羊水细胞培养染色体制备常规
一、羊膜腔穿刺的时间及方法:
1、羊膜腔穿刺的时间:最理想是在妊娠16~20周进行羊膜腔穿刺。
2、羊膜腔的穿刺方法:
1)B型起声定位穿刺点,预先确定胎盘和胎头部位,尽量避开胎盘附着处进针。
2)、嘱孕妇排尽尿,以使膀胱空虚。
3)、检查穿刺部位的皮肤有无疖肿、皮炎,感染等不适合穿刺的情况。
4)、仰卧手术台上,然后嘱病人翻身数次,以使羊膜腔内脱落的细胞悬浮。
5)、恢复仰卧位后,按常规消毒腹部皮肤,铺上消毒孔巾。
6)、穿刺针通过腹壁、子宫,进入羊膜腔的过程中,术者会体会到三种不同的弹性阻抗性。当估计穿刺针已进入羊膜腔后,轻轻抽出穿刺针针芯,接上无菌注射器。
7)、为了防止穿刺时注射器针头内混有母体细胞,可将先抽出的1~2ml羊水弃去,然后更换注射器再抽取羊水15~20ml,注入无菌、带盖的离心管内,供羊水细胞培养用。
8)、抽出羊水标本立即送至实验室进行培养。
二、羊水细胞培养:
1、 离心(1000~1500r/min)5分钟。
2、 无菌环境中,吸出上清液留作其它检验用。将剩下的0.5ml沉淀物轻轻打均。用无菌滴管吸取沉淀悬液,分别平铺于两个无菌羊水培养瓶内。
3、 吸取F10培养液2.1ml和小牛血清0.9ml于羊水培养瓶内,轻轻摇匀,塞紧瓶塞放入37°C培养箱内静置培养。
4、 换液,于培养6~7天,将羊水培养瓶置接种箱内,吸出(倒出)瓶内培养液,加入新鲜F10培养液2.1ml和小牛血清0.9ml,塞紧瓶塞。
5、 倒置显微镜下观察细胞生长情况。如已贴壁生长,以后每天置倒置显微镜下观察一次。
6、 当羊水瓶瓶壁布满圆形细胞或出现几个小岛布满许多圆形细胞。每个圆形细胞饱满,
边缘清晰,胞核清楚,内含丝状物。细胞肿胀似阿米巴原虫伸出的伪足,象要破裂似的。有的圆形细胞透亮,成双成对。此时羊水培养的细胞可以收获。一般9~12天可以收获。收获前视细胞生长情况更换新鲜培养液。
7、 于培养终止前4~6小时,每个培养瓶中加入秋水仙素,最终浓度为2~3ug/ml放入温箱继续培养。 三、制片:
1、 细胞收获:将培养液移至离心管内,加EDTA-胰酶消化液2ml,置37 C恒温箱中5分钟,用滴管吸打3~4次,然后把消化液移到离心管中,再用0.85% NaCl 冲冼培养瓶内残留细胞,合并到离心管中。
2、 离心(1000~1500r/min)6~7分钟,弃去上清液,留细胞沉淀0.2~0.3 ml加预温至370C低渗液(0.4%枸橼酸钠与0.4%KCI 1:1) 5滴以手指轻轻弹起或气泡冲匀加至5ml ,370C低渗5分钟。
3、 预固定,加固定液(甲醇:冰醋酸为3:1) 7滴,轻轻用气泡冲匀,离心(1000~1500r/min)5分钟。
4、 固定,弃去上清液,加固定液4ml 混匀,固定40分钟,离心弃去上清液;第二次固定,加固定液2ml,轻轻以气泡冲匀,固定20分钟。
5、 滴片,离心(1000~1500r/min)5分钟,弃去上清液,加新鲜固定液3~4滴,气泡冲匀,滴片3张。标本放600C烤箱,烤16~24小时,即可进行显带。
四、影响培养成功的关键问题:
1、培养基PH值以6.8~6.9为宜,PH值低于6.4或高于7.0,细胞不易贴壁生长。
2、小牛血清建议用混合小牛血清,应在零下20度低温保存。
3、培养过程必须严格遵守无菌操作规程,防止培养物被污染。
4、每一步操作都要轻,离心时间不能太长,速度不能太快。
5、直观羊水中混有血液的标本可提前一天换液。
五、禁忌症:
1、 孕周小于14周或大于24周的孕妇。
2、 有稽留流产或先兆流产未治愈的孕妇。
3、 有习惯性流产史孕妇的妊娠危险期。
4、 有盆腔或宫腔感染的孕妇。
5、 中央性前置胎盘或前置、低置胎盘有出血现象的孕妇。
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