实验8 质粒DNA的提取（碱裂解法）

一、实验目的

了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。

二、实验原理

碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.0~12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。

三、仪器设备

微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。

四、实验试剂

（1）溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。4 ℃贮存。

（2）溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。

（3）溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H₂O 28.5 mL。

（4）RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。

五、 实验方法

（1）分装3 mL LB液体培养基和3 μL氨苄青霉素（50 mg/mL）于15 mL玻璃试管中。

（2）用灭菌牙签挑取一白色单克隆，放入玻璃管内，置37 ℃恒温摇床中以200转/min培养，至OD₆₀₀=2.0。

（3）取菌液1.0 mL于1.5 mL的Eppendorf 管中，将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速3 500 g，离心5 min，收集细菌。弃上清，倒置于吸水纸上，沥干残液。

（4）每离心管中加入冰上预冷的溶液Ⅰ 200 µL，置振荡器上剧烈震荡，悬浮菌体。

（5）加入新配制的溶液Ⅱ 400 µL，翻转10次。冰上放置。

（6）冰浴3 min内迅速加入300 µL溶液Ⅲ，温和翻转10次，冰浴10 min。

（7）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心5 min。取上清液于新管中，同时加入Rnase（10 mg/mL）10 µL，混匀，37 ℃保温2 hr。

（8）加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），置摇床上震荡5 min，将离心管放入冷冻离心机，调温至4℃，转速12000 g，离心10min。

（9）取上清液于新的离心管内，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），摇床震荡5 min。

（10）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。取上清，加入等体积异丙醇，迅速翻转5次，冰上放置10 min。

（11）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，倒置于吸水纸上。加入500 μL 70 %的乙醇轻振，洗涤沉淀。

（12）将离心管放入冷冻离心机，调温至4 ℃，转速12 000 g，离心10 min。弃上清，室温干燥沉淀30 min。

（13）加入20 μL无菌水溶解DNA，电泳检测。

六、实验结果

七、提取质粒DNA过程中应该注意的问题

（1）细菌细胞的裂解是分离质粒DNA的关键步骤。通常可以加入溶菌酶或SDS促使大肠杆菌细胞裂解。如果细菌细胞没有完全裂解，会明显降低质粒DNA的回收率。理想的状况是每一个细菌细胞都能够被充分破裂使质粒DNA顺利溢出，而又没有污染过多的染色体分子。

（2）质粒提取过程中，除规定的实验条件外，应尽量保持低温，避免过酸过碱，操作过程中手法要温和，尽可能避免脱氧核糖核酸酶（DNase）对质粒DNA的降解和破坏。

（3）电泳时上样孔中如果有白色物质，是由于蛋白质没有去除干净。

（4）质粒共有三种构型：

共价闭合环形DNA（cccDNA）：质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；开环DNA（ocDNA）：质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一或数个缺口，即OC构型；线性分子（l DNA）：质粒DNA经过适当的核酸限制内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性DNA分子，通称L构型。相同分子质量质粒的三种构型在正常情况下电泳时，迁移速率分别是：超螺旋DNA比线性的DNA迁移率大，线性DNA比开环DNA迁移率大。

八、作业

（1）按要求认真撰写报告，包括实验目的、实验原理、实验用品及药品、实验步骤等，要详细阐述质粒提取的基本原理。

（2）提取质粒DNA过程中应该注意的问题是什么？

（3）质粒DNA的三种构型及在正常电泳条件下的迁移情况如何？

 

第二篇：高中生物必修二实验十一__DNA的粗提取与鉴定

实验十一 DNA的粗提取与鉴定

教学目的

1． 初步掌握DNA粗提取和鉴定的方法。

2． 观察提取出来的DNA物质。

实验原理

1． DNA在NaCl溶液中的溶解度是随NaCl的浓度变化而改变的。DNA在0．14mol/L的NaCl

溶液中的溶解度最低，据此可使溶解于NaCl溶液中的DNA析出。

2． DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA。

沸水浴3． DNA＋二苯胺????蓝色（用于DNA的鉴定）

实验步骤

1．材料制备

0.1G/ml柠檬酸钠

500ml烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min离心2min→吸去上清液→ 活鸡血 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯臵于冰箱中，静臵一天使鸡血

细胞自行沉淀）

2．方法步骤

取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌

（1纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质

原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加

速血细胞破裂

（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌

（3DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出

现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶

液相当于稀释到0．14mol/L）

（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上

（5）（纱布上的）DNAmol/LNaCl溶液烧杯，

上述粘稠物3 min

（6DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA

（7DNA：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃

棒将丝装物卷起。

（8）鉴定：

实验关键：

本实验成功的关键是获取较纯净的DNA，因此应注意：

1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用

玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA

2．沉淀DNA必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至

少存放24小时。

3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌

要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。在步骤（7），要将玻璃棒

插入烧杯溶液中间，用手缓慢转动5-10min。

【同类题库】

．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中分别使用2mol／L、0．14mol／L、2mol／L、0015mol／L的氯化钠溶液，其作用分别是（A）

