实验七 植物基因组 DNA 的快速提取

一、实验目的

1、学会并掌握微量移液器的使用。

2、熟练操作2×CTAB法提取植物基因组DNA。

二、 实验原理

采用机械研磨的方法在液氮中破碎植物组织和细胞，，由于植物细胞菌含有多种酶（尤其是氧化酶）对DNA的抽提产生不利影响，因此在CTAB中加入抗氧化剂（如β-巯基乙醇），降低这些酶的活性。CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂24:1（氯仿：异戊醇）抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

三、实验仪器及药品耗材

1、主要仪器：冷冻离心机、冰箱、移液器、水浴锅、摇床、研钵、剪刀和离心机等。

2、主要药品及耗材：一次性手套、5 ml 离心管、5 ml 离心管、移液器吸头、无菌水、CTAB、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、TE缓冲液、a-巯基乙醇、Tris-Hcl、EDTA、NaCL和液氮等。

3、材料：玉米幼苗。

四、实验步骤

1.取样

取玉米幼苗

2.研磨

叶片用剪刀剪碎，用液氨研磨成粉状（磨得越细提取DNA效果越好） 备注：研磨整个过程一定要迅速，且最终粉末要干燥

3.裂解

将2-3ml粉末转移至5ml离心管中，加入2ml 2×CTAB（500ml CTAB加

1ml β-巯基乙醇，β-巯基乙醇现用现加），摇匀后在65℃水浴中温浴40～50min，期间轻摇几次。

4.杂质的提取

然后向离心管中加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻摇10min，至管中溶液分层，1000 r/min离心10min,取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻摇10min左右，至管中溶液分层，1000r/min离心10min，取上清液。

5.DNA的沉淀

最后加入等体积冷的异丙醇（或乙醇），轻轻晃动或放入-20℃冰箱待出现絮状DNA沉淀（若没有或很少沉淀，可以通过离心使DNA析出，但离心得到的DNA会有很多杂质）

注意：（1）移液枪的使用：轻拿轻用，勿用力过猛。

（2）取上清液，第一次可以粗取，但第二次取一定要小心，避免把下面的杂质吸入，导致实验失败。

6、DNA的挑取

用一次性注射器针筒钩出絮状沉淀至1.5ml离心管中。

7、DNA的纯化

加150-200nl 70%乙醇洗涤2次，再用无水乙醇洗涤1次，每次至少5min

8、DNA的干燥

尽量倒去无水乙醇，然后将DNA放于通风干燥处自然风干。

注意：1、洗涤DNA需讲究方法：不能直接将乙醇倒出，而是折叠几层吸水纸，然后缓慢从离心管中倒出乙醇，千万注意不能把DNA沉淀一并倒出。DNA风干时，必须关闭窗户，以免风过大将DNA吹走。

9、DNA溶解

在干燥DNA中加入200ul TE缓冲液，冰箱冷却（-4℃），震荡机摇动形成DNA液。

 

第二篇：植物基因组DNA的提取

一、实验目的

通过采用改进的SDS法提取植物叶片基因组DNA，使学生学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法和原理。

二、实验原理

基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交、RFLP、PCR分离基因和分子标记分析等。利用基因组DNA序列较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，大分子的基因组DNA形成沉淀，而小分子DNA则附于管壁及管底,通过离心方法即可将它们分离，从而达到提取的目的。在提取过程中，若操控不当，基因组DNA会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓等，以保证得到较完整的基因组DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时可参照文献和经验建立相应的实验方法, 以获得可用的DNA大分子。组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。

三、实验仪器和材料

四、实验试剂

1.     DNA提取洗涤液100 mmol／L Tris?HCl(pH8.0)，3％可溶性PVP，20 mmol／L 巯基乙醇，20 mmol／L EDTA(pH8.0))

2.     DNA裂解液(100 mmol／L Tris?HCl(pH8.0)，20 mmol／L EDTA(pH8.0)，500 mmol／L NaC1，1.5％SDS)

3.     酚/氯仿/异戊醇(v:v:v=25:24:1)

4.     5M KAc

5.     无水乙醇

6.     异丙醇

7.     70%乙醇

8.     含5g/ml RNase 的TE缓冲液

五、基本操作与仪器介绍

1、琼脂糖凝胶电泳技术

琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭（EB）或其它染料结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此分析实验结果。

操作步骤如下：

1.     水平放置凝胶成形模具，插上梳子。

2.     称取DNA电泳用琼脂糖0.6g放入250ml的三角烧杯中，加入50ml 0.5×TBE缓冲液，摇匀后将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。

3.     关闭电炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右（手握烧瓶可以耐受），再加入3μL荧光染料，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。

