院系：理学院      专业：农药学      学号：09310110020     姓名：王熠

实验三：血浆蛋白结合率的测定

1、实验目的

测定磺胺嘧啶钠在不同动物体内的血浆蛋白结合率。

2、实验原理

将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。

具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，与经过同样处理的磺胺药标准液比较，用721分光光度计比色法测出组织中和不同时间的血液中磺胺嘧啶浓度。

由于亚硝酸不稳定，在实验中，用三氯醋酸与亚硝酸钠反应制的得。

剩余的过量亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。

3、实验材料

1、实验动物

兔子一只。

2、设备与器械

712分光光度计、 管状半透膜（周长5cm，长约12cm）、 丝线 、广口瓶 、 移液器。

3、药物与试剂

    10%磺胺嘧啶钠注射液

15%三氯醋酸溶液

0.1%亚硝酸钠溶液

0.5%氨基磺酸胺溶液

0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液

磺胺嘧啶钠贮存标准液

磺胺嘧啶钠应用标准液

4、试验方法

1、试剂的制备

0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液：0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存

透析液（PBS）：pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液，内含0.15M NaCl

磺胺嘧啶钠应用标准液：10%磺胺嘧啶钠注射液3.75μl溶于约80ml3%三氯醋酸溶液再定容于100ml容量瓶中备用

2、血浆制备

兔心脏采血，肝素抗凝，以3000rpm离心10min，取上清液即为血浆。

3、透析

将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端，袋口不得污染血浆。将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面，加0.05mg/ml的磺胺嘧啶钠溶液0.5ml于各瓶袋外透析液中。置广口瓶于冰箱中，平衡透析约60h左右。吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，无浑浊，说明无血浆蛋白漏出。取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。

4、用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度。

取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤，取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管；取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管；取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管，在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min，各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放置2min ，各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混匀，放置10min，用721分光光度计在550nm波长处比色：以空白管校正光密度到0点，读取标准管和测定管光密度，并用公式计算：

测定管光密度

游离磺胺药含量 （mg%）= —————— × 应用标准液浓度×样品稀释倍数       

                         标准管光密度  

5、计算血浆蛋白结合率。

        Dt - Df

fb= --------------×100%

          Dt

fb：血浆蛋白结合率；

Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）；

Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度）

五、实验结果

1、结果记录

                    表一：标准管和测定管光密度的测定结果

2、游离磺胺药含量的计算

计算得：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml

        透析袋外药物浓度=0.00039mg/ml

3、药物血浆蛋白结合率的计算结果：

兔：fb=88.9%

六、结果讨论与总结

1、分光光度计的使用操作。

   由于应该使用一套比色杯来测定吸光度，而在实际操作中比色杯使用混乱，而且并没有做到严格的润洗，所以吸光度的测量存在较大的误差。

分光光度计的使用应该注意的事项：

（1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。

（2）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

（3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。

（4）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。

（5）在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。

2、总结

动物的种属、生理病理状态、个体差异可以影响血浆蛋白结合率。理论上当蛋白浓度足够高时所有与蛋白作用的药物都能被结合。但实际情况下，当亲和力较低时不可能达到这种所谓的足够高的蛋白浓度。蛋白浓度一定时，一定范围内当药物浓度增加结合的药量会随之增加，但结合分数降低。相反，当药物浓度下降时，结合分数增加并逐渐趋向于一个最大值, ，因此不同药物在低浓度时的最大结合率各不相同。平衡透析法是一种相对简单不需要复杂设备的可行性强的操作方法。

实验过程中所用三角瓶、移液管、试管等并没有经过彻底清洗会对实验结果造成影响，不同的动物种类以及相同的动物的个体差异会对实验结果造成影响，还有操作人员的失误也会对实验结果造成影响，药物浓度和血浆蛋白浓度对结合率都有影响。在报导血浆蛋白结合率时，必须同时注明实验过程中所用的药物浓度和蛋白浓度。

 

第二篇：实验二 药物血浆蛋白结合率测定

实验二 药物血浆蛋白结合率测定

前 言：药物血浆蛋白结合率是药物与血浆蛋白结合的量占药物总浓度的百分率，是药物代谢动力学的重要参数之一。它影响药物在体内的分布、代谢与排泄，从而影响其作用强度和时间，并往往与药物的相互作用及作用机制等密切相关。研究药物血浆蛋白结合率的方法包括常规的平衡透析法、超滤法、超速离心法、凝胶过滤法、分配平衡法、稳定同位素-GC-MS法、光谱技术等。本实验主要通过采用平衡透析法对药物血浆蛋白结合率进行测定，对于新药研究开发和指导临床合理用药都具有重要意义。

关键词：血浆蛋白结合率 平衡透析法 磺胺嘧啶

【实验原理】平衡透析法的基本原理是将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。再用重氮化偶合比色测定法对磺胺药的含量进行测定。其测定原理是具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中重氮化后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，再与同样处理的磺胺药标准液比较，即可求得剩余的亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。