A．溶解、析出、溶解、溶解 C．溶解、溶解、析出、溶解

B．析出、溶解、析出、溶解 D．溶解、析出、溶解、析出

．下列图示中能反映DNA溶解度与NaCI溶液浓度之间关系的是（C）

．DNA在下列哪种浓度的NaCl溶液中溶解度最低（B）

A．2．00mol/L B．0．14 mol/L C．0．015 mol/L D．0．10 mol/L

．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度和名称分别是（B）

①0．1 g/ml的柠檬酸钠溶液 ②2．00mol/L的NaCl溶液 ③0．14 mol/L的NaCl溶液 ④体积分数为95%的酒精溶液 ⑤0．015 mol/L的NaCl溶液 ⑥0．04 mol/L的NaCl溶液

A．①③⑤ B．③④ C．②④ D．②③④

．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（C）

A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度

B．在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整

C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出

D．当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度约为0.14mol/L.

．（多选）下列有关“DNA粗提取”的操作中，正确的是（ABCD）

A．在鸡血细胞液中加入蒸馏水

B．在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多

C．在用酒精凝集DNA时，要使用冷酒精

D．用玻璃棒搅拌时要沿一个方向

．“DNA的粗提取与鉴定实验”中有三次过滤：

（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液。

（2）过滤含粘稠物的0.14mol/L NaCl .

（3）过滤溶解有DNA的2mol/L NaCl.

以上三次过滤分别为了获得（A）

A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液

B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液

C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布中DNA

D．含较纯的DNA滤液、纱布上粘稠物、含DNA的滤液

．为获取较纯净的DNA，采集来的血样可用蛋白酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。下列有关叙述，正确的是（D）

A．除去血浆中的蛋白质 B．除去染色体上的蛋白质

C．除去血细胞表面的蛋白质 D．除去血细胞中所有的蛋白质

．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，和“使用蛋白酶从染色体中提取DNA”中的蛋白酶具有相似作用的物质是（D）

A．NaCl溶液 B．蒸馏水 C．柠檬酸钠 D．冷却的酒精 ．DNA不溶于下列何种溶液（D）

A．NaCl溶液 B．KCl溶液 C．MgCl溶液 D．酒精溶液 ．下列不同浓度的NaCl溶液中，使DNA析出最彻底和溶解度最高的是（A）

①0.14mol/L ②2mol/L ③0.25mol/L ④0.015 mol/L

A．①和② B．②和① C．②和③ D．②和④

．下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（B）

A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质

B．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动

C．在析出DNA粘稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多

D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却

E．在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌

．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中：

（1）实验中两次使用蒸馏水，第一次目的是 ， 第二次目的是 。

（2）说明不同浓度的NaCl溶液的作用：

2mol/L NaCl的作用 ；

0.14mol/L NaCl的作用 ；

0.015 mol/L NaCl的作用 ；

（3）提纯DNA的原理是 ，所用试剂为 。 搅拌要 ，目的 。

（4）能否用哺乳动物血液代替？简述理由。 。

[（1）使血细胞吸水破裂，溶解细胞核内的DNA；降低NaCl溶液的浓度，降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度析出DNA分子（2）溶解含DNA的核物质；使含DNA的丝状粘稠物析出DNA分子；进行DNA鉴定（3）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些盐类蛋白质可溶于酒精溶液；95%的冷却酒精；轻缓、同方向；保持DNA分子的完整性（4）不能，成熟的哺乳动物红细胞没有细胞核]

．此实验中有几次用玻璃棒搅拌，每次搅拌的方向是一致的；但每次搅拌的强度不同，请就此予以说明。

（1）提取鸡血细胞核内物质时，应 搅拌，目的是 。

（2）向含核物质的2mol/L NaCl 溶液滴加蒸馏水析出DNA粘稠物时，应 搅拌，目的是 。

（3）DNA粘稠物再溶解于2mol/L NaCl 溶液时，应 搅拌，目的是 。

（4）用95%的冷却酒精提取含杂质较少的DNA时，应 搅拌，目的是 。

[（1）快速；加速血细胞破裂（2）轻缓；尽量保持DNA分子的完整性（3）轻缓；尽量保持DNA分子的完整性（4）轻缓；保持DNA分子的完整性]

．以下是有关DNA的粗提取实验的阅读材料：

a．核酸极不稳定，在较为剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解。在制备DNA时要加入DNA酶（水解DNA的酶）的抑制剂柠檬酸钠，以除去Mg，防止DNA酶的激活。

b．核酸中的DNA和RNA在生物体内均以核蛋白（由核酸和蛋白质组成）的形式存在，DNA核蛋白在1 mol/L NaCl 溶液中溶解度很大，但在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白溶于0.14mol/L NaCl 溶液。

c．用苯酚处理，可使蛋白质变性，且留在苯酚层内；在DNA溶液中加入2．5倍体积，浓度

为95%的酒精，可将DNA分离出来。此时DNA十分粘稠，可用玻璃棒搅成团取出。

d．DNA在强酸性环境下，水解产生脱氧核糖等小分子物质，它与二苯胺酸性溶液反应，能生成蓝色化合物。

e．实验材料与器械：柠檬酸钠溶液、石英砂、0.14mol/L NaCl 溶液、1 mol/L NaCl 溶液、苯酚、95%的酒精、二苯胺试剂、浓硫酸、花椰菜、研钵、烧杯、漏斗、玻璃棒、量筒、石棉网、酒精灯、吸管、试管等。