4.     室温下待凝胶完全凝固（需时约30-60 min），轻轻拔出梳子，将胶板放入电泳槽中。

5.     电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。

6.     吸取经溴酚兰染色的样品，加入点样孔中。

7.     接通电源，调节电压至100伏，待溴酚兰条带距凝胶前端2 cm时关闭电源。将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果、记录数据和拍照。

注：

影响DAN片段琼脂糖电泳的几个因素：

（1）DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。

（2）琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。

（3）DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。

（4）电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。

2、移液枪的使用

（1）吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。

（2）为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。

（3）浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。

（4）可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1ml 蒸馏水20℃时重0.9982g。

（5）使用时避免倒转移液器，避免液体进入枪体内。使用完后，及时将枪头移除置烧杯中，将移液枪挂在移液枪架上，切不可平放。

（6）不可使用对枪体有腐蚀性的液体。

3、数码凝胶成像系统的使用

（1）根据需求选择不同的底座（蛋白摄像需采用白光底座，核酸摄像需采用紫外底座）。

（2）打开所有仪器的电源。

（3）打开电脑操作系统，双击GIS进入图像处理系统。

（4）打开暗箱，放入凝胶。

（5）打开白光光源，调整凝胶位置，调节焦距，调节凝胶放大倍数。

（6）关闭白光灯源，打开紫外光源，可见EB荧光谱带，可通过“增大”和“变小”功能调节光圈，用“聚焦”和“散焦”调节聚焦能力，或上下拉动下方的亮度和对比度标尺进行调节图像清晰。

（7）调节好亮度和对比度后，单击“拍摄”，拉动标尺调节曝光时间，单击小对话框的拍摄照相，然后单击“退出”完成拍摄同时关闭紫外光源。保存图像。

（8）关闭成像系统。

（9）取出凝胶，清理箱体。

（10）进行图片处理与标记，打印图片（图片剪下后，贴到报告纸上）。

六、实验步骤

1.     取指甲大小的植物叶片，置于研钵中，加入适量液氮，用研棒磨成粉未（越细越好）。

2.     将粉末移入1.5 ml离心管，加入DNA提取洗涤液1.5 ml，轻轻颠倒混匀。

3.     8000 rpm离心10 min，弃上清，加入洗涤液1 ml，混匀，8000 rpm离心10 min，弃上清，共洗涤2遍。

4.     加入预热的DNA裂解液500 μL，用牙签轻轻搅拌均匀，置65℃水浴30 min。

5.     水浴后立即加入苯酚/氯仿/异戊醇500 μL，颠倒数次，这时溶液变为乳白色，10000 rpm离心5 min，取上清液至新的1.5 ml离心管中。

6.     加入55 μL醋酸钾，颠倒混匀，10000 rpm离心10 min，取上层清液转移至新的1.5 ml离心管中。

7.     加入异丙醇300 μL，室温30 min或-20℃放置2 hr，12000 rpm离心10 min，弃上清，取沉淀，加入500μL 70%乙醇，室温放置2 min，12000 rpm离心5 min，弃上清，取沉淀。

8.     加入30 μL含5 g/ml RNase 的TE缓冲液，37℃水浴放置1hr。

9.     离心30 s后，取10 μL于0.8% 琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

七、结果分析

1.     完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带，若降解则成为弥散状，电泳前缘为未除干净的RNA。

2.     如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状，说明DNA含有较多的多糖类物质，可以在取材前将植物放暗处24hr，以达到去除淀粉的目的。

3.     DNA沉淀呈棕色。植物材料含有大量酚类化合物，与DNA共价结合，使DNA呈棕色，并可抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现，可加入2-5%的巯基乙醇，或者加入亚精胺(100μL DNA加5μL  0.1mol/L的亚精胺）。

4.     DNA中含有多糖或盐类。将DNA用100%乙醇或异丙醇沉淀出来，离心，沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次，吹干后重溶于TE中。（注意乙醇一定要吹干，否则电泳点样时，样品上漂）

5.     DNA已降解电泳条带呈弥散状。样品降解可能有两种情况：一是机械振动过剧烈，二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡，提取液及用品要高温高压灭菌。另外，避免反复冻融DNA。

实验注意事项

1.     注意移液枪的使用规范，爱护好每一把移液枪。

2.     注意数码凝胶成像系统的规范。

3.     注意荧光染料的使用及安全，不能随意丢弃含有荧光染料的胶块。

4.     实验室保持安静，不得大声喧哗。

5.     实验结束后，搞好实验台、水槽、地面等的卫生。

6.     液氮使用时，不要接触到皮肤，以免冻伤。

7.     叶片磨得越细越好。

8.     由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。