1 mol/ LTris·HCl（pH7.5） 10ml

NaCl 8.8g

蒸馏水至 1000ml

TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20 1.65ml

TBS 700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g

TBST 100ml

溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris·HCl pH6.8）

14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 μl（通风厨里加）

SDS 2g

0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） 12.5ml

超纯水至 100ml

配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。

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显影液（5X）

自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g

碳酸钠（无水） 33.75g

溴化钾 20.95g

补水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用自来水稀释至1倍。

定影液

自来水（50～60℃） 700ml （以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠 240g

亚硫酸钠（无水） 15g

冰乙酸 12.6ml

硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存

抗体

用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml

化学发光试剂

购自北京中山公司，为Santa Cruz产品，分A和B两种试剂。

操作步骤：

（一） 蛋白样品制备

（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一

会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗

涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将

PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、 按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶

时才可与裂解液混合。）

4、 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解

培养瓶要经常来回摇动。

5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将

细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

6、 于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）

7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2） 组织中总蛋白的提取：

1、 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪

碎。

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2、 加400 μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰

上。

3、 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下

12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液

中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上

清后用PBS重复洗涤一次。

3、 用枪洗干上清后，加100 μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中

要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装

于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二） 蛋白含量的测定

（1） 制作标准曲线

1、 从－20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2、 取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，

20.0μg ，40.0μg。 3、 按下表在各管中加入各种试剂。

1mg/ml BSA

0.15mol/L NaCl

G250考马斯亮蓝溶液 0μμμμμμg － 2.5μμμμμl 100μμμμμμl

4、 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）

上比色分析。

5、

（2） 检测样品蛋白含量

1、 取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置

30min后即可用于测蛋白。

2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可做为空白

样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白样品，混

匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（三） SDS－PAGE电泳

（1） 清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再电话：021-51320182 0571-56807986 E-mail:river@

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用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2） 灌胶与上样

1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要

使两玻璃对齐，以免漏胶。）

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，

可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面

快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才

不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）

3、 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固

就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空

间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以

免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收

缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经

常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻

轻将其拔出。

5、 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板

面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向

外。）

6、 测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样

品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总

体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。）上样前要将样

品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7、 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）

用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插

至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也

可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤

3次，以免交叉污染。

（3） 电泳

电泳时间一般4～5 h，电压为40V较好，也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

（四） 转膜

（1） 转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。切

滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜

置于水上浸2 h才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，

要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和

浸过的膜。

（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以

擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫

三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去

其中的气泡。

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（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3

张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作

在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会

发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电

转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2 h或40V转移

3 h。

（6） 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染

上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。

（五） 免疫反应

（1） 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇

动封闭1h。

（2） 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿

保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到

保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗

体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室

温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3） 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温

下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光

反应。

（六） 化学发光，显影，定影

（1） 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混

合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-

光片夹中。

（2） 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，

用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－

光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号

的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，

以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中

显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1～2min（20～25

℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-

光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲

去残留的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七） 凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

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Western blot analysis-1 Cells were cultured in 199 medium with 10% fetal bovine serum. After digestion with 0.25%trypsin and 0.2%EDTA, the cells were collected and were washed three times with ice-cold PBS, then were lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), the protein concentration of lysates was meatured by Bradford method. 50μg proteins of different groups boiled for 5 min in sample buffer and were separated in 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Nonspecific reactivity was blocked by incubation overnight at 4℃ in buffer(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 2%Tween-20, 4% bovine sreum albumin).The membrane was then incubated with primary antibody. The secondary antibody was used to detected bound primary antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Amersham pharmacia biotech).

Western blot analysis-2 The protein expression ezrin was detected by Western blot method. Confluent 150 cm2 flasks of cells were washed three times with ice-cold PBS, then lysed in buffer(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100) for 30 min at ice. After removal of cell debris by centrifugation(12,000g,5 min), 50μg of each lysate sample was boiled for 5 min in sample buffer and were separated by 10% SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membrane (Pall Corporation). Nonspecific reactivity was blocked in 5% nonfat dry milk in TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20) for 1h at room temperature. The membrane was then incubated with monoclonal antibody of mouse anti human ezrin p81(Maixin-Bio) followed by reaction with anti-mouse IgG-HRP antibody. Reactive protein was detected by ECL chemiluminescence system (Santa Cruz).

ezrin蛋白表达通过Western blot进行检测。已达融合生长的单层细胞用冷PBS洗三次后，加入裂解液(50mM Tris-HCl, pH8.0,150mM NaCl, 100μg/ml PMSF, 1%TritonX-100)冰上裂解30min，12,000g,5 min离心去除细胞碎片后，取50μg样品与上样缓冲液混合，煮沸5min，进行10% SDS-PAGE电泳，转硝酸纤维素膜(Pall Corporation)。将膜在含5%脱脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)中室温下封闭1h，随后加入鼠抗人ezrin一抗(Maixin-Bio)，抗鼠IgG-HRP二抗，ECL化学发光试剂检测(Santa Cruz)。 电话：021-51320182 0571-56807986 E-mail:river@