以下是DNA粗提取实验的步骤，请根据以上阅读材料回答有关问题：

（1）研磨：取10克花椰菜加适量的 、 和石英砂，研磨成匀浆。

（2）过滤。

（3）将滤液稀释6倍，其目的是： 。

（4）离心处理，产生沉淀。

（5）取沉淀物，臵于2毫升1 mol/L NaCl 溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，再加2毫升苯酚充分震荡后静止，待其分层后弃其上层苯酚。这一步的目的是除去 。

（6）如何将剩余溶液中的DNA提取出来？ 。

（7）如何证明提取物质确实是DNA分子？ 。 其实验过程的要点是向放有DNA的试管中加入适量该试剂，混合均匀后，将试管臵于 中5min，待试管 后，观察试管中的颜色变化。这个实验也说明DNA耐 温，前次温度有利于 ，后次温度则有利于DNA 。

[（1）柠檬酸钠溶液、1 mol/L NaCl 溶液（3）使DNA核蛋白溶解度降低而析出（5）（DNA核蛋白中的）蛋白质（6）向下层溶液中加2．5倍体积，浓度为95%的酒精，此时用玻璃棒搅动，玻璃棒上成团的物质即是DNA（7）用适量浓硫酸处理提取物，再滴加二苯胺酸性溶液数滴，如有蓝色物质出现即可证明提取物为DNA。沸水浴；冷却；高；加快染色反应的速度；析出。]

．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。

(1) 。

(2)实验步骤(不包括实验材料)均正确，但得不到DNA的组别是 。

(3)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是，其原因是 。

(4)B组实验不成功的最主要原因是 。

[(1)C、D 人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，选用这些材料得不到DNA或得到的DNA很少 (2)C (3)A、E A 冷却的酒精对DNA的凝集效果较佳，该组使用的是25℃的酒精 (4)菜花细胞在蒸馏水中不能被破坏，得不到DNA(应采用研磨的方法)] ．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，有同学按书本知识和自己的思路，试做了如下实

验，请你判断实验结果。

(1)他把与柠檬酸钠混合的新鲜血液放在几层纱布上过滤，纱布上最主要的结构是 。

(2)他在含有DNA、RNA及蛋白质等的混合物中加入大量的物质的量浓度为2．0mol/L的氯化钠溶液后，通过搅拌后，放在几层纱布上过滤，他得到的滤液中一定含有实验目的中需要提取的成分是 。

(3)他在上述滤液中加入冷酒精(体积分数为95％)，并用玻璃棒向—个方向搅拌，溶液中的丝状物的主要成分是 。

(4)他把含有DNA、RNA、蛋白质与氯化钠的混合溶液稀释成物质的量浓度为0．14mol/L的氯化钠溶液后，放在几层纱布上过滤，他得到的滤液中含量最多的成分是 。

[血细胞 DNA DNA 水]

．请利用如下实验材料做相关实验，再选择其中的一种实验材料，设计一个实验，以展示你的科学素养和创新才能。

(1)如用上述材料做观察植物细胞的有丝分裂、叶绿体中色素的提取和分离、观察植物的向性运动等实验。你选择的最佳材料依次是(填图中序号即可) 。

(2)如用紫色洋葱表皮做完细胞的质壁分离及复原实验后，又用此装片观察细胞分裂，结果未观察到处于分裂期的细胞。请解释原因 。

(3)创新实验设计方案

实验课题：探究镍为植物生活所必需的矿质元素

材料用具：完全营养液甲、缺镍的完全营养液乙、适当的容器和固定材料、长势相似的玉米幼苗，含镍的无机盐。

方法步骤：

① ； ② ； ② 。 实验预期： 。 为进一步验证镍元素一定是必需元素．还应增加的实验步骤及结果是： 。

[（1）①⑤③（2）高度分化的细胞一般不能继续分裂（3）①取长势相似的等量玉米幼苗，编为甲、乙两组；②甲组用营养液甲培养，乙组用营养液乙培养，其余条件均相同且适宜；③定期观察并记录两组幼苗的生长情况。 实验预期：①若两组长势相似，则镍不是玉米生活所必需的营养元素；②若甲组生长正常，乙组生长不良，则镍是玉米生活所必需的营养元素。 在乙组缺镍的培养液中加入适量含镍的无机盐，若症状在不久后消失，则镍一定是玉米生活所必需的营养元素。]