实验三、质粒DNA的提取和电泳

一、实验目的

学习和掌握碱裂解法提取质粒；学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的方法和技术。

二、实验原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那木迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称

CCCDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，（open circular DNA， 简称OCDNA）；线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。

三、主要试剂

1． 溶液Ⅰ

50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0)

10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）

2． 溶液 Ⅱ

0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH 母液稀释）， 1% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）

3． 溶液 Ⅲ

5 mol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

5. RNaseA

将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成

10 mg／ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。

7. LB+Amp培养基：LB液体培养基内加入100ug/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温

分解，待培养基温度低于60℃时加入。

8. 50 x TAE：

Tris 242g

冰乙酸 57.1ml

0.5 mol/L EDTA 100 ml

pH 8.0

9. 1%琼脂糖凝胶：

称0.3g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。

10. 10X Loading buffer

四、仪器耗材

恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉。

五、实验步骤

（一）细菌的培养

将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落。（37℃培养过夜）

(二) 质粒提取

1. 将2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质

粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。

2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。

3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4. 将细菌沉淀悬浮于100 uL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5-10 min。

5. 加200 uL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物(勿剧烈震荡)，将离心管

放冰上5 min 。

6. 加入150 uL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置

5 min 。

7. 12000 r/min ，离心15 min ，将上清转至另一离心管中。

8. 向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，

将上清转移到另一离心管中。

9. 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min。12000r/min离心

10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10. 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气

中干燥。

11. 加入适量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，

－20℃保存。

(三)琼脂糖电泳检测

将样品5uL与上样缓冲液0.5 uL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker。120v电泳大约20-30min。

六、作业

1、分析电泳图谱。

2、提取过程中，加入酚:氯仿:异戊醇的目的是什么？

3、如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动，你认为可能是什么原因？

 

第二篇：实验一 质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测

实验一 质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测

一、实验目的

1．掌握质粒DNA的制备的原理和方法

2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离

二、实验原理

1．质粒DNA的制备方法

质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。

2．碱裂解法

质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。

碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾缓冲液时，pH恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，就可去除染色体DNA和蛋白质-SDS复合物等物质，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，乙醇或异丙醇沉淀就可得到纯的质粒DNA，之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。

3．质粒琼脂糖凝胶电泳分离

琼脂糖凝胶电泳技术（agarose gel electrophoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)；开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂(open circular DNA , OCDNA)和线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂(linear DNA, LDNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

三、仪器及试剂

1．仪器及耗材：冷冻离心机、微量移液器、1.5ml EP管、枪头、凝胶槽、电泳仪等。

2．试剂及配制：

溶液Ⅰ（GET缓冲液）：25 mmol/LTris-HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA，50 mmol/L葡萄糖，pH8.0

溶液II（变性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS

配制：1 ml

10% SDS 50 μl

1N NaOH 200 μl

取以上溶液，用灭菌去离子水定容至1ml，充分混匀，现用现配。

溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸

配制：100 ml

醋酸钾 29.4g

冰醋酸 11.5 ml

加入60 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至100 ml。高温高压灭菌后，4℃保存。

其它试剂：TE（pH8.0）、饱和酚、酚/氯仿（25：24）、无水乙醇、70％乙醇、电泳缓冲液、6×上样缓冲液

四、实验步骤

1．接种细菌于LB液体培养基中，37℃培养过夜（E coli. Top10, pUC19质粒）；

2．取细菌悬液1mL于1.5mLEP管中，4000 rpm/min，离心2min；

3．弃上清，加入100μl溶液Ⅰ；

4．加入200μl溶液II ，颠倒混匀，静置2min；

5．加入150μl溶液III，颠倒混匀，静置5min；

6．4℃，12000 rpm/min，离心10min；

7．取400μl上清移入另一EP管，加等体积饱和酚，振荡混匀，12000 rpm/min，离心10min；

8．取约300μl上层水相移入另一EP管，加等体积酚/氯仿，振荡混匀，12000 rpm/min，离心10min；

9．取200μl上层水相移入另一EP管，加2倍体积无水乙醇，混匀置-20℃1.5小时，沉淀DNA；

10．12000 rpm/min，离心10min，弃上清，加入1mL70%乙醇洗涤DNA沉淀，小心吸弃乙醇；

11．开盖放置5 min干燥DNA，加入15μl TE溶解DNA；

12．加入3μl 6×上样缓冲液，混匀，18μl分两次上样于1%琼脂糖凝胶电泳；

13．上样9μl DNA marker。

14．150V, 60min，紫外灯下观察结果。

五、结果与讨论

1．质粒电泳结果

质粒DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中，被染成橘黄色。如下图所示，质粒DNA可以观察到3条带，电泳速度最慢的条带显色最浅。质粒DNA有3种构型，即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒 (OCDNA)和线状质粒DNA (LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。本次实验的结果中的三条带，也可推测为：超螺旋质粒DNA、线状DNA和开环质粒DNA。

2．细菌基因组DNA与质粒DNA分离注意事项

在加入细菌裂解液后，需要颠倒混匀，细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子。这时应当上下颠倒轻轻混匀，以避免产生小分子量的基因组DNA片断，最后污染提取的质粒DNA。

3．溴酚蓝指示剂

上样缓冲液中含有溴酚蓝（Bromophenol blue，别名四溴苯酚磺酞，最大吸收波长422nm），以0.25%溴酚蓝作为电泳指示剂。溴酚蓝结构式如右图，分子式C₁₉H₁₀Br₄O₅S，分子量669.96，氨基酸的平均分子量110 Da，每对核苷酸的平均分子量是659Da，电泳时溴酚蓝会跑在前面，在到达凝胶底部3/4位置时，即可停止电泳，进行结果观察。