【材料与试剂】

1. 药物 10%磺胺嘧啶钠注射液

2. 试剂

15%三氯醋酸溶液 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 磺胺嘧啶钠贮存标准液 磺胺嘧啶钠应用标准液(3.75ug/ml)

3. 透析液

pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液，内含0.15M NaCl

4. 鸡、兔各3只

5. 管状半透膜 周长5cm，长约12cm

【试剂的配制】

1. 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液

0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再 用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存

2. 贮存标准液

取标准品0.125g溶于蒸馏水中，并稀释至1000mL。如不溶于水，可先溶于0.1 mol/L氢氧化钠25mL中，再加4mol/L硫酸175 mL，用蒸馏水稀释至1000mL。

3. 应用标准液

精确吸取贮存标准液3mL，置100 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至刻度。(本实验是用10%磺胺嘧啶钠注射液进行标准液的配制：即吸取3.75ul的10%磺胺嘧啶钠注射液置于100 mL容量瓶中，用3%三氯醋酸稀释至刻度。)

【操作步骤】

1. 血浆的制备：兔心脏采血，鸡翼静脉采血，肝素抗凝，以3000rpm离心10min，

上清液即为血浆。

2. 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内 外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端。注意：袋口不得污染血浆。

3. 将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面

4. 加2.0ml透析液代替血浆于半透膜袋内，作平衡时间对照样品，以确定药物从袋内外自由扩散达到平衡所需时间。

5. 加所试磺胺药溶液0.25ml于各瓶袋外透析液中。注意：容积越小越好，以免影响透析液的组成

6. 置广口瓶于冰箱中，平衡透析时间约需60h左右。

7. 待透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出。如检查为阳性，则该样品作废。

8. 取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。

9. 用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度

1）取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤。

取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管。

取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管。

取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管。

2）在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min。

3）各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放置2min。

4） 各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混匀，放置10min。

5）用721分光光度计在550nm波长处比色

以空白管校正光密度到0点，读取标准管和测定管光密度，计算游离磺胺 药物含量

10. 计算血浆蛋白结合率

计算公式

测定管光密度

游离磺胺药含量（mg%）

标准管光密度 Dt?Dffb??100%Dt

fb：血浆蛋白结合率；

Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）；

Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药)；

【实验结果与分析】

1.由于实验过程中鸡和兔的采血量分别有限，所以每人只做了一种血样。本人开始做的是兔的血样，磺胺药物浓度为0.025M，但在透析平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，检查有白色沉淀析出，则说明有血浆蛋白漏出，所以该样品作废。分析原因有以下几点：

1）装透析液的广口瓶不干净，造成污染。

2）用于给袋外透析液加入磺胺药溶液的注射器不干净，前面实验可能吸入过血样，造成后面的蛋白沉淀。

3）在打开半透膜的过程中，对膜内侧造成了污染。

2.由于第四组多了一个药物浓度为0.00625M的鸡的血样，所以透析平衡后的实验步骤就做的是这个样品的。实验结果如下：

1）经测定，

a.标准管光密度为0.415；

b.测定管光密度（半透膜内溶液）三次平行分别为0.008、0.005、0.008则,测定 管光密度（内）为0.008+0.005+0.008/3=0.007；

c.测定管光密度（膜外溶液）三次平行分别为0.003、0.003、0.004，则测定管光密度（外）为0.003+0.003+0.004/3=0.0033；

d.应用标准液浓度为3.75ug/ml，换算成0.375mg/100ml；

e.样品稀释倍数为40倍。

2）则计算结果如下： 0.007

膜内磺胺药含量（mg%）= × 0.375mg/100ml×40= 0.253%;

0.415

0.0033

膜外游离磺胺药含量（mg%）× 0.375mg/100ml×40= 0.119%； 0.415

0.253%—0.119%

Dt?Dffb??100%= × 100%=52.96%; Dt

0.253%

【讨论】

该实验采用平衡透析法进行测定，平衡透析法基于药物结合的平衡原理，是测定药物游离浓度最常用的方法。该法具有简单、经济、受实验因素的干扰小等优点，是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法，但该法也存在一定的缺点：

1) 透析平衡时间较长；

2 ) 血浆和缓冲液的PH值以及离子强度必须严格控制；

3）受稀释作用以及体积迁移效应的影响；

4）非特异性的透析设备表面的药物吸附效应。

同时，实验温度影响也很大，一般都在37度,空气浴中震荡加速平衡。如果药物不稳定，可以采用低温或加入适量的稳定剂。透析时间的确定，可以做对照实验，用血浆代替同体积的缓冲液,测定袋内外达平衡时的时间。

但是该实验的最终结果测出的结合率偏大，在实验过程中可能有以上分析的原因造成的误差，同时，在实验过程中应该注意以下几点：

1）采血过程中注意抗凝的处理；

2）实验过程中注意每个仪器的清洁问题，以免造成污染；

3）用线扎半透膜的时候注意两头扎紧，以免膜内溶液外泄；

4）在将半透膜浸入透析液的时候注意将膜内空气排净，以免在浸入时候导致膜内溶液不能完全浸入透析液中，造成实验误差；

5）在配制药物过程中浓度一定要计算准确，严格按照操作步骤进